FAS-receptor expression in peripheral blood lymphocytes and monocytes in pregnant women with fetal growth restriction

Full Text

Задержка роста плода представляет весьма важную проблему в современном акушерстве и неонатологии, сопровождающуюся высокой перинатальной заболеваемостью и смертностью. По данным различных авторов, распространённость этой патологии составляет от 10 до 44% [2, 4, 5]. Не вызывает сомнений, что в основе малой массы тела плода и морфологической незрелости лежат изменения метаболизма не только в плаценте, но и в организме беременной и плода, однако их значимость в патогенезе остаётся до конца не раскрытой [4, 7, 8]. Благодаря фундаментальным исследованиям отечественных и зарубежных иммунологов были получены убедительные данные о роли иммунной системы во внутриутробном развитии плода. Общеизвестно, что один из важных механизмов регулирования иммунной системы - апоптоз. Ассоциированный с мембраной клетки Fas-рецептор (CD95) является ключевой молекулой, опосредующей апоптоз, а Fas-опосредованный апоптоз лимфоцитов служит важнейшим механизмом регуляции иммунного гомеостаза [1]. Согласно современным представлениям, нарушения иммунной системы лежат в основе патогенеза многих нарушений. Однако конкретные патогенетические механизмы иммунных нарушений, способствующих внутриутробной задержке роста плода, на сегодняшний день не исследованы. Учитывая вышеизложенное, приоритетным направлением является изучение патогенеза нарушений внутриутробного роста плода с позиций определения роли врождённого и адаптивного иммунитета, а также особенностей взаимодействия между ними. Целью исследования было изучение экспрессии Fas-рецептора на лимфоцитах и моноцитах периферической крови у женщин, родивших детей с низкой массой тела. В популяционное одномоментное исследование включены 242 отобранных случайным образом женщины, поступившие для родоразрешения в родильные дома г. Читы, родившие на сроке более 35 нед гестации. Критериями включения были возраст от 20 до 40 лет и проживание в г. Чите не менее 5 лет. Женщин с пороками развития плода и/или многоплодием не включали в исследование. Все пациентки подписали информированное согласие на участие в исследовании. На основании массы тела новорождённых были сформированы две группы: первая группа (n=108) - пары мать-новорождённый с малым весом новорождённого (МВН) для соответствующего гестационного возраста, вторая группа (n=134) - пары мать-новорождённый с нормальным весом новорождённого (НВН) для соответствующего гестационного возраста. МВН для соответствующего гестационного возраста устанавливали, если масса тела при рождении была ниже 10-го перцентиля распределения массы для данного гестационного возраста (МКБ-10, Р05.0). Гестационный возраст рассчитывали путём вычитания даты первого дня последней менструации из даты родов. Первый день последней менструации устанавливали путём опроса родильниц, а также рассчитывали с помощью сопоставления данных ультразвукового исследования (УЗИ), проведённого в I триместре беременности. Массу новорождённых измеряли при помощи электронных весов с точнос-тью 10 г. Средний возраст включённых в исследование женщин составил 26,07±5,3 и 26,3±5,7 года в первой и второй группах соответственно (р >0,05). 60% женщин были перворородящими, а у повторнородящих было не более двух родов в анамнезе. Пациентки обеих групп не различались значимо по параметрам менструальной функции, акушерско-гинекологическому и соматическому анамнезу. Проводили анкетирование пациенток с уточнением демографических, клинико-анамнестических и наследственных факторов риска рождения ребёнка с МВН. Информацию о массе тела и росте пациенток в I триместре беременности извлекали из обменных карт родильниц. В качестве возможных факторов риска МВН рассматривали следующие: возраст, социальный статус, образование, курение, приём алкоголя, профессиональные вредности, диета, гинекологические и соматические