Antiaggregatory activity of new 1-ethylxanthine cyclohexylammonium salt in vitro

Cover Page

Abstract

Aim. To study the biochemical effect on hemostasis of a new cyclohexilammonium salt of 2-[1-ethyl-3-methyl-7(dioxotiethanyl-3)xantinyl-8-thio]acetic acid in vitro. Methods. Thromboelastography was performed using the citrate blood samples of healthy male donors. Global hemostatic effect, fibrinogen and platelet function, fibrinolysis and clot strength, and stability were analyzed at thromboelastography. The impact of firstly synthesized xantine derivative and pentoxifylline on the functional activity of platelets in vitro was studied using a laser analyzer of platelet aggregation. Adenosine diphosphate, collagen, epinephrine and ristocetin induced clotting were registered. General clotting characteristics, maximal aggregation values, maximal aggregation speed, mean platelet aggregate size, activity of platelet-derived factor 3, level of platelet-derived factor 4 were measured. Release of platelet-derived factors 3 and 4 at platelet aggregation were assessed after adenosinediphosphate-induced aggregation and centrifugation. Results. Cyclohexylammonium salt of 2-[1-ethyl-3-methyl-7-(dioxotiethanyl-3)xantinyl-8-thio]acetic acid in vitro showed antiaggregatory activity that exceeds such of pentoxifylline. It has been revealed that the second platelet aggregation wave, that is induced by small dose of adenosinediphosphate, is absent in the presence of the new cyclohexylammonium salt, lag-period in collagen-induced platelet aggregation elongates, and availability and release of platelet-derived factors 3 and 4 decreases. Conclusion. The research findings show potentially high antiaggregatory activity of 2-[1-ethyl-3-methyl-7-(dioxotiethanyl-3)xantinyl-8-thio]acetic acid cyclohexylammonium salt as an inhibitor of platelet release reaction.

