Antiaggregatory activity of new 1-ethylxanthine cyclohexylammonium salt in vitro

Full Text

Результаты предыдущих собственных иссле Экспериментальная работа в условиях in vitro дований демонстрируют потенциально высокую выполнена на крови здоровых доноров-мужчин в биологическую активность новых производных возрасте 18-24 лет. Забор крови проводили из куби1-этилксантина в отношении системы гемостаза. тальной вены с использованием систем вакуумноНайдены соединения, проявляющие антиагрегаци го забора крови «BD Vacutainer®» («Dickinson and онную активность, превосходящую показатели ряда Company», США). В качестве стабилизатора венозприменяемых в клинической практике антиагре ной крови использовали 3,8% раствор натрия цитрагантов [2]. Данное исследование является продолже та в соотношении 9:1 [4]. нием поиска потенциальных антиагрегантов среди Все тесты проводили на обогащённой и обедпроизводных данного класса и посвящено опреде нённой тромбоцитами плазме. Образцы богатой лению биохимического механизма антиагрегаци тромбоцитами плазмы получали центрифугионной активности циклогексиламмониевой соли рованием цитратной крови при 100 g в течение 2-[3-метил-7-(диоксотиетанил-3)-1-этил-ксантинил 10 мин, бестромбоцитарной плазмы - при 300 g в 8-тио]уксусной кислоты (соединение I) в условиях течение 15 мин. В работе использовали центрифугу эксперимента [3]. «ОПН-3.02» (Россия). Тромбоэластографию проводили на аппарате Адрес для переписки: avsamorodov@gmail.com. «TEG 5000» («Haemoscope Corporation», США) на образцах цитратной крови. При анализе тромбоэластограмм определяли общую тенденцию коагуляции (индекс тромбодинамического потенциала, время формирования сгустка до максимальной прочности), функциональную активность тромбоцитов и фибриногена (наибольшее расхождение ветвей тромбоэластограммы, угловая константа), активность фибринолиза (индекс лизиса сгустка цельной крови, показатель фибринолиза в течение 30 мин, время лизиса сгустка) и физико-механические свойства образовавшихся сгустков (фактическая мера прочности сгустка, изменение модуля силы упругости) [6]. Исследование влияния соединения I и пентоксифиллина на агрегацию тромбоцитов в условиях in vitro на донорской крови человека осуществляли с помощью лазерного анализатора агрегации тромбоцитов «Биола 230 LA» (Москва). Интенсивность агрегации оценивали по динамике изменения светопропускания плазмы при добавлении к ней индукторов агрегации по методу G. Born и по динаказателей каолинового времени рекальцификации обогащённой и бестромбоцитарной плазмы характеризует активность фактора P3 в плазме. Высвобождение фактора P3 в процессе агрегации тромбоцитов оценивали тем же методом после проведения агрегации АДФ и центрифугирования [1]. Определение фактора 4 тромбоцитов (P4) осуществляли по действию прогретой бедной тромбоцитами плазмы на тромбин-гепариновое время свёртывания методом Л.А. Матвиенко и М.А. Котовщикой. Высвобождение фактора P4 в процессе агрегации тромбоцитов оценивали тем же методом после проведения агрегации АДФ и центрифугирования [1]. Результаты исследования обработаны с применением статистического пакета Statistica 8,0 («StatSoft Inc», США). Проверку на нормальность распределения фактических данных выполняли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Для описания групп использованы медиана и межквартильный интервал. Дисперсионный анализ проводили с помощью критерия Краскела-Уоллиса. Критический Таблица 1 Показатели тромбоэластографии пентоксифиллина и соединения I на цитратной крови Показатель Контроль Пентоксифиллин p1 Соединение I p2 p3 SP, мин 8,7 (5,7-9,6) 8,4 (7,5-9,3) 0,8 13,6 (11,1-15,2) 0,003 0,005 Angle, градус 44,7 (39,8-52,4) 43,9 (40,9-47,8) 0,8 47,4 (43,6-49) 0,6 0,8 MA, мм 57,3 (51,2-63,2) 42,7 (41,6-44,3) 0,0002 26,8 (23,6-28,4) 0,00001 0,001 G, дин/см2 6,7 (4,5-8,1) 4,8 (3,9-5,4) 0,04 2,9 (2,3-3,4) 0,0007 0,03 E, дин/см2 148,9 (134,4-64,8) 127,1 (120,9-131,6) 0,02 79,4 (77,4-83,2) 0,0001 0,0005 TPI, в секунду 11,7 (8,5-14,6) 7,9 (6,2-8,3) 0,03 5,7 (4,9-6,3) 0,000002 0,1 TMA, мин 27,1 (22,3-32,1) 31,9 (29,8-33,1) 0,001 42,6 (41,2-44,7) 0,0001 0,0004 CLT, мин 38,7 (35,4-42,4) 36,2 (31,2-38,7) 0,6 37,4 (35,7-37,8) 0,7 0,6 LY30, % 3,7 (3,1-4,8) 