заболевания, осложнения и заболевания во время настоящей беременности. Исследование иммунного статуса проводили сразу после поступления родильниц в роддом. Кровь получали путём пункции локтевой вены в строго стерильных условиях. Взятие крови осуществляли в утренние часы (в 8-9 ч) натощак. Для иммунофенотипирования кровь забирали в пробирку VACUTAINER (BD), содержащую динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, объёмом 2,0 мл. Определяли количественные показатели клеточного и гуморального иммунитета, уровень апоптоза. При оценке клеточного звена иммунитета регистрировали популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов и моноцитов периферической крови (выделяли лимфоциты с фенотипом CD3+CD19-, CD3-CD19+, CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD14+), уровень экспрессии маркёра апоптоза (CD3+CD95+, CD4+CD95+, CD8+CD95+, CD19+CD95+, CD14+CD95+) методом четырёх- и пятипараметрического фенотипирования, используя комбинации моноклональных антител к дифференцировочным и активационным маркёрам фирмы «BeckmanCoulter» (США). Клетки метили анти-CD45 и анти-CD14 моноклональными антителами для наложения оптимального окна дискриминации (гейта) для лимфоцитов и моноцитов/макрофагов на точечном графике прямого и бокового светорассеяния. При анализе лимфоцитарный гейт включал не менее 95-98% клеток с фенотипом CD45+CD14-, моноцитарно-макрофагальный гейт включал не менее 93-96% клеток с фенотипом CD45+CD14+. В каждом образце анализировали не менее 104 клеток. Для удаления эритроцитов подготовку проб проводили с использованием лизирующего раствора OptiLise C фирмы «Immunotex» (Франция) по прилагаемому протоколу. Результаты учитывали на проточном цитофлюориметре «Beckman Coulter FC-500» (США), используя стандартные протоколы. Статистическую обработку полученного материала проводили с использованием пакетов Statistica 10 для Windows (США). Проверку на нормальность распределения количественных показателей осуществляли с использованием критерия Шапиро-Уилка. Так как все изучаемые показатели не подчинялись нормальному закону распределения, применяли непараметрические методы: описательная статистика представлена медианой и межквартильным интервалом, сравнение независимых выборок проводили с помощью критерия Манна-Уитни для парных признаков. В качестве критического уровня значимости при проверке статистических гипотез принимали р <0,05. Учитывая роль апоптоза в поддержании гомеостаза, нами было проанализировано содержание лимфоцитов и моноцитов, экспрессирующих Fas-рецептор CD95+, как маркёр поздней активации, характеризующий готовность клеток к апоптозу (табл. 1, 2). Результаты фенотипирования лейкоцитов методом проточной цитометрии показали, что как абсолютное, так и относительное содержание клеток CD3+CD95+ было статистически значимо выше у женщин в первой группе по сравнению с женщинами второй группы. Однако абсолютное и относительное содержание Т-лимфоцитов в обследуемых группах не различалось. При исследовании реализации программированной клеточной гибели лимфоцитов нами было установлено, что в субпопуляции Т-клеток женщин первой группы по сравнению со второй статистически значимо увеличена экспрессия Fas-рецептора в относительных значениях на Т-хелперах и цитотоксических Т-лимфоцитах в 1,6 раза (p <0,001) и 6,3 раза (p <0,001) соответственно, в абсолютных значениях - в 2,9 раза (p <0,001) и 2,6 раза (p <0,001) соответственно. На фоне активации апоптоза в субпопуляции Т-лимфоцитов у женщин первой группы отмечено значимое снижение абсолютного содержания CD3+CD4+ и CD3+CD8+ по сравнению с таковыми в группе женщин, родивших детей с НВН. Однако эти изменения никаким образом не отразились на отношении Т-хелперов к цитотоксическим Т-лимфоцитам (см. табл. 1). В свою очередь мы проанализировали соотношение экспрессирующих CD95+ субпопуляций Т-лимфоцитов, и оказалось, что у женщин первой группы отношение CD4+CD95+/CD8+CD95+ в 4,9 раза