Modulation of cell life cycle during exposure to phenols

Full Text

Важнейшая задача медицины в настоящее время - сохранение трудового потенциала страны. Техногенные химические загрязнители производственной среды обладают выраженным иммунотоксическим эффектом [2]. Углублённое изучение состояния иммунной системы работающего населения необходимо для своевременной диагностики и адекватных лечебно-профилактических мероприятий. Целью работы была оценка особенностей жизненного цикла клетки в условиях экспозиции фенолами. Обследованы 128 человек. В основную группу вошли 90 человек, имеющие рабочую специальность «изолировщик». Возраст обследуемых основной группы составлял от 21 до 56 лет (в среднем 39,1±5,2 года), мужчин было 59 (69,5%), женщин - 31 (30,5%). Трудовой стаж на производстве в среднем составлял 7,8±1,8 лет. Для оценки условий труда на рабочих местах использованы материалы аттестации рабочих мест, результаты производственного контроля, данные химико-аналитического анализа содержания веществ (фенола) в воздухе рабочей зоны на рабочих местах. Контрольную группу составили 39 человек в возрасте от 20 до 54 лет (средний возраст 39,83±2,90 года), 20 (51%) мужчин и 19 (49%) женщин, не имеющих контакта с производственными вредностями (служащие налоговой инспекции). Определение органических соединений (фенола, о-крезола, м-крезола, п-крезола) в крови выполняли на капиллярном газовом хроматографе «Кристалл 2000» («Хроматэк», Россия) в соответствии с методическими указаниями 4.1.2102-4.1.2116-06. Фенотипирование лимфоцитов проводили на проточном цитометре FACSCalibur («Becton Dickinson», USA). Определение популяций и субпопуляций лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, CD95+, CD3+CD16+CD56+, CD4+CD25+, CD4+CD25+127-) проводили методом мембранной иммунофлюоресценции с использованием панели меченых моноклональных антител (МКАТ) к мембранным CD-рецепторам («BD», USA). Для определения уровня экспрессии рецептора фактора некроза опухолей альфа I типа (TNFRI - tumor necrosis factor receptor I) использовали цитофлюориметрический метод, основанный на взаимодействии соответствующих МКАТ с мембранным рецептором TNFRI на лимфоцитах. Клетки (1×106 клеток/мл) отмывали фосфатно-солевым буфером и окрашивали стандартными МКАТ к рецептору TNFRI, меченными фикоэритрином («BD», USA), согласно протоколу фирмы-производителя. Использовали цитофлюориметр («BD», USA). Регистрацию апоптоза лимфоцитов проводили путём определения экспрессии фосфатидилсерина с помощью аннексина V, конъюгированного с флюоресцинизотиоцианатом (Annexin V-FITC, «BD», USA). После отмывания клетки ресуспендировали в рабочем растворе буфера для окрашивания и инкубировали с добавлением красителей. Через 15 мин их фиксировали рабочим раствором связывающего буфера и подвергали проточной цитофлюорометрии. Определение внутриклеточного маркёра апоптоза, протеина р53, проводили с помощью МКАТ против белка р53, конъюгированных с фикоэритрином, на проточном цитометре. Для анализа использовали суспензию мононуклеарных клеток периферической крови, выделенных путём центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина. Затем клетки, дважды отмытые в холодном фосфатно-солевом буфере, ресуспендировали и окрашивали стандартными МКАТ, согласно протоколу фирмы-производителя. Анализ информации проводили с помощью пакета «Statistica 6.0» и специально разработанных программ, сопряжённых с приложениями MS Office. Сравнение групп выполнено методами параметрической статистики с использованием двухвыборочного критерия Стьюдента (t). Качественные данные представлены в виде абсолютных или относительных (%) частот, количественные признаки представлены как M±m (среднее арифметическое ± ошибка среднего). Различия считали статистически значимыми при р <0,05. Максимальное содержание фенола в воздухе рабочей зоны производственных помещений составило 1,4 мг/м3, что превышает предельно допустимую концентрацию (0,3 мг/м3). В соответствии с руководством Р 2.2.2006-05 условия труда изолировщиков по фактору «фенол в воздухе рабочей зоны» относятся к классу 3.2. В крови всех обследуемых основной группы зафиксировано