Influence of toxoplasma gondii antigens on features of immune status at prenatal and early postnatal periods: experimental study

Full Text

Токсоплазмоз - одна из причин врождённых пороков развития, формирования иммунологической патологии в раннем и отдалённом периодах детства [4]. Развитие токсоплазмоза чаще всего происходит на фоне иммуносупрессии и определяется состоянием Т-клеточного звена иммунитета [1]. К настоящему времени существуют данные о преобладании типа Th1 иммунного ответа при развитии токсоплазмоза [7]. Механизм такой поляризации тесно связан с синтезом интерлейкина-12, обусловленным активацией эндосомальных рецепторов TLR-11 и -12 в дендритных клетках [9]. Подобный процесс обеспечивает активацию клеток CD4+ и продукцию ими интерферона γ, необходимого для NO-зависимого киллинга Toxoplasma Gondii (T. gondii) в паразитофорных везикулах макрофагов [9]. Важная роль в синтезе интерферона γ принадлежит также нейтрофильным лейкоцитам, однако механизм стимуляции его образования до сих пор остаётся невыясненным [8, 9]. У детей, рождённых от женщин с токсоплазмозом, регистрируют сочетанные иммунные нарушения в виде снижения количества фагоцитирующих клеток, уменьшения показателей Т-клеточного звена иммунитета с недостаточностью абсолютного содержания клеток CD3+ и CD4+ [1]. Однако связь между пренатальным и ранним постнатальным воздействием антигенов (АГ) T. gondii на органы иммунной системы плода и новорождённого и их функционированием в постнатальном периоде изучены недостаточно хорошо. Цель исследования - определить особенности иммунного статуса в пренатальном и раннем постнатальном периодах при воздействии АГ T. gondii. Экспериментальное исследование проведено на потомстве белых крыс линии Wistar, составившем две исследуемые и одну контрольную группы. В каждой группе было проведено две серии эксперимента. В исследуемую первую группу были включены крысята (n=52), рождённые от самок, которым в III триместре беременности был введён корпускулярный АГ T. gondii (ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, Москва) в дозе 1×107 клеток внутрибрюшинно (в/б). Во второй группе АГ T. gondii в дозе 1×105 клеток был введён новорождённым крысятам в возрасте 1 день (n=55). В группу контроля были включены интактные животные, сопоставимые по полу и возрасту (n=62). Во второй серии эксперимента за 5 сут до эвтаназии животным из исследуемых и контрольной групп были введены эритроциты барана в количестве 3×109 клеток (количество животных в первой, второй и контрольной группах составило 44, 48 и 55 соответственно). Эксперимент выполняли с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС). Взятие биологического материала (кровь, вилочковая железа, селезёнка, брыжеечные лимфатические узлы) проводили на 60-е сутки после рождения животных. Гематологический анализ выполняли с использованием анализатора Excell-22 (США). Число клеток CD3+ в крови и стандартной взвеси спленоцитов подсчитывали на проточном цитометре (Cytomics FC500, Beckman Coulter, США). Количество антителообразующих клеток, секретирующих иммуноглобулин М к эритроцитам барана, в селезёнке определяли на пике иммунного ответа через 5 дней после иммунизации крыс при помощи прямого метода локального гемолиза по Cunningham [2]. Статистическую оценку осуществляли с помощью параметрических и непараметрических методов. Различия оценивали как значимые при p <0,05. В первой серии эксперимента было показано, что потомство крыс, перинатальное развитие которых происходило в условиях введения АГ T. gondii, оказалось менее жизнеспособным, чем в группе контроля: в течение 3 сут после рождения в первой и второй группах погибли 5 и 6 животных соответственно. Во второй серии эксперимента также наблюдалась гибель части потомства: 3 животных в первой группе и 1 животное во второй группе погибли на 1-3-и сутки. Вероятно, гибель животных связана со срывом функциональных возможностей незрелой иммунной системы в результате воздействия высоких доз АГ. Как у животных, рождённых от сенсибилизированных АГ T. gondii