Full Text

Результаты предыдущих собственных иссле Экспериментальная работа в условиях in vitro дований демонстрируют потенциально высокую выполнена на крови здоровых доноров-мужчин в биологическую активность новых производных возрасте 18-24 лет. Забор крови проводили из куби1-этилксантина в отношении системы гемостаза. тальной вены с использованием систем вакуумноНайдены соединения, проявляющие антиагрегаци го забора крови «BD Vacutainer®» («Dickinson and онную активность, превосходящую показатели ряда Company», США). В качестве стабилизатора венозприменяемых в клинической практике антиагре ной крови использовали 3,8% раствор натрия цитрагантов [2]. Данное исследование является продолже та в соотношении 9:1 [4]. нием поиска потенциальных антиагрегантов среди Все тесты проводили на обогащённой и обедпроизводных данного класса и посвящено опреде нённой тромбоцитами плазме. Образцы богатой лению биохимического механизма антиагрегаци тромбоцитами плазмы получали центрифугионной активности циклогексиламмониевой соли рованием цитратной крови при 100 g в течение 2-[3-метил-7-(диоксотиетанил-3)-1-этил-ксантинил 10 мин, бестромбоцитарной плазмы - при 300 g в 8-тио]уксусной кислоты (соединение I) в условиях течение 15 мин. В работе использовали центрифугу эксперимента [3]. «ОПН-3.02» (Россия). Тромбоэластографию проводили на аппарате Адрес для переписки: avsamorodov@gmail.com. «TEG 5000» («Haemoscope Corporation», США) на образцах цитратной крови. При анализе тромбоэластограмм определяли общую тенденцию коагуляции (индекс тромбодинамического потенциала, время формирования сгустка до максимальной прочности), функциональную активность тромбоцитов и фибриногена (наибольшее расхождение ветвей тромбоэластограммы, угловая константа), активность фибринолиза (индекс лизиса сгустка цельной крови, показатель фибринолиза в течение 30 мин, время лизиса сгустка) и физико-механические свойства образовавшихся сгустков (фактическая мера прочности сгустка, изменение модуля силы упругости) [6]. Исследование влияния соединения I и пентоксифиллина на агрегацию тромбоцитов в условиях in vitro на донорской крови человека осуществляли с помощью лазерного анализатора агрегации тромбоцитов «Биола 230 LA» (Москва). Интенсивность агрегации оценивали по динамике изменения светопропускания плазмы при добавлении к ней индукторов агрегации по методу G. Born и по динаказателей каолинового времени рекальцификации обогащённой и бестромбоцитарной плазмы характеризует активность фактора P3 в плазме. Высвобождение фактора P3 в процессе агрегации тромбоцитов оценивали тем же методом после проведения агрегации АДФ и центрифугирования [1]. Определение фактора 4 тромбоцитов (P4) осуществляли по действию прогретой бедной тромбоцитами плазмы на тромбин-гепариновое время свёртывания методом Л.А. Матвиенко и М.А. Котовщикой. Высвобождение фактора P4 в процессе агрегации тромбоцитов оценивали тем же методом после проведения агрегации АДФ и центрифугирования [1]. Результаты исследования обработаны с применением статистического пакета Statistica 8,0 («StatSoft Inc», США). Проверку на нормальность распределения фактических данных выполняли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Для описания групп использованы медиана и межквартильный интервал. Дисперсионный анализ проводили с помощью критерия Краскела-Уоллиса. Критический Таблица 1 Показатели тромбоэластографии пентоксифиллина и соединения I на цитратной крови Показатель Контроль Пентоксифиллин p1 Соединение I p2 p3 SP, мин 8,7 (5,7-9,6) 8,4 (7,5-9,3) 0,8 13,6 (11,1-15,2) 0,003 0,005 Angle, градус 44,7 (39,8-52,4) 43,9 (40,9-47,8) 0,8 47,4 (43,6-49) 0,6 0,8 MA, мм 57,3 (51,2-63,2) 42,7 (41,6-44,3) 0,0002 26,8 (23,6-28,4) 0,00001 0,001 G, дин/см2 6,7 (4,5-8,1) 4,8 (3,9-5,4) 0,04 2,9 (2,3-3,4) 0,0007 0,03 E, дин/см2 148,9 (134,4-64,8) 127,1 (120,9-131,6) 0,02 79,4 (77,4-83,2) 0,0001 0,0005 TPI, в секунду 11,7 (8,5-14,6) 7,9 (6,2-8,3) 0,03 5,7 (4,9-6,3) 0,000002 0,1 TMA, мин 27,1 (22,3-32,1) 31,9 (29,8-33,1) 0,001 42,6 (41,2-44,7) 0,0001 0,0004 CLT, мин 38,7 (35,4-42,4) 36,2 (31,2-38,7) 0,6 37,4 (35,7-37,8) 0,7 0,6 LY30, % 3,7 (3,1-4,8) 3,1 (2,7-3,3) 0,9 3,3 (3,1-3,9) 0,8 0,3 CL30, % 96,6 (89,6-101,3) 96,8 (94,2-99,1) 0,4 96,7 (93,4-99,8) 0,2 0,6 Примечание. Представлены медиана и межквартильный интервал, n=7. Уровень статистической значимости различий: p- группы пентоксифиллина в сравнении с контролем, p- группы соединения I в сравнении с контролем, p- груп 12 3 пы, пентоксифиллина в сравнении с группой соединения I. SP - скорость образования тромбопластина; Angle - угловая константа, то есть угол, построенный по касательной к тромбоэластограмме из точки начала образования сгустка; MA - наибольшее расхождение ветвей тромбоэластограммы; G - изменение модуля силы упругости; E - фактическая мера прочности сгустка; TPI - индекс тромбодинамического потенциала; TMA - время формирования сгустка до максимальной прочности; CLT - время лизиса сгустка; LY30 - показатель фибринолиза в течение 30 мин; CL30 - индекс лизиса сгустка цельной крови. мике изменения размеров образующихся агрегатов [5, 7]. В качестве индуктора агрегации использовали аденозиндифосфат (АДФ) в концентрации 20 и 5 мкг/мл, коллаген в концентрации 5 мг/мл, эпинефрин (адреналин) в концентрации 5 мкг/мл и ристомицин в концентрации 10 мг/мл производства «Технология-Стандарт» (Россия, Барнаул). Анализ агрегатограмм проводили с использованием программного обеспечения AGGR с учётом следующих показателей: общий характер агрегации (одноволновая, двухволновая; полная, неполная обратимая, необратимая), значения максимальной агрегации, максимальной скорости агрегации (tg α), средний размер тромбоцитарных агрегатов в относительных единицах. Определение активности фактора 3 тромбоцитов (P3) проводили по методу V. Rabiner. Разница поуровень значимости р для статистических критериев принимали равным 0,05. Результаты исследования влияния соединения I и пентоксифиллина на систему гемостаза методом тромбоэластографии представлены в табл. 1. Из данных табл. 1 видно, что