Neurotrophic factors concentration in rat brain at the experimental coma

Full Text

Тяжёлые отравления веществами депримирующего действия характеризуются выраженным угнетением функций центральной нервной системы (ЦНС), что в свою очередь определяет развитие осложнений со стороны дыхания, кровообращения и других жизненно важных систем, а это находит своё отражение в высокой летальности при подобных интоксикациях. Основными осложнениями токсикогенной стадии острых отравлений веществами депримирующего действия бывают острая дыхательная недостаточность, экзотоксический шок, отёк головного мозга, миоренальный синдром, которые становятся причиной летального исхода в раннем периоде острых отравлений либо основой для развития осложнений, возникающих в соматогенной стадии. Наибольшую смертность отмечают при отравлениях алкоголем, она составляет до 50% в общей структуре летальных исходов при экзогенных интоксикациях, а при отравлении психоактивными веществами - до 18%. Депримирующие агенты следует рассматривать в качестве основного этиологического фактора острых отравлений, в том числе смертельных, что свидетельствует о необходимости совершенствования методов диагностики для профилактики угрожающих жизни осложнений. В ряде исследований отмечено, что поражение ЦНС нейротоксикантами сопровождается нарушениями систем жизнеобеспечения, связанными с доставкой и утилизацией кислорода, что приводит к развитию необратимых повреждений мозга [4]. Они являются не только следствием прямого влияния кислородного голодания на нейроны, возникающего в результате цитотоксического отёка мозга, но и результатом вторичного гипоксического воздействия, опосредованного экстрацеребральными расстройствами (нарушениями гемодинамики и газообмена, сдвигом кислотно-основного состояния в сторону ацидоза, изменениями реологических свойств крови, усилением процессов перекисного окисления липидов и др.) [2, 3]. Нарушения системной гемодинамики в свою очередь усиливают расстройства мозгового кровотока и микроциркуляции, нарушения нейромедиаторного обмена и приводят к усугублению нарушения биоэнергетики головного мозга [5]. Развивающаяся при коме гипоксия усиливает токсическое специфическое действие депримирующих веществ на ЦНС, так как в этих условиях начинает преобладать анаэробный путь метаболизма с накоплением в ликворе молочной кислоты и развитием ацидоза, который может приводить к нарушению структуры и функций головного мозга. Естественной защитной реакцией мозга в первые минуты ишемии служит синтез трофических факторов. При быстрой и активной экспрессии генов, кодирующих нейротрофины (факторы роста), ишемия мозга может длительно не приводить к инфарктным изменениям. В случае же ишемического повреждения высокий уровень трофических факторов обеспечивает регресс неврологического дефицита даже при сохранении вызвавшего его морфологического дефекта. Таким образом, изучение эндогенных нейропротекторов при действии депримирующих веществ актуально. Целью данного исследования было экспериментальное изучение изменения содержания нейротрофических факторов в зависимости от стадии интоксикации веществами депримирующего действия (этанолом или натрия оксибутиратом). Экспериментальные исследования выполнены на 60 белых беспородных крысах-самцах с массой тела 180-220 г из питомника Российской академии медицинских наук «Рапполово». Длительность карантина (акклиматизационного периода) для животных составляла 14 дней. В течение карантина проводили ежедневный осмотр каждого животного (поведение и общее состояние), 2 раза в день за животными наблюдали (заболеваемость и смертность). Содержание и использование животных в эксперименте проходили согласно нормам надлежащей лабораторной практики (GLP). В контрольной и каждой из экспериментальных групп были обследованы по 10 животных. Введение депримирующего агента (этанола или