The change of splenic morphometric parameters in aged laboratory animals exposed to ionizing radiation after undergoing stem cells transplantation

Full Text

Одно из очень быстро развивающихся направлений в области борьбы со старением - регенеративная медицина и моделирование тканей. Известно, что способность стволовых клеток к самообновлению и дифференцировке с возрастом снижается. Это ведёт, с одной стороны, к истощению пула стволовых клеток, а с другой - к уменьшению количества выделяемых ими факторов [2, 8, 9]. В связи с этим на сегодняшний день можно выделить два направления антивозрастной терапии: терапия стволовыми клетками и трофическими факторами. Проведённые ранее в нашей лаборатории эксперименты позволили установить существенное влияние сочетанной трансплантации стволовых клеток - мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) и гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), выделенных из плаценты, - на регенерацию быстро обновляющихся тканей (миелоидной ткани и эпителия кишечника) [1, 6, 7]. С целью получения новых данных о механизме действия сочетанной трансплантации ММСК и ГСК на быстро обновляющиеся ткани в возрастном аспекте в настоящем исследовании были проведены эксперименты на старых лабораторных животных в физиологических условиях и после воздействия ионизирующего излучения. Эксперименты по изучению изменений морфометрических показателей селезёнки старых лабораторных животных после воздействия ионизирующего излучения на фоне трансплантации стволовых клеток выполнены на 36 белых лабораторных мышах-самцах в возрасте 3 лет с массой тела 50 г. Плацентарные ММСК и ГСК выделены от 8 лабораторных мышей-самок в возрасте 3-4 мес с массой тела 25-30 г, срок гестации 14 дней [3-5]. Методика SCA-1-позитивной иммуномагнитной сепарации 1. Первичная клеточная суспензия суспендирована в рекомендованном растворе в концентрации 100 млн клеток в 1 мл буфера для иммуномагнитной сепарации («StemCell Technologies», СШA). Состав рекомендованного раствора: фосфатный буфер без ионов Cа2+ и Mg2+ (pH=7,4), 2% раствор фетальной бычьей сыворотки с 1 ммоль этилендиаминтетрауксусной кислоты. 2. Клетки помещены в пробирку из полистирена ёмкостью 5 мл. 3. Добавлены первичные биотинилированные антитела «SCA-1 PE Labeling Reagent» («StemCell Technologies», СШA) в концентрации 50 мкл на 1 мл клеточной суспензии. Суспензия была пипетирована и инкубирована при комнатной температуре в течение 15 мин. 4. Добавлены вторичные антитела «EasySep PE Selection Cocktail» («StemCell Technologies», СШA) в концентрации 70 мкл на 1 мл клеточной суспензии, способные специфически связываться с биотином первичных антител. Суспензия была пипетирована и инкубирована при комнатной температуре в течение 15 мин. 5. Добавлены покрытые декстраном наночастицы железа («StemCell Technologies», СШA) в концентрации 50 мкл на 1 мл клеточной суспензии, способные связываться с вторичными антителами. Суспензия была пипетирована и в дальнейшем инкубирована при комнатной температуре в течение 10 мин. 6. Клеточная суспензия была доведена до объёма 2,5 мл с использованием буфера для иммуномагнитной сепарации. После пипетирования данная пробирка была помещена в магнит («StemCell Technologies», СШA). Время инкубации в магните составило 5 мин. 7. Перевернув магнит с находящейся в нём пробиркой и удерживая его в таком положении 2-3 с, из пробирки удаляли SCA-1-отрицательную фракцию клеток. 8. Поставив магнит и вынув из него пробирку, повторно добавляли в нее 2,5 мл буфера для иммуномагнитной сепарации. После пипетирования данная пробирка была помещена в магнит. Время инкубации в магните составило 5 мин. 9. Этапы прямой иммуномагнитной сепарации №6 и №7 были повторены дважды. Выделенная таким образом фракция, положительная по маркёру ГСК, была подвергнута дальнейшим исследованиям. Методика СD117-позитивной иммуномагнитной сепарации 1. Первичная клеточная масса суспендирована в рекомендованном растворе в концентрации 100 млн клеток в 1 мл буфера для иммуномагнитной сепарации («StemCell Technologies», СШA). Состав рекомендованного раствора: фосфатный буфер без ионов Cа2+ и Mg2+ (pH=7,4), 2% раствор фетальной бычьей сыворотки с 1 ммоль этилендиаминтетрауксусной кислоты. 2. Клетки помещены в пробирку из полистирена ёмкостью 5 мл. 3. Добавлены первичные биотинилированные антитела «CD 117 PE Labeling Reagent» («StemCell Technologies», СШA) в концентрации 50 мкл на 1 мл клеточной суспензии. Суспензия была пипетирована и в дальнейшем инкубирована при комнатной температуре в течение 15 мин. 4. Добавлены вторичные антитела «EasySep PE Selection Cocktail» («StemCell Technologies», СШA) в концентрации 70 мкл на 1 мл клеточной суспензии, способные специфически связываться с биотином первичных антител. Суспензия была пипетирована и инкубирована при комнатной температуре в течение 15 мин. 5. Добавлены покрытые декстраном наночастицы железа («StemCell Technologies», СШA) в концентрации 50 мкл на 1 мл клеточной суспензии, способные связываться с вторичными антителами. Суспензия была пипетирована и инкубирована при комнатной температуре в течение 10 мин. 6. Клеточная суспензия была доведена до объёма 2,5 мл с использованием буфера для иммуномагнитной сепарации. После проведённого пипетирования данная пробирка была помещена в магнит («StemCell Technologies», СШA). Время инкубации в магните составило 5 мин. 7. Перевернув магнит с находящейся в нём пробиркой и удерживая его в таком положении 2-3 с, удаляли из пробирки CD117-отрицательную фракцию клеток. 8. Поставив магнит и вынув из него пробирку, повторно добавляли в нее 2,5 мл буфера для иммуномагнитной сепарации. После проведённого пипетирования данная пробирка была помещена в магнит. Время инкубации в магните составило 5 мин. 9. Этапы прямой иммуномагнитной сепарации №6 и №7 повторяли дважды. Выделенная фракция, положительная по маркёру ГСК CD117, была подвергнута дальнейшим исследованиям. Изучали воздействие ионизирующего излучения в дозе 4,0 Гр на 72 старых лабораторных животных, при этом были выделены первая (36 животных) и вторая (36 животных) группы. На первую группу воздействовали ионизирующим излучением. Вторую группу составили животные, не подвергшиеся облучению. В каждой группе были выделены опытная (18 животных) и контрольная (18 животных) подгруппы. Животным опытных подгрупп внутривенно вводили суспензию ММСК и ГСК соответственно в дозе 6 млн клеток/кг и 330 тыс. клеток/кг, контрольным подгруппам внутривенно вводили 0,2 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Внутривенные введения осуществляли через 1 ч после облучения однократно. Забой животных выполняли на 1-е и 7-е сутки после облучения. Гистологические препараты селезёнки анализировали с помощью микроскопа «Micros MC-50» (Австрия) при увеличении ×40, а также с помощью морфометрической программы «BioVision 2008». Проводили анализ общей площади лимфоидного фолликула, площади T-зоны лимфоидного фолликула, площади B-зоны лимфоидного фолликула, определяли общую клеточность красной пульпы, а также содержание эритроцитов и лейкоцитов в ней. Для каждого ряда значений показателя вычисляли среднюю арифметическую величину и стандартную ошибку среднего. Достоверность различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при p <0,05. Морфометрические показатели животных второй группы (не подвергшихся воздействию ионизирующего излучения) на 1-е и 7-е сутки эксперимента представлены в табл. 1. На 1-е сутки после воздействия ионизирующего излучения на фоне сочетанной трансплантации ММСК и ГСК при проведении морфометрического исследования селезёнки старых лабораторных мышей установлено, что изучаемые показатели существенно не отличались от данных, полученных в контрольной подгруппе (табл. 2). При проведении гистологического исследования на 7-е сутки после воздействия ионизирующего излучения в дозе 4,0 Гр на фоне трансплантации стволовых клеток выявлено восстановление площади лимфоидного фолликула до значений нормы. При анализе площади B-зоны лимфоидного фолликула установлен эффект от введения стволовых клеток в виде увеличения данного показателя относительно контрольной подгруппы и в то же время его восстановление до значений нормы. Обнаружено увеличение плотности клеток в красной пульпе селезёнки, восстановление лейкоцитов в красной пульпе до значений нормы (см. табл. 2). Проведённый на старых лабораторных животных эксперимент свидетельствует о наличии эффекта от сочетанной трансплантации стволовых клеток (ММСК и ГСК) на 7-е сутки после лучевой нагрузки. Этот эффект проявляется в восстановлении до