показатель максимальной агрегации, характеризующий функциональную активность тромбоцитов, в группе соединения I в 2,1 и 1,6 раза меньше, чем в группах контроля и пентоксифиллина соответственно. Показатели прочности сгустка (изменение модуля силы упругости и фактическая мера прочности сгустка) снижены в группе соединения I в 1,5 раза и 1,6 раза в сравнении с пентоксифиллином. На показатели активности плазменного звена гемостаза и фибринолиза действие соединения I и пентоксифиллина не регистрировалось. Таблица 2 Показатели антиагрегационной активности пентоксифиллина и соединения I при индуктор-индуцированной агрегации тромбоцитов Подавление агрегации тромбоцитов, % к контролю Вещество Соединение I Пентоксифиллин Концентрация, М/л 4×10-3 2×10-3 10-3 4×10-3 2×10-3 10-3 АДФ, 20 мкг/мл 100,0 (100,0-100,0), p1 <0,0001, p2 <0,001 80,7 (36,2-100,0), p1=0,002, p2=0,0001 29,8 (25,6-31,2), p1=0,0003, p2<0,001 63,7 (58,9-9,2), p1 <0,0001 48,4 (42,7-56,5), p1 <0,00005 12,7 (10,5-15,6), p1 <0,006 Вторая волна агрегации тромбоцитов при действии АДФ, 5 мкг/мл - - - + + + Коллаген, 5 мг/мл 100,0 (100,0-100,0), p1 <0,00001, p2 <0,00001 100,0 (100,0-100,0), p1 <0,00001, p2 <0,00001 20,4 (16,7-24,1), p1=0,001, p2=0,0007 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0) Эпинефрин (адреналин), 5 мкг/мл 30,8 (27,4-33,5), p1 <0,001, p2 <0,0001 23,7 (19,6-26,5), p1 <0,0001, p2 <0,0001 12,1 (9,8-14,5), p1=0,002, p2=0,003 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0) Ристомицин, 10 мг/мл 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0) Примечание. Представлены медиана и межквартильный интервал, n=7. АДФ - аденозиндифосфат; p1 - уровень статистической значимости различий признаков в сравнении с контрольной группой; p2 - уровень статистической значимости различий признаков групп пентоксифиллина и соединения I. Таблица 3 Влияние пентоксифиллина и соединения I в концентрации 2×10-3 М/л на показатели реакции высвобождения тромбоцитов Показатель Контроль Пентоксифиллин p Соединение I p Тромбоцитарный фактор 3, % 81,7 (77,4-86,2) 79,8 (76,4-83,5) p1=0,3 67,9 (64,5-73,2) p1=0,004, p2=0,005 Тромбоцитарный фактор 3 после АДФ, % 91,7 (87,3-96,2), p3=0,01 87,8 (83,5-92,3) p3=0,02 p1=0,4 68,1 (65,4-70,2) p3=0,3 p1=0,001, p2=0,002 Тромбоцитарный фактор 4, с 3,2 (2,9-3,1) 3,6 (2,8-3,9) p1=0,7 1,7 (1,1-2,4) p1=0,0002, p2=0,0001 Тромбоцитарный фактор 4 после АДФ, с 2,4 (2,2-3,4), p3=0,06 2,6 (2,3-3,1), p3=0,07 p1=0,7 1,6 (1,1-2,0), p3=0,4 p1=0,01, p2=0,002 Lag-период при коллагениндуцированной агрегации тромбоцитов, с 61,3 (59,7-64,1) 62,8 (61,4-66,7) 0,3 86,3 (77,4-91,5) p1 <0,01, p2 <0,001 Примечание. Представлены медиана и межквартильный интервал, n=7; p1 - уровень статистической значимости различий признаков в сравнении с контрольной группой; p2 - уровень статистической значимости различий признаков групп пентоксифиллина и соединения I, p- уровень статистической значимости различий признаков групп при действии аденозиндифосфата (АДФ). 3 Результаты исследования влияния соединения I и пентоксифиллина на индуктор-индуцировнную агрегацию тромбоцитов представлены в табл. 2. Установлено, что соединение I превосходит препарат сравнения (пентоксифиллин) как по уровню, так и по спектру антиагрегационной активности. При этом в присутствии соединения I в концентрации 4×10-3 М/л полностью подавляется агрегация тромбоцитов, индуцированная АДФ. В концентрациях 2×10-3 и 10-3 М/л отсутствует вторая волна агрегации тромбоцитов. При коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов, регистрируемой в присутствии соединения I (табл. 3), отмечено выраженное удлинение lag-фазы. В присутствии пентоксифиллина эффект удлинения lag-фазы не зарегистрирован. Следующим этапом определили активность факторов P3 и P4 в присутствии соединения I и препарата сравнения - пентоксифиллина (см. табл. 3). Из данных табл. 3 видно, что в присутствии пентоксифиллина в концентрации 2×10-3 М/л показатели активности P3 и P4 тромбоцитов остаются на уровне контрольных значений. Полученные экспериментальные данные полностью соотносятся с механизмом действия и биологической активностью 2. Камилов Ф.Х., Тимирханова Г.А., Самородопентоксифиллина. В присутствии соединения I ва А.И. и др. Поиск активных соединений среди производных 2-[3-метил-1-этил-7-(диоксотиетанил-3) активность тромбоцитарных факторов P3 и P4 стаксантинил-8-тио]уксусной кислоты, влияющих на си тистически значимо снижается. При действии аго стему гемостаза // Фундаментал. исслед. - 2011. - Т. 9, ниста агрегации тромбоцитов АДФ активность Р3 и №2. - С. 254-256. Р4 остаётся на уровне исходных значений. Это сви 3. Камилов Ф.Х., Тимирханова Г.А., Самородов А.В. и детельствует о нарушении доступности (высвобожде др. Поиск активных соединений среди производных ния) P3 и P4 в процессе агрегации тромбоцитов. азотсодержащих гетероциклов, влияющих на систему Таким образом, установлены отсутствие второй гемостаза // Фундаментал. исслед. - 2011. - №3. - волны агрегации тромбоцитов, индуцированной С. 61-66. малыми дозами АДФ, удлинение lag-периода при 4. Руководство по экспериментальному (докли коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов, ническому) изучению новых фармакологических веа также снижение доступности и высвобождения ществ / Под общ. ред. Р.У. Хабриева. - М.: Медицина, P3 и P4. 2005. - 327 с. ВЫВОД 5. Воrn G.V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal // Nature. - Результаты проведённых исследований свиде-1962. - Vоl. 194. - Р. 927-929. тельствуют о действии соединения I как потенци-6. Cotton B.A., Faz G., Hatch Q.M. Rapid ального ингибитора реакции высвобождения тром-thrombelastography delivers real-time results that predict боцитов. transfusion within 1 hour of admission // J. Trauma. - 2011. - Vol. 71, N 2. - P. 407-414. 7. Gabbasov Z.A. The use of optical density ЛИТЕРАТУРА fluctuations for determination of platelet concentration in stirred suspension // Platelets. - 1992. - Vol. 3. - 1. Иванов Е.П. Диагностика нарушений гемостаза. - Минск: Беларусь, 1983. - 267 с. P. 281-282.
×