статистически значимое (р <0,05) повышение концентрации м-крезола в сравнении со значениями, зафиксированными в контрольной группе (табл. 1). Крезолы (о-крезол, м-крезол, п-крезол) в биосредах группы контроля данной методикой не идентифицировались. Отмечена достоверная зависимость количества м-крезола в крови обследуемых в зависимости от стажа работы в условиях производства (r=0,34, р <0,05). Сравнительный анализ иммунограмм продемонстрировал, что у обследуемых основной группы статистически значимо (р <0,05) снижено относительное число лимфоцитов CD3+ и повышена доля CD19+ в сравнении с величинами, полученными в группе контроля (табл. 2). Оценка уровня регуляторных клеток (CD4+CD25+127-, Treg) позволила установить, что у работающих в условиях производства статистически значимо (р <0,05) повышено абсолютное и относительное число Treg в сравнении с контрольной группой. При оценке активационных процессов в иммунной системе у изолировщиков выявлен высокий (в 1,5 раза больше по сравнению с контролем, р <0,05) уровень прироста в периферической крови лимфоцитов, экспрессирующих маркёр ранней активации - СD25-антиген. У обследуемых основной группы отмечено достоверное (р <0,05) снижение количества маркёра Fas-зависимого апоптоза (относительного и абсолютного числа) на популяции CD3+ клеток в сравнении с показателями контрольной группы. При изучении уровня апоптотической готовности иммуноцитов периферической крови выявлено статистически значимое (р <0,05) уменьшение содержания TNFRI+-лимфоцитов у работающих в условиях производства по сравнению со средним уровнем данного показателя в контрольной группе. У обследуемых основной группы зарегистрировано достоверное (р <0,05) понижение уровня белка р53 относительно значений, зафиксированных в группе контроля. В аннексиновом тесте были установлены изменения апоптотической реакции лимфоцитов при повышенном содержании фенолов в биологических средах. В иммунограммах отмечено статистически значимое (р <0,05) снижение уровня апоптотических (Annexin V-FITC+PI-) и некротических (Annexin V-FITC+PI+) клеток в группе обследуемых основной группы относительно цифр, зарегистрированных в группе контроля. Выявлен достоверный положительный коэффициент корреляции между концентрацией фенола в биологических средах и количеством клеток, экспрессирующих ранний маркёр активации (r=0,24, р <0,05), а также процентным содержанием Treg (r=0,17, р <0,05). Отмечена статистически значимая отрицательная зависимость показателей, характеризующих активационно-индуцированную гибель клетки - CD95+(r=-0,54, р <0,05), р53 (r=-0,56, р <0,05), TNFRI+ (r=-0,57, р <0,05), Annexin V-FITC+PI- (r=-0,44, р <0,05), Annexin V-FITC+PI+ (r=-0,44, р <0,05) - от содержания фенола в крови обследуемых основной группы. Ряд авторов утверждают, что низкая экспрессия СD3, общего популяционного маркёра Т-лимфоцитов, - отражение дефекта Т-клеточного звена иммунитета [3]. Другие исследователи полагают, что снижение количества СD3+-антигена на иммунокомпетентных клетках - признак мобилизации иммунной системы с преобладанием молодых незрелых форм Т-лимфоцитов, экспрессирующих ещё не CD3, а комплексы антигенов I (CD8+) или II (CD4+) класса главного комплекса гистосовместимости [1]. Экспериментально доказано, что В-лимфоциты служат источником FasL (Fas-лиганда), необходимого для запрограммированной гибели Т-лимфоцитов [5]. В свете этого можно полагать, что активация В-клеточного звена, фиксируемая при повышенной антигенной нагрузке, - фактор торможения иммунологической ответной реакции организма. Cубпопуляция регуляторных Т-лимфоцитов способна оказывать супрессорное влияние на различные типы иммунокомпетентных клеток [4]. Мишенями цитотоксичности Treg могут быть клетки CD4+, CD8+, моноциты. Будучи однажды активированными, Treg не зависят ни от природы антигена, ни от клетки, на которую они оказывают воздействие. Анализ активационного профиля субпопуляций иммунокомпетентных клеток показателен для оценки остроты и выраженности ответной иммунной реакции на воздействие антигена. Маркёр ранней активации, СD25-антиген, обеспечивает быстрое размножение и последующую дифференцировку нативных