натрия оксибутирата) проводили внутрибрюшинно в полулетальной дозе за 3, 6, 12, 24 и 72 ч до взятия биологического материала. Для взятия материала для исследований от лабораторных животных производили декапитацию крыс и собирали кровь в гепаринизированные пробирки. Полученную кровь для выделения плазмы центрифугировали в течение 10 мин в центрифуге при 3000 оборотах в минуту и температуре +4 ºC. В плазме крови экспериментальных животных определяли концентрацию нейроноспецифической енолазы, белка S-100, нейротрофического фактора головного мозга (BDNF - от англ. brain-derived neurotrophic factor), пигментного фактора эпителиального происхождения, глиального фибриллярного кислого протеина с помощью иммуноферментного анализа с использованием коммерческой тест-системы производства фирмы «Cusabio» (Китай). Результаты исследований были обработаны при помощи пакета статистического анализа данных Statistica. Для исследования последствий введения натрия оксибутирата и этанола нами были использованы перечисленные выше нейроноспецифические и нейротрофические белки как маркёры ранней диагностики повреждения мозга, с помощью которых оценивали направленность изменений в ЦНС. BDNF стимулирует дифференциацию нейронов и поддерживает их выживание. BDNF экспрессируется в фибробластах, астроцитах, нейронах различного фенотипа и локализации, шванновских клетках (в районах повреждения) и, возможно, в клетках гладкой мускулатуры. Функциональная активность BDNF довольно велика. В период развития он участвует в дифференцировке нейронов, созревании, выживании и формировании синапсов. Во взрослом организме основная функция BDNF - нейропротекция, защита нейронов головного мозга от ишемических атак и мотонейронов от гибели, индуцируемой удалением аксонов. Пигментный фактор эпителиального происхождения - нейропротективный и нейротрофический фактор, который воздействует на различные типы нейронов. У крыс пигментный фактор эпителиального происхождения служит фактором выживаемости зернистых нейронов мозжечка, защищая их от апоптоза и нейротоксичности глутамата. Глиальный фибриллярный кислый протеин принадлежит к белкам цитоскелета. Это высоко специфичный белок мозга, который не обнаружен за пределами ЦНС. Благодаря высокой специфичности и раннему высвобождению из ЦНС после травматического повреждения мозга, глиальный фибриллярный кислый протеин является полезным маркёром для ранней диагностики нарушений функций мозга. Результаты исследований нейроспецифических белков у животных, перенёсших развитие комы при введении натрия оксибутирата, представлены в табл. 1. Таблица 1 Динамика содержания нейротрофических маркёров в плазме животных при введении натрия оксибутирата в полулетальной дозе Исследованные пара Контрольная Временной интервал после введения соединения, ч метры группа 3 6 12 24 72 NSE, нг/мл 1,19±0,08 1,16±0,11 1,21±0,21 1,24±0,16 1,19±0,13 1,25±0,17 S-100, нг/мл 1,53±0,20 1,55±0,15 3,25±0,23* 3,24±0,35* 3,29±0,35* 1,88±0,05 GFAP, нг/мл 0,14±0,06 0,17±0,09 0,21±0,11 0,16±0,07 0,14±0,09 0,16±0,07 BDNF, пг/мл 36,4±5,2 71,04±8,1* 66,54±3,9* 29,6±5,7 54±13,5 72,18±5,4* PEDF, нг/мл 0,32±0,06 0,30±0,05 0,32±0,05 0,28±0,05 0,31±0,06 0,31±0,05 Примечание: NSE - нейроноспецифическая енолаза; GFAP - глиальный фибриллярный кислый протеин; BDNF - нейротрофический фактор головного мозга; PEDF - пигментный фактор эпителиального происхожде ния; *p <0,05 по сравнению с контролем. Нейроноспецифическая енолаза - общий маркёр всех дифференцированных нейронов. Физиологически она в периферической крови присутствует лишь в ничтожном количестве. В настоящее время нейроноспецифическую енолазу считают чувствительным и количественным маркёром повреждения паренхимы мозга. Белок S-100 специфичен для астроцитарной глии, способен связывать кальций. Увеличение концентрации S-100(αb) и S-100(bb) в спинномозговой жидкости