About the authors

F Kh Kamilov

Bashkir State Medical University, Ufa, Russia

G A Timirkhanova

Bashkir State Medical University, Ufa, Russia

A I Samorodova

Bashkir State Medical University, Ufa, Russia

A V Samorodov

Bashkir State Medical University, Ufa, Russia

Email: avsamorodov@gmail.com

F A Khaliullin

Bashkir State Medical University, Ufa, Russia

D Z Murataev

Bashkir State Medical University, Ufa, Russia

References

  1. Иванов Е.П. Диагностика нарушений гемостаза. - Минск: Беларусь, 1983. - 267 с.
  2. Камилов Ф.Х., Тимирханова Г.А., Самородова А.И. и др. Поиск активных соединений среди производных 2-[3-метил-1-этил-7-(диоксотиетанил-3) ксантинил-8-тио]уксусной кислоты, влияющих на систему гемостаза // Фундаментал. исслед. - 2011. - Т. 9, №2. - С. 254-256.
  3. Камилов Ф.Х., Тимирханова Г.А., Самородов А.В. и др. Поиск активных соединений среди производных азотсодержащих гетероциклов, влияющих на систему гемостаза // Фундаментал. исслед. - 2011. - №3. - С. 61-66.
  4. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общ. ред. Р.У. Хабриева. - М.: Медицина, 2005. - 327 с.
  5. Воrn G.V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal // Nature. - 1962. - Vоl. 194. - Р. 927-929.
  6. Cotton B.A., Faz G., Hatch Q.M. Rapid thrombelastography delivers real-time results that predict transfusion within 1 hour of admission // J. Trauma. - 2011. - Vol. 71,N 2. - P. 407-414.
  7. Gabbasov Z.A. The use of optical density fluctuations for determination of platelet concentration in stirred suspension // Platelets. - 1992. - Vol. 3. - P. 281-282.

Statistics

Views

Abstract: 313

PDF (Russian): 226

Cited-by

CrossRef: 1

  1. Panova IG, Spiridonov VV, Kaplan IB, Trubinov SS, Elizova NV, Melnichenko AA, et al. Inhibitory effect of polyethylene oxide and polypropylene oxide triblock copolymers on aggregation and fusion of atherogenic low density lipoproteins. Biochemistry (Moscow). 2015;80(8):1057. doi: 10.1134/S0006297915080118

Dimensions

Article Metrics

Metrics Loading ...

PlumX


© 2013 Kamilov F.K., Timirkhanova G.A., Samorodova A.I., Samorodov A.V., Khaliullin F.A., Murataev D.Z.

Creative Commons License

This work is licensed
under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.





This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies