Increased activity of poly(ADP-ribose)-polymerase in PML-depleted cells - novel perspectives for cancer therapy

Full Text

Известно, что дефекты в системе репарации дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) не только обусловливают повышенную частоту возникновения злокачественных новообразований, но и способны влиять на восприимчивость опухолевых клеток к воздействию ионизирующей радиации, химиопрепаратов, определяя таким образом эффективность терапии. К примеру, большинство случаев наследственных форм рака молочной железы (РМЖ) и яичника в настоящее время обусловлено мутациями генов BRCA1 и BRCA2 [1], играющих, как известно, одну из ключевых ролей в процессах гомологичной рекомбинации ДНК. Исследования последних лет показали, что несмотря на высокую частоту РМЖ в популяции, носительницы герминативных мутаций BRCA1/2 восприимчивы к лечению ингибиторами поли(АДФ-рибоза)-полимераз (ПАРП) и препаратами платины (цисплатин), повреждающими ДНК [2]. Чувствительность к препаратам первой группы объясняется концепцией «синтетической летальности» (см. ниже), в то время как восприимчивость к препаратам платины обусловлена их способностью вызывать двунитевые разрывы ДНК, которые репарируются преимущественно по механизму BRCA1/BRCA2-опосредованной гомологичной рекомбинации [11]. Таким образом, изучение молекулярных механизмов репарации повреждений ДНК - актуальная задача как с точки зрения уточнения молекулярных механизмов поддержания целостности клеточного генома, так и с точки зрения понимания механизмов чувствительности/резистентности злокачественных новообразований к проводимой химио- и радиотерапии, определения наиболее эффективных методов лечения. Настоящее исследование выполнено на фибробластах человека линии BJ, культивированных в среде DMEM/199 с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки, глутамина и антибиотиков (Lonza, MD, USA). Снижения уровня экспрессии белка PML достигали в результате трансфекции коротких интерферирующих рибонуклеиновых кислот (киРНК) против PML (SMARTPool, Dharmacon). Транcфекцию киРНК против PML или контрольной РНК осуществляли с помощью реагента «RNAiMAX» (Invitrogen). Нокдаун белка PML подтверждали методом иммуноблоттинга с использованием соответствующих антител (клон PG-M3 и H-92, Santa Cruz). Спустя 24 ч вызывали повреждения ДНК с помощью химиопрепаратов - доксорубицина (0,25 мкг/мл, Sigma), гидроксимочевины (5 мM, Calbiochem) - или воздействия ионизирующего излучения (10 Гр). Активность ПАРП оценивали через 48 ч с помощью иммуноблоттинга и иммунофлюоресцентной микроскопии с использованием моноклональных антител к поли(АДФ-рибоза)-полимерам (ПАР-полимерам, клон 10Н, Genetex), традиционно используемых в качестве маркёров активности ПАРП [8]. Количественную оценку клеток, имеющих фокальное распределение ПАР-полимеров, осуществляли, как минимум, в 10 полях зрения. Для выявления двунитевых разрывов ДНК и активации репарации возникших повреждений оценивали уровень экспрессии фосфорилированных форм гистона 2А (H2AX Ser139) и АТМ-киназы (pATM Ser1981) (Cell Signaling и Epitomics соответственно). В качестве контроля уровня экспрессии белков использовали моноклональные антитела к общим формам вышеназванных белков (Cell Signaling и Epitomics) и актину (Sigma). Активацию репаративных процессов также оценивали методом иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител к фосфорилированным формам гистона 2А (H2AX Ser139, Millipore), АТМ-киназы (pATM Ser1981, 200-301-400, Rockland) и белка 53BP1 (Ab-1, Calbiochem). В качестве вторичных антител использовали антитела, меченые Alexa-Fluor-488 (Invitrogen) и Cy3+ (Jackson ImmunoResearch). Результаты исследований обрабатывали с помощью программы «Statistica 6.0» (StatSoft Inc., США), для оценки достоверности различий изучаемых выборок использовали t-критерий Стьюдента. Результаты проведённых исследований показали, что нокдаун белка PML в фибробластах человека приводит к увеличению активности ПАРП, о чём свидетельствует увеличение уровня экспрессии поли-АДФ-рибозы. На рис. 1 показано, что