3,1 (2,7-3,3) 0,9 3,3 (3,1-3,9) 0,8 0,3 CL30, % 96,6 (89,6-101,3) 96,8 (94,2-99,1) 0,4 96,7 (93,4-99,8) 0,2 0,6 Примечание. Представлены медиана и межквартильный интервал, n=7. Уровень статистической значимости различий: p- группы пентоксифиллина в сравнении с контролем, p- группы соединения I в сравнении с контролем, p- груп 12 3 пы, пентоксифиллина в сравнении с группой соединения I. SP - скорость образования тромбопластина; Angle - угловая константа, то есть угол, построенный по касательной к тромбоэластограмме из точки начала образования сгустка; MA - наибольшее расхождение ветвей тромбоэластограммы; G - изменение модуля силы упругости; E - фактическая мера прочности сгустка; TPI - индекс тромбодинамического потенциала; TMA - время формирования сгустка до максимальной прочности; CLT - время лизиса сгустка; LY30 - показатель фибринолиза в течение 30 мин; CL30 - индекс лизиса сгустка цельной крови. мике изменения размеров образующихся агрегатов [5, 7]. В качестве индуктора агрегации использовали аденозиндифосфат (АДФ) в концентрации 20 и 5 мкг/мл, коллаген в концентрации 5 мг/мл, эпинефрин (адреналин) в концентрации 5 мкг/мл и ристомицин в концентрации 10 мг/мл производства «Технология-Стандарт» (Россия, Барнаул). Анализ агрегатограмм проводили с использованием программного обеспечения AGGR с учётом следующих показателей: общий характер агрегации (одноволновая, двухволновая; полная, неполная обратимая, необратимая), значения максимальной агрегации, максимальной скорости агрегации (tg α), средний размер тромбоцитарных агрегатов в относительных единицах. Определение активности фактора 3 тромбоцитов (P3) проводили по методу V. Rabiner. Разница поуровень значимости р для статистических критериев принимали равным 0,05. Результаты исследования влияния соединения I и пентоксифиллина на систему гемостаза методом тромбоэластографии представлены в табл. 1. Из данных табл. 1 видно, что показатель максимальной агрегации, характеризующий функциональную активность тромбоцитов, в группе соединения I в 2,1 и 1,6 раза меньше, чем в группах контроля и пентоксифиллина соответственно. Показатели прочности сгустка (изменение модуля силы упругости и фактическая мера прочности сгустка) снижены в группе соединения I в 1,5 раза и 1,6 раза в сравнении с пентоксифиллином. На показатели активности плазменного звена гемостаза и фибринолиза действие соединения I и пентоксифиллина не регистрировалось. Таблица 2 Показатели антиагрегационной активности пентоксифиллина и соединения I при индуктор-индуцированной агрегации тромбоцитов Подавление агрегации тромбоцитов, % к контролю Вещество Соединение I Пентоксифиллин Концентрация, М/л 4×10-3 2×10-3 10-3 4×10-3 2×10-3 10-3 АДФ, 20 мкг/мл 100,0 (100,0-100,0), p1 <0,0001, p2 <0,001 80,7 (36,2-100,0), p1=0,002, p2=0,0001 29,8 (25,6-31,2), p1=0,0003, p2<0,001 63,7 (58,9-9,2), p1 <0,0001 48,4 (42,7-56,5), p1 <0,00005 12,7 (10,5-15,6), p1 <0,006 Вторая волна агрегации тромбоцитов при действии АДФ, 5 мкг/мл - - - + + + Коллаген, 5 мг/мл 100,0 (100,0-100,0), p1 <0,00001, p2 <0,00001 100,0 (100,0-100,0), p1 <0,00001, p2 <0,00001 20,4 (16,7-24,1), p1=0,001, p2=0,0007 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0) Эпинефрин (адреналин), 5 мкг/мл 30,8 (27,4-33,5), p1 <0,001, p2 <0,0001 23,7 (19,6-26,5), p1 <0,0001, p2 <0,0001 12,1 (9,8-14,5), p1=0,002, p2=0,003 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0) Ристомицин, 10 мг/мл 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0) Примечание. Представлены медиана и межквартильный интервал, n=7. АДФ - аденозиндифосфат; p1 - уровень статистической значимости различий признаков в сравнении с контрольной группой; p2 - уровень статистической значимости различий признаков групп пентоксифиллина и соединения I. Таблица 3 Влияние пентоксифиллина и соединения I в концентрации 2×10-3 М/л на показатели реакции высвобождения тромбоцитов Показатель Контроль Пентоксифиллин p Соединение I p Тромбоцитарный фактор 3, % 81,7 (77,4-86,2) 79,8 (76,4-83,5) p1=0,3 67,9 (64,5-73,2) p1=0,004, p2=0,005 Тромбоцитарный фактор 3 после АДФ, % 91,7 (87,3-96,2), p3=0,01 87,8 (83,5-92,3) p3=0,02 p1=0,4 68,1 (65,4-70,2) p3=0,3 p1=0,001, p2=0,002 Тромбоцитарный фактор 4, с 3,2 (2,9-3,1) 3,6 (2,8-3,9) p1=0,7 1,7 (1,1-2,4) p1=0,0002, p2=0,0001 Тромбоцитарный фактор 4 после АДФ, с 2,4 (2,2-3,4), p3=0,06 2,6 (2,3-3,1), p3=0,07 p1=0,7 1,6 (1,1-2,0), p3=0,4 p1=0,01, p2=0,002 Lag-период при коллагениндуцированной агрегации тромбоцитов, с 61,3 (59,7-64,1) 62,8 (61,4-66,7) 0,3 86,3 (77,4-91,5) p1 <0,01, p2 <0,001 Примечание. Представлены медиана и межквартильный интервал, n=7; p1 - уровень статистической значимости различий признаков в сравнении с контрольной группой; p2 - уровень статистической значимости различий признаков групп пентоксифиллина и соединения I, p- уровень статистической значимости различий признаков групп при действии аденозиндифосфата (АДФ). 3 Результаты исследования влияния соединения I и пентоксифиллина на индуктор-индуцировнную агрегацию тромбоцитов представлены в табл. 2. Установлено, что соединение I превосходит препарат сравнения (пентоксифиллин) как по уровню, так и по спектру антиагрегационной активности. При этом в присутствии соединения I в концентрации 4×10-3 М/л полностью подавляется агрегация тромбоцитов, индуцированная АДФ. В концентрациях 2×10-3 и 10-3 М/л отсутствует вторая волна агрегации тромбоцитов. При коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов, регистрируемой в присутствии соединения I (табл. 3), отмечено выраженное удлинение lag-фазы. В присутствии пентоксифиллина эффект удлинения lag-фазы не зарегистрирован. Следующим этапом определили активность факторов P3 и P4 в присутствии соединения I и препарата сравнения - пентоксифиллина (см. табл. 3). Из данных табл. 3 видно, что в присутствии пентоксифиллина в концентрации 2×10-3 М/л показатели активности P3 и P4 тромбоцитов остаются на уровне контрольных значений. Полученные экспериментальные данные полностью соотносятся с механизмом действия и биологической активностью 2. Камилов Ф.Х., Тимирханова Г.А., Самородопентоксифиллина. В присутствии соединения I ва А.И. и др. Поиск активных соединений среди производных 2-[3-метил-1-этил-7-(диоксотиетанил-3) активность тромбоцитарных факторов P3 и P4 стаксантинил-8-тио]уксусной кислоты, влияющих на си тистически значимо снижается. При действии аго стему гемостаза // Фундаментал. исслед. - 2011. - Т. 9, ниста агрегации тромбоцитов АДФ активность Р3 и №2. - С. 254-256. Р4 остаётся на уровне исходных значений. Это сви 3. Камилов Ф.Х., Тимирханова Г.А., Самородов А.В. и детельствует о нарушении доступности (высвобожде др. Поиск активных соединений среди производных ния) P3 и P4 в процессе агрегации тромбоцитов. азотсодержащих гетероциклов, влияющих на систему Таким образом, установлены отсутствие второй гемостаза // Фундаментал. исслед. - 2011. - №3. - волны агрегации тромбоцитов, индуцированной С. 61-66. малыми дозами АДФ, удлинение lag-периода при 4. Руководство по экспериментальному (докли коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов, ническому) изучению новых фармакологических веа также снижение доступности и высвобождения ществ / Под общ. ред. Р.У. Хабриева. - М.: Медицина, P3 и P4. 2005. - 327 с. ВЫВОД 5. Воrn G.V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal // Nature. - Результаты проведённых исследований свиде-1962. - Vоl. 194. - Р. 927-929. тельствуют о действии соединения I как потенци-6. Cotton B.A., Faz G., Hatch Q.M. Rapid ального ингибитора реакции высвобождения тром-thrombelastography delivers real-time results that predict боцитов. transfusion within 1 hour of admission // J. Trauma. - 2011. - Vol. 71, N 2. - P. 407-414. 7. Gabbasov Z.A. The use of optical density ЛИТЕРАТУРА fluctuations for determination of platelet concentration in stirred suspension // Platelets. - 1992. - Vol. 3. - 1. Иванов Е.П. Диагностика нарушений гемостаза. - Минск: Беларусь, 1983. - 267 с. P. 281-282.

About the authors

F Kh Kamilov

Bashkir State Medical University, Ufa, Russia

G A Timirkhanova

Bashkir State Medical University, Ufa, Russia

A I Samorodova

Bashkir State Medical University, Ufa, Russia

A V Samorodov

Bashkir State Medical University, Ufa, Russia

Email: avsamorodov@gmail.com

F A Khaliullin

Bashkir State Medical University, Ufa, Russia

D Z Murataev

Bashkir State Medical University, Ufa, Russia

References

Supplementary files