значений нормы площади тимус-независимой зоны лимфоидного фолликула. Выраженное действие от трансплантации ММСК и ГСК также проявляется в увеличении плотности клеток в красной пульпе. Тем не менее, при изучении содержания эритроидных клеток и клеток белой крови в красной пульпе селезёнки не выявлено существенного изменения этих показателей по сравнению с контрольной подгруппой. В то же время следует отметить, что произошло восстановление содержания лейкоцитов в красной пульпе селезёнки до значений нормы. Известно, что с возрастом происходит уменьшение способности клеток к миграции и дифференцировке колониеобразующих единиц селезёнки, расположенных в костном мозге. Усилить миграцию аллогенных и собственных колониеобразующих единиц селезёнки способны трансплантированные ММСК за счёт выработки ими хемоаттрактанта для ГСК - SDF-1. Способность трансплантированных ММСК усиливать синтез антиапоптогенных факторов (HIF-1α) может определить сохранение клеток в красной пульпе, что определялось нами как повышение плотности клеток в красной пульпе селезёнки. ВЫВОД Таким образом, усилением хоуминга колониеобразующих единиц селезёнки, последующей активацией экстрамедуллярного кроветворения в селезёнке, реализацией антиапоптогенного действия мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток можно объяснить восстановление основных морфометрических показателей в селезёнке у старых лабораторных животных в условиях лучевой нагрузки. Таблица 1 Морфометрические показатели селезёнки старых мышей без воздействия ионизирующего излучения (M±m) Параметры 1-е сутки эксперимента 7-е сутки эксперимента Введение 0,9% раствора натрия хлорида (n=9) Сочетанная трансплантация ММСК и ГСК (n=9) Введение 0,9% раствора натрия хлорида (n=9) Сочетанная трансплантация ММСК и ГСК (n=9) Площадь лимфоидного фолликула, мкм2×105 0,63±0,05 0,60±0,07 0,6±0,04 0,63±0,06 Площадь В-зоны, мкм2×105 0,58±0,04 0,53±0,04 0,55±0,04 0,52±0,04 Площадь T-зоны, мкм2×105 0,055±0,006 0,055±0,01 0,058±0,007 0,060±0,009 Расстояние между центрами фолликулов, мкм 285,43±7,80 282,00±9,43 281,43±8,49 276,43±9,63 Общая клеточность красной пульпы на 0,01 мм2 184,29±10,98 175,14±8,45 179,43±8,08 188,71±15,10 Содержание эритроцитов в красной пульпе на 0,01 мм2 108,71±10,24 100,71±10,24 104,71±6,90 106,43±8,37 Содержание лейкоцитов в красной пульпе на 0,01 мм2 73,86±4,73 73,86±4,73 72,86±7,31 74,43±8,78 Примечание: ММСК - мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки; ГСК - гемопоэтические стволовые клетки. © 58. «Казанский мед. ж.», №6. Таблица 2 Морфометрические параметры селезёнки старых мышей после воздействия ионизирующего излучения (ИИ) в дозе 4,0 Гр (M±m) Параметры 1-е сутки после воздействия ИИ 7-е сутки после воздействия ИИ Введение 0,9% раствора натрия хлорида (n=9) Сочетанная трансплантация ММСК и ГСК (n=9) Введение 0,9% раствора натрия хлорида (n=9) Сочетанная трансплантация ММСК и ГСК (n=9) Площадь лимфоидного фолликула, мкм2×105 0,46±0,05* 0,48±0,08* 0,51±0,05* 0,53±0,06 Площадь В-зоны, мкм2×105 0,42±0,055* 0,41±0,078* 0,43±0,057* 0,51±0,048** Площадь T-зоны, мкм2×105 0,039±0,006* 0,04±0,008* 0,045±0,007* 0,046±0,005* Расстояние между центрами фолликулов, мкм 215,14±10,41* 219,57±13,22* 226,71±3,67* 235,86±8,45* Общая клеточность красной пульпы на 0,01 мм2 131,00±8,00* 126,71±7,76* 146,71±10,82* 162,71±6,24*,** Содержание эритроцитов в красной пульпе на 0,01 мм2 82,43±10,37* 77,43±7,92* 146,71±10,82* 87,14±4,73* Содержание лейкоцитов в красной пульпе на 0,01 мм2 56,57±6,94* 59,14±6,98* 62,57±5,51* 65,14±6,12 Примечание: *отличие от группы старых интактных животных (контрольная группа) p <0,05; **отличие от подгруппы старых интактных животных после воздействия ионизирующего излучения (контрольная подгруппа) p <0,05; ММСК - мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки; ГСК - гемопоэтические стволовые клетки.

About the authors

D Yu Grebnev

Institute of Medical Cellular Technologies, Ekaterinburg, Russia; Ural State Medical University, Ekaterinburg, Russia

Email: dr-grebnev77@mail.ru

A P Yastrebov

Ural State Medical University, Ekaterinburg, Russia

I Yu Maklakova

Institute of Medical Cellular Technologies, Ekaterinburg, Russia; Ural State Medical University, Ekaterinburg, Russia

References

Supplementary files