и плазме также считают маркёром повреждения головного мозга. При однократном воздействии натрия оксибутирата в полулетальной дозе клетки нервной системы подвергались некоторому повреждающему воздействию. В частности, через 6 ч после введения токсиканта концентрация белка S-100 достоверно увеличивалась по сравнению с контролем и далее держалась на высоком уровне вплоть до окончания первых суток действия препарата. Возможно, это было связано с тем, что кальций-связывающий белок S-100 изменяет проницаемость ионных каналов в пользу одновалентных катионов (Na+ и K+), тем самым Таблица 2 Динамика показателей содержания нейротрофических маркёров в плазме животных при введении этилового спирта в полулетальной дозе Параметры Контрольная группа Временной интервал после введения соединения, ч 3 6 12 24 72 NSE, нг/мл 1,21±0,05 1,26±0,12 1,27±0,21 1,34±0,26 1,24±0,18 1,26±0,17 S-100, нг/мл 1,22±0,13 2,26±0,21* 3,16±0,26* 3,26±0,15* 1,93±0,35 1,39±0,05 GFAP, нг/мл 0,11±0,04 0,32±0,05* 0,21±0,02* 0,17±0,03 0,19±0,06 0,15±0,02 BDNF, пг/мл 48,3±8,1 102,1±10,3* 73,4±13,8 117,4±20,6* 61,3±30,8 58,7±14,4 PEDF, нг/мл 0,29±0,06 0,31±0,05 0,31±0,05 0,29±0,051 0,30±0,06 0,28±0,05 Примечание: NSE - нейроноспецифическая енолаза; GFAP - глиальный фибриллярный кислый протеин; BDNF - нейротрофический фактор головного мозга; PEDF - пигментный фактор эпителиального происхождения; *p <0,05 по сравнению с контролем. давая возможность компенсировать действие активных форм кислорода на гомеостаз клетки. Однако отсутствие повышения уровня двух других высокоспецифичных маркёров повреждения ткани мозга (нейроноспецифической енолазы и глиального фибриллярного кислого протеина), а также «нормализация» содержания S-100 указывает на незначительное и обратимое повреждение нейронов. В пользу данного предположения свидетельствует и тот факт, что через 3 и 6 ч после введения препарата достоверно повышался уровень BDNF. Результаты исследований нейроспецифических белков у животных, перенёсших развитие комы при введении этилового спирта, представлены в табл. 2. При внутрибрюшинном введении крысам этанола в токсической дозе через 3 ч происходило достоверное увеличение концентрации белка S-100 более чем в 1,8 раза по сравнению с контролем. Максимальное увеличение содержания белка S-100 более чем в 2,6 раза было отмечено через 12 ч после введения токсиканта. Далее происходило снижение концентрации исследуемого маркёра, и через 72 ч его содержание в плазме крови практически не отличалось от контроля. Признаком выраженного поражения ткани головного мозга было повышение концентрации глиального фибриллярного кислого протеина. Через 3 ч после введения этанола содержание данного маркёра по сравнению с контролем было повышено в 2,9 раза, а через 6 ч - в 1,9 раза (р <0,05). Концентрация BDNF также возрастала в период с 3 до 12 ч после введения токсиканта, с 2,1 до 2,4 раза по сравнению со значениями у интактных животных. Концентрация пигментного фактора эпителиального происхождения не изменялась по сравнению с контролем на протяжении всего времени эксперимента. Появление в плазме крови нейроспецифических белков, безусловно, было результатом повреждения нейронов, которое происходило в результате действия ацетальдегида и активных форм кислорода, неизбежно образующихся в результате метаболизма этанола. Таким образом, однократное воздействие этилового спирта характеризовалось быстрым нарастанием уровня белка S-100, глиального фибриллярного кислого протеина и BDNF. Такое количественное изменение показателей в плазме крови удерживалось на протяжении половины суток, в период времени с 3 до 12 ч. Концентрация BDNF при 6-часовом исследовании следует расценить как тенденцию к повышению. В то же время выявленные эффекты однократного воздействия натрия оксибутирата в основном разворачивались в более поздние временные сроки, начиная