Т-клеток до зрелых форм в период повышенной гаптенной стимуляции. Решающую роль в регуляции иммунного ответа играет апоптоз, запускаемый через так называемые «рецепторы смерти». Значимую роль в регуляции апоптоза отводят таким рецепторам, как CD95+ (FasR) и TNFRI+, экспрессия которых отражает готовность лимфоцитов вступить в апоптоз. Белок р53 регулирует многие клеточные функции, включая митотический цикл, репарацию повреждённой дезоксирибонуклеиновой кислоты, дифференцировку клеток и их гибель по типу апоптоза. Отмечено, что р53 трансактивирует некоторые киллерные рецепторы, в частности Fas. Активация р53 даёт мощный апоптогенный сигнал. Поскольку форма реакции клетки в ответ на антигенную стимуляцию определяет результативность иммунного ответа, наиболее значима оценка активационного апоптоза. Реакция ингибирования апоптотической и некротической гибели иммунокомпетентных клеток может быть связана с изменённой чувствительностью лимфоцитов к апоптогенным факторам в условиях гаптенной нагрузки. ВЫВОДЫ 1. У обследуемой группы изолировщиков в условиях экспозиции фенолами усиление иммунного ответа сопряжено с интенсивными активационными процессами в иммунной системе, которые сопровождаются выраженным увеличением экспрессии ранних (CD25+) активационных антигенов на иммуноцитах (р <0,05) и в то же время повышением содержания лимфоцитов (Treg), оказывающих супрессорное влияние на различные типы иммунокомпетентных клеток (р <0,05). 2. Отмечено статистически значимое (р <0,05) снижение количества маркёров (CD95+, р53, TNFRI+, Annexin V-FITC+PI-, Annexin V-FITC+PI+), ответственных за клеточную гибель. Соотношение физиологических факторов с про- и антиапоптотической активностью определяет способность организма адекватно модулировать процесс гибели клеток в неблагоприятных условиях. На фоне повышенной контаминации биологических сред фенолами направленность апоптотической реакции иммунокомпетентных клеток характеризуется её угнетением. 3. Замедление апоптоза, индуцированного аннексином и фактором некроза опухолей альфа, дефицит содержания транскрипционного фактора р53 в условиях неблагоприятной производственной среды модифицирует ритмичность клеточного цикла, что ведёт к старению клетки и её возможной малигнизации. Таблица 1 Уровень низкомолекулярных химических соединений в крови обследуемых Показатели Контрольная группа (n=39), M±m Основная группа (n=58), M±m Фенол, мг/л 0,0531±0,002 0,0740±0,005 о-Крезол, мг/л -** 0,0005±0,0003 м-Крезол, мг/л -** 0,0062±0,002* п-Крезол, мг/л -** 0,0010±0,0007 Примечание: *разница статистически значима по сравнению с контрольной группой (р <0,05); **ниже предела чувствительности. Таблица 2 Характеристика показателей иммунной системы обследуемых Показатели Контрольная группа (n=39), M±m Основная группа (n=90), M±m CD3+, % 73,00±1,16 68,19±0,67* CD3+, 109/л 1,51±0,07 1,48±0,04 CD4+, % 43,10±0,90 41,32±0,89 CD4+, 109/л 0,90±0,05 0,89±0,03 CD8+, % 25,44±0,95 24,41±0,69 CD8+, 109/л 0,52±0,03 0,53±0,02 CD19+, % 9,39±0,48 11,08±0,41* CD19+, 109/л 0,20±0,01 0,24±0,01 CD3+CD16+CD56+, % 14,46±1,22 12,54±0,51 CD3+CD16+CD56+, 109/л 0,30±0,02 0,27±0,02 CD4+ CD25+127-, % 0,55±0,06 0,81±0,05* CD4+ CD25+127-, 109/л 0,01±0,001 0,02±0,001* CD4+CD25+, % 7,82±0,39 11,33±0,33* CD4+CD25+, 109/л 0,16±0,01 0,25±0,01* CD95+, % 35,14±1,55 31,34±0,77* CD95+, 109/л 0,69±0,03 0,67±0,02 p53, % 3,42±0,29 1,44±0,11* TNFRI+, % 3,31±0,27 1,39±0,11* Annexin V-FITC+PI-, % 4,77±0,42 2,17±0,09* Annexin V-FITC+PI+, % 13,06±1,17 7,69±0,25* Примечание: *разница статистически значима по сравнению с контрольной группой (р <0,05); TNFRI - рецептор фактора некроза опухолей альфа I типа; Annexin V-FITC - аннексин V, конъюгированный с флюоресцинизотиоцианатом.

About the authors

N V Zaitseva

Federal Scientific Center for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies, Perm, Russia

O V Dolgikh

Federal Scientific Center for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies, Perm, Russia

Email: oleg@fcrisk.ru

D G Dianova

Federal Scientific Center for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies, Perm, Russia

References

Supplementary files