через 72 ч после трансфекции киРНК против PML уровень экспрессии ПАР-полимеров был существенно выше во всех исследуемых образцах (колонки 2, 4, 6 и 8) по сравнению с контролем (клетки, подвергнутые трансфекции контрольной киРНК). Кроме того, было отмечено существенное увеличение уровня экспрессии ПАР-полимеров в данных клетках после индукции повреждений ДНК (колонки 4, 6 и 8) по сравнению с клетками, не подвергнутыми генотоксическому воздействию (контроль, колонка 2). Полученные нами данные согласуются с современными представлениями об активации ПАРП и накоплении в клетках ПАР-полимеров в условиях повреждений ДНК: количество полимеров в неповреждённых клетках обычно мало, и поли-АДФ-рибоза находится в форме моно- или олигомеров, но при наличии одно- и двунитевых разрывов ДНК активность ПАРП и, следовательно, содержание поли-АДФ-рибозы в клетках может возрастать в 10-500 раз. Наличие повреждений ДНК в результате воздействия химиопрепаратов и ионизирующего излучения подтверждалось значительным повышением уровня экспрессии фосфорилированной формы гистона 2А, являющегося, как известно, суррогатным маркёром двунитивых разрывов ДНК [13]. В фибробластах, подвергнутых генотоксическому воздействию химиопрепаратов и ионизирующего излучения, также происходила активация репаративных процессов, о чём свидетельствует повышение уровня экспрессии фосфорилированной формы АТМ-киназы (pATM Ser 1981) (см. рис. 1) - одной из ключевых киназ, участвующих в привлечении, активации и фосфорилировании белков-репарантов в местах повреждений ДНК [4]. Кроме увеличения уровня экспрессии ПАР-полимеров, в пользу активации спасательных путей репарации повреждений ДНК, возникших в результате воздействия генотоксических факторов (в частности, доксорубицина), также свидетельствует существенное увеличение количества клеток c фокальным распределением фосфорилированной формы вышеуказанной АТМ-киназы и белка 53BP1 (рис. 2А). Важно отметить, что несмотря на наличие фокального распределения фосфорилированной формы гистона 2А, свидетельствующего о наличии двунитевых разрывов ДНК, в клетках с нокдауном PML не происходило фокального накопления вышеназванных белков после воздействия доксорубицина (рис. 2Б). Аналогичные результаты были получены в результате воздействия гидроксимочевины и ионизирующего излучения. Учитывая полученные данные, а также ранее обнаруженные нами факты многочисленных нарушений процессов гомологичной рекомбинации в условиях нокаута и нокдауна белка PML [5], мы полагаем, что активация ПАРП в данных экспериментальных условиях обусловлена именно нарушениями процессов гомологичной рекомбинации. Это может служить компенсаторным механизмом, способствующим выживанию клеток в условиях генотоксического стресса и PML-опосредованной несостоятельности механизмов гомологичной рекомбинации ДНК. О несостоятельности процессов гомологичной рекомбинации ДНК в условиях внешнего повреждающего воздействия (химиопрепараты и/или ионизирующее излучение) и нокдауна белка PML также свидетельствуют данные об отсутствии положительной динамики фокального распределения белков-репарантов (pATM Ser1981 и 53BP1) в условиях нокдауна PML (см. рис. 2Б). Важно отметить, что результаты иммунофлюоресцентого анализа в данном случае более информативны по сравнению с данными иммуноблоттинга, так как наиболее точно отражают молекулярные механизмы нарушений процессов гомологичной рекомбинации в условиях нокдауна PML. В частности, в условиях внешнего повреждения фибробластов, вызванного воздействием химиопрепаратов и ионизирующего излучения, нами не было обнаружено различий в уровне экспрессии фосфорилированной формы АТМ-киназы между клетками, подвергнутыми трансфекции контрольной киРНК и киРНК против PML (см. рис. 1, колонки 3-8). В то же время, несмотря на увеличение уровня экспрессии данного белка в условиях генотоксического стресса, фокальное распределение данной формы киназы, а также белка 53BP1 происходит исключительно в клетках с нормальным уровнем экспрессии белка PML (см. рис. 2). Факт умеренного повышения активности ПАРП