с 12 ч наблюдения, и фиксировались ещё через сутки. Они заключались в нарастании уровня белка S-100 с 12 до 24 ч. Обнаружение повышенного уровня BDNF было связано с периодом 3-6-часового исследования. Выявленные различия заключались как в обнаружении активации тех или иных нейротрофических факторов, так и во временных интервалах манифестации. В то же время течение постинтоксикационного периода имело и общие черты, в обоих случаях не выявлено повышения в плазме крови нейроноспецифической енолазы и пигментного фактора эпителиального происхождения. Информативность такого показателя, как содержание в крови нейроноспецифической енолазы, высока и свидетельствует, по данным литературных источников, о выраженном поражении ЦНС при гипоксии, в то время как прогностическая ценность белка S-100 в исследованиях, связанных с нарушением когнитивных функций в послеоперационном периоде после анестезии, ставят под сомнение [8, 10]. В настоящем исследовании отмечено, что при действии обладающего ГАМК-эргической активностью натрия оксибутирата не наблюдалось синергизма уровня белка S-100 и глиального фибриллярного кислого протеина, в то время как высокие дозы этанола приводили к сочетанному увеличению этих показателей, что, вероятно, было признаком массивного поражения ткани ЦНС. Такое предположение согласуется с представлениями о высоком уровне корреляции между белком S-100 и глиальным фибриллярным кислым протеином при постишемическом повреждении ткани мозга [7]. Также известно, что BDNF модулирует постсинаптическое торможение ГАМК-эргической нейротрансмиссии. Баланс глутаматергической и ГАМК-эргической систем контролирует уровень экспрессии BDNF. Можно предположить, что временное повышение уровня BDNF в крови отражает реакцию на дисбаланс этой системы, вызываемой инъекцией натрия оксибутирата [1]. Известно, что естественной защитной реакцией мозга в первые минуты ишемии служит синтез трофических факторов и рецепторов к ним [9]. Показано, что внутрибрюшинное введение этанола мышам вызывает достоверную активацию матричной рибонуклеиновой кислоты для BDNF в таких структурах мозга, как гиппокамп и дорсальный стриатум. При этом в культуре нейронов гиппокампа крыс этанол усиливал экспрессию генов BDNF дозозависимо. Увеличение уровня BDNF в крови крыс в наших экспериментах, вероятно, может быть и следствием увеличения его синтеза в структурах мозга в ответ на введение высокотоксичной дозы этанола. ВЫВОДЫ Изучение нейротрофических факторов головного мозга в сыворотке крови показало, что неизбежное развитие гипоксии, сопровождающей коматозное состояние, приводит к повышению содержания в плазме белка S-100, нейротрофического фактора головного мозга и глиального фибриллярного кислого протеина. Повышение концентрации белка S-100 - маркёр повреждения головного мозга. Выяв ленное увеличение его содержания на ранней стадии эксперимента и восстановление до показателей нормы (контроля) через 24 ч свидетельствуют о прогностически благоприятном течении патологического процесса. Подтверждением незначительных патологических изменений в головном мозге может служить отсутствие значимых изменений со стороны нейроноспецифической енолазы. 3. Повышение концентрации глиального фибриллярного кислого протеина в опыте с этанолом может свидетельствовать о более тяжёлом поражении тканей головного мозга по сравнению с натрия оксибутиратом.

About the authors

V A Kashuro

Institute of Toxicology, Saint Petersburg, Russia

E G Batotsyrenova

Institute of Toxicology, Saint Petersburg, Russia

Email: BKATERINA2009@yandex.ru

N L Elaeva

Institute of Toxicology, Saint Petersburg, Russia

U N Savenko

Pavlov Institute of Physiology, Saint Petersburg, Russia

N V Lapina

Institute of Toxicology, Saint Petersburg, Russia

V V Aksyonov

Military Medical Academy, Saint Petersburg, Russia

References

Supplementary files