больше, чем во второй группе (p <0,001). У женщин первой группы зарегистрировано статистически значимое повышение абсолютной и относительной экспрессии Fas-рецептора на В-лимфоцитах на 63,9% (p <0,001) и 33,3% (p=0,002) соответственно по сравнению с женщинами второй группы. При этом абсолютное и относительное количество клеток CD3-CD19+ снижается в первой группе по сравнению со второй на 21,5% (p=0,007) и 28,6% (p=0,009) соответственно (табл. 2). При анализе экспрессии рецептора Fas мы наблюдали значимое повышение абсолютного и относительного количества моноцитов с фенотипом CD14+CD95+ по сравнению со второй группой женщин (см. табл. 2). При этом абсолютное содержание моноцитов в первой группе снижалось на 21,2% относительно второй группы (p=0,009). Выявленное нами значимое увеличение содержания CD95+ на лимфоцитах и моноцитах периферической крови иллюстрирует повышенную готовность Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов и моноцитов к апоптозу у женщин первой группы. По данным L. Belkacemi и соавт., увеличение Fas-индуцированного апоптоза клеток плаценты приводит к снижению поступления питательных веществ к плоду [6]. Таким образом, в условиях чрезмерной гибели лимфоцитов и моноцитов иммунная система не может выполнять свою главную функцию иммунологического надзора, что в свою очередь приводит к нарушению работы плаценты [3], так как последняя играет ключевую роль в поступлении питательных веществ и синтезе гормонов, необходимых для нормального формирования массы плода. ВЫВОД При анализе показателей иммунной системы установлено, что выраженная экспрессия CD95+ на циркулирующих моноцитах и повышение отношения CD4+CD95+/CD8+CD95+ в 4,9 раза у женщин, родивших детей с малой массой тела, может служить лабораторным критерием развития задержки роста плода. Таблица 1 Содержание субпопуляций Т-лимфоцитов и экспрессия на них Fas-рецептора CD95+ в периферической крови у беременных в III триместре Параметры Первая группа (n=108) Вторая группа (n=134) CD3+CD19- % 78,01 (73,13; 84,24) 76,54 (72,06; 83,47) 109/л 1,32 (1,08; 1,67) 1,32 (1,07; 1,35) CD3+CD4+ % 58,40 (51,30; 61,25) 51,54 (49,16; 54,75) 109/л 0,62 (0,59; 0,65)* 0,70 (0,63; 0,78)* CD3+CD8+ % 35,06 (31,29; 37,34) 29,45 (24,82; 33,02) 109/л 0,37 (0,34; 0,49)* 0,49 (0,47; 0,58)* CD3+CD4+/CD3+CD8+ 1,68 (1,58; 1,84) 1,74 (1,57; 1,95) CD3+CD95+ % 14,23 (9,11; 18,69)* 5,09 (2,74; 6,89)* 109/л 0,114 (0,062; 0,139)* 0,041 (0,029; 0,056)* CD4+CD95+ % 6,28 (5,22; 12,56)* 3,97 (1,38; 4,49)* 109/л 0,082 (0,042; 0,076)* 0,028 (0,025; 0,036)* CD8+CD95+ % 5,27 (3,98; 6,02)* 0,83 (0,41; 1,41)* 109/л 0,018 (0,012; 0,035)* 0,007 (0,001; 0,009)* CD4+CD95+/CD8+CD95+ 4,54 (2,22; 7,19)* 0,93 (0,37; 1,34)* Примечание: данные представлены в виде медианы и межквартильного размаха; *для сравнения данных - тест Манна-Уитни, p <0,05. Таблица 2 Содержание В-лимфоцитов, моноцитов и экспрессия на них Fas-рецептора (CD95+) в периферической крови у беременных в III триместре Параметры Первая группа, МВН (n=108) Вторая группа, НВН (n=134) CD3-CD19+ % 8,24 (5,09; 9,68)* 10,50 (9,54; 12,02)* 109/л 0,15 (0,11; 0,18)* 0,21 (0,19; 0,25)* CD19+CD95+ % 7,95 (6,04; 11,99)* 4,85 (2,66; 5,95)* 109/л 0,008 (0,007; 0,015)* 0,006 (0,003; 0,007)* CD14+ % 4,93 (4,39; 5,40)* 5,28 (4,70; 5,81)* 109/л 0,41 (0,38; 0,50)* 0,52 (0,47; 0,60)* CD14+CD95+ % 28,82 (21,66; 34,73)* 17,85 (14,34; 20,85)* 109/л 0,29 (0,27; 0,35)* 0,15 (0,12; 0,18)* Примечание: данные представлены в виде медианы и межквартильного размаха; *для сравнения данных - тест Манна-Уитни, p <0,05; МВН - малый вес новорождённых; НВН - нормальный вес новорождённых.

About the authors

E V Kazantseva

Chita State Medical Academy, Chita, Russia

Email: kalevi@yandex.ru

N V Dolgushina

Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology named after V.I. Kulakov, Moscow, Russia

P P Tereshkov

Chita State Medical Academy, Chita, Russia

References

Supplementary files