в условиях нокдауна белка PML был выявлен в фибробластах даже при отсутствии воздействия химиопрепаратов или ионизирующего излучения (см. рис. 1, колонки 1 и 2). Это может свидетельствовать о развитии компенсаторных механизмов, препятствующих образованию разрывов ДНК в процессе её репликации, что является опасным в условиях функциональной недостаточности процессов гомологичной рекомбинации ДНК. Для подтверждения полученных результатов, свидетельствующих о гиперактивации ПАРП в условиях генотоксического стресса на фоне нокдауна белка PML, был произведён подсчёт количества клеток с признаками фокального накопления поли-АДФ-рибозы в фибробластах, находившихся в аналогичных экспериментальных условиях. Результаты иммунофлюоресцентной микроскопии, представленные в табл. 1, показывают значительное увеличение количества ПАР-позитивных клеток в условиях одновременного нокдауна белка PML и генотоксического стресса, индуцированного доксорубицином, гидроксимочевиной и воздействием ионизирующего излучения. Таким образом, данные иммунофлюоресцентной микроскопии коррелируют с данными иммуноблоттинга и подтверждают факт гиперактивации ПАРП в фибробластах, имеющих повреждения ДНК в условиях «дефицита» белка PML. Полученные нами результаты коррелируют с данными современной зарубежной литературы, свидетельствующими о тесной взаимосвязи между активностью ПАРП и процессами гомологичной рекомбинации ДНК. К примеру, эта зависимость находит отражение в концепции «синтетической летальности», иллюстрирующей тот факт, что в условиях неэффективности процесса гомологичной рекомбинации по причине мутаций генов BRCA1/2 клетки оказываются чрезвычайно «зависимыми» от функциональной активности ПАРП [8]. Установлено, что данный тип полимераз участвует в репарации различного рода повреждений ДНК, а также устраняет дефекты ДНК, возникающие в процессе её репликации. Последние могут привести к двунитевым разрывам ДНК, репарируемым, как известно, по механизму гомологичной рекомбинации. В связи с вышеизложенным логичными выглядят данные о значительном повышении уровня активности ПАРП в условиях нокаута и нокдауна BRCA1/2, обусловливающих несостоятельность процессов гомологичной рекомбинации [7]. Следовательно, опухолевые клетки, имеющие генетические дефекты в системе гомологичной рекомбинации (например, у больных с наследственными формами РМЖ и рака яичника вследствие мутаций генов BRCA1/2), будут чрезвычайно зависимыми от функционального состояния ПАРП и подвержены гибели при ингибировании второго «спасательного» (то есть ПАРП-опосредованного) пути репарации повреждений ДНК [7]. Получив экспериментальное подтверждение, концепция «синтетической летальности» послужила основанием для проведения клинических испытаний по оценке эффективности использования ингибиторов ПАРП при лечении отдельных групп больных злокачественными новообразованиями (в первую очередь больных с наследственными формами РМЖ и яичника, упомянутыми выше) [10]. Была показана эффективность ингибиторов ПАРП (олапариб, MK4827, INO-1001, CEP-9722 и др.) как в качестве монотерапии [3], так и в комбинации с химиопрепаратами и радиотерапией, традиционно используемыми при лечении отдельных форм злокачественных новообразований (например, тройного негативного РМЖ, меланомы, рака кишечника, глиом и пр.) [12]. Использование ингибиторов ПАРП позволяло увеличить чувствительность злокачественных новообразований к химио- и радиотерапии (то есть факторам, инициирующим повреждение ДНК). Важно отметить, что группа злокачественных новообразований с дефектами процессов гомологичной рекомбинации, а следовательно, потенциально чувствительных к лечению ингибиторами ПАРП, может быть значительно шире и не ограничиваться наследственными формами РМЖ и рака яичника, обусловленными мутациями генов BRCA1 и BRCA2. К «BRCA1/2-независимым» механизмам, обусловливающим неполноценность процессов гомологичной рекомбинации, относят гиперметилирование промотора гена BRCA1, соматические мутации генов BRCA1/2, метилирование гена FANCF [14], амплификацию гена EMSF, кодирующего белок, взаимодействующий с белком BRCA2 [15], а также мутации других генов, кодирующих белки, вовлечённые в процессы репарации повреждений ДНК, например ATM, NBS1 и PALB2 [6]. В связи с этим полученные нами данные о взаимосвязи между активностью ПАРП и уровнем экспрессии белка PML углубляют понимание о молекулярных механизмах «синтетической летальности» и существенным образом расширяют спектр злокачественных новообразований со скрытыми (то есть «BRCA1/2-независимыми») дефектами гомологичной рекомбинации повреждений ДНК. Это позволяет расcматривать злокачественные новообразования со сниженной экспрессией белка PML в качестве потенциальных кандидатов для использования ингибиторов ПАРП в качестве монотерапии, а также в комбинации с химио- и радиотерапией. Спектр злокачественных новообразований, имеющих PML-зависимые дефекты процессов гомологичной рекомбинации, достаточно велик. В частности, иммунохимические исследования злокачественных опухолей различного происхождения показали, что экспрессия белка PML может полностью утрачиваться или значительно снижаться у 17% аденокарцином толстой кишки, 21% опухолей лёгких, 27% аденокарцином предстательной железы, 31% опухолей молочной железы, 49% опухолей центральной нервной системы (100% медуллобластом и более 90% олигодендроглиальных опухолей) и 68% неходжскинских лимфом [9]. ВЫВОДЫ 1. Обнаруженный нами феномен повышения активности ПАРП в «PML-дефицитных» клетках, находящихся как в «физиологических» условиях, так и в условиях генотоксического стресса, существенным образом расширяет группу больных злокачественными новообразованиями, потенциально восприимчивых к ингибиторам ПАРП. 2. Помимо повышения эффективности химио- и радиотерапии, внедрение ингибиторов ПАРП в практическую онкологию позволит снизить дозы химиопрепаратов, что, безусловно, уменьшит частоту побочных эффектов. 3. Для подтверждения правомочности данных предположений необходимо проведение дальнейших исследований. Выполнение данной работы частично финансировалось ФЦП Министерства образования и науки Российской Федерации (№14.А18.21.1930). Рис. 1. Уровень экспрессии поли-АДФ-рибозы (ПАР), общей и фосфорилированных форм АТМ-киназы и гистона 2А, а также актина в фибробластах человека линии BJ. Через 24 ч после трансфекции контрольной короткой интерферирующей рибонуклеиновой кислоты (киРНК) или киРНК против PML фибробласты были подвергнуты воздействию ионизирующего излучения или инкубированы с химиопрепаратами (доксорубицином или гидроксимочевиной). Уровень экспрессии белков оценивали через 48 ч после индукции повреждений дезоксирибонуклеиновой кислоты. А Б Бой_1.tif Рис. 2. Количество клеток c фокальным распределением белков, участвующих в репарации повреждений дезоксирибонуклеиновой кислоты (53BP1 и pATM S1981) до воздействия доксорубицина (контроль) и после его воздействия в течение 72 ч. Экспрессия фосфорилированной формы гистона 2А (γ-H2AX) использовалась как маркёр двунитевых разрывов. За 24 ч до воздействия клетки были подвергнуты трансфекции контрольной короткой интерферирующей рибонуклеиновой кислоты (киРНК) (А) или киРНК против PML (Б). Бой_3.tif Таблица 1 Количество поли(АДФ-рибоза)-положительных фибробластов человека в условиях генотоксического стресса, % (M±m) Контроль Доксорубицин Гидроксимочевина Ионизирующее облучение Контрольная киРНК 9,23±2,32 16,82±1,14* 19,81±0,50* 12,40±0,71 киРНК против PML 17,25±3,281 33,82±4,64*1 45,38±4,48*1 37,22±2,82*1 Примечание: киРНК - короткая интерферирующая рибонуклеиновая кислота; *показатель статистически значимо отличается от контроля, р ≤0,05; 1показатель статистически значимо отличается от соответствующего опыта с контрольной киРНК, р≤0,05.

About the authors

S V Boichuk

Kazan State Medical University, Kazan, Russia; University of Pittsburgh Cancer Institute, Pittsburgh, USA

Email: boichuksergei@mail.ru

B R Ramazanov

Kazan State Medical University, Kazan, Russia

I G Mustafin

Kazan State Medical University, Kazan, Russia

Gjoerup O

University of Pittsburgh Cancer Institute, Pittsburgh, USA

References

Supplementary files