самок, так и у крысят, которым вводили АГ после рождения, в 2-месячном возрасте при ревизии брюшной полости было выявлено увеличение брыжеечных лимфатических узлов, образующих конгломераты в виде тяжей, расположенных вдоль кишечника. Селезёнка животных в первой и второй сериях экспериментов имела зернистую структуру, визуализировались фолликулы. Масса вилочковой железы у потомства сенcибилизированных самок была снижена (173,9±9,8 против 244,3±11,7 мг в группе контроля, р=0,002), а у крысят, которым АГ T. gondii был введён после рождения, не разнилась с контролем. Введение АГ T. gondii экспериментальным животным как в пренатальном, так и в раннем постнатальном периодах сопровождалось отсроченными изменениями показателей системы иммунитета 2-месячных крыс (табл. 1). Количество лейкоцитов у потомства крыс, развитие которых происходило в условиях внутриутробного действия АГ T. gondii, было в 1,4 раза выше, чем в группе контроля (р=0,009). Аналогичные отсроченные изменения зарегистрированы и у крысят, которым вводили АГ T. gondii после рождения. Количество лейкоцитов у них превышало значения в группе контроля в 1,5 раза (р=0,04), что было обусловлено 2,2-кратным увеличением количества нейтрофилов (р=0,001). Количество последних в крови крысят из второй группы было в 1,9 раза выше, чем в первой группе. При этом число моноцитов и базофилов в обеих экспериментальных группах соответствовало значениям в группе контроля, количество эозинофилов было в 1,4 раза (первая группа, р=0,01) и 2 раза (вторая группа, р=0,002) ниже в сравнении с группой контроля. Уменьшение содержания эозинофилов в крови отражает снижение резистентности организма к воздействию факторов внешней среды, что в сочетании с лейкоцитозом, обусловленным повышением количества нейтрофилов, является важным признаком активного воспаления. Полученные результаты согласуются с данными недавних исследований, показавших значительную роль нейтрофилов в синтезе интерферона γ, необходимого для реализации врождённого иммунитета к T. gondii [9]. Количество лимфоцитов в первой группе было сопоставимо со значениями, полученными в группе контроля. В отличие от этого при введении АГ T. gondii после рождения во второй группе регистрировалась относительная лимфопения с уменьшением показателей в 1,4 раза (р=0,04) по сравнению с группой контроля и в 1,3 раза (р=0,04) по сравнению с первой группой. При оценке популяции Т-клеток в крови и селезёнке у крыс из первой группы было выявлено уменьшение количества лимфоцитов CD3+ в крови на 20,1% (р=0,003) и в селезёнке на 22,6% (р=0,0004, см. табл. 1) в сравнении с группой контроля. При исследовании иммунологических показателей у животных второй группы отмечено уменьшение количества Т-лимфоцитов крови на 13,3% (р=0,01) и числа Т-лимфоцитов селезёнки на 14,8% (р=0,043) по сравнению с контрольными величинами. Следует отметить, что снижение количества лимфоцитов CD3+ в крови и селезёнке было более значимо в первой группе - при внутриутробном действии АГ T. gondii, составляя в крови 92,2%, в селезёнке - 90,8% показателей во второй группе. При оценке влияния АГ T. gondii, введённого в пренатальном и раннем постнатальном периодах, на гуморальный иммунный ответ к эритроцитам барана обнаружена депрессия специфического антителообразования, что проявлялось снижением числа антителообразующих клеток на пике первичного иммунного ответа у крысят первой группы на 27,9% (р=0,03). Количество антителообразующих клеток у крысят второй группы было снижено на 19,6% (р=0,04). Последствия действия АГ T. gondii на иммунную систему плода и новорождённого зарегистрированы у крысят на 60-е сутки постнатального онтогенеза. Они проявлялись лимфаденопатией, дисплазией вилочковой железы, структурными нарушениями селезёнки и уменьшением количества Т-лимфоцитов в ней, Т-лимфопенией, дисфункцией гуморального звена иммунитета с недостаточной генерацией антителообразующих клеток в ответ на тимусзависимые АГ. Аналогичные изменения иммунного гомеостаза (атрофия вилочковой железы, сочетанные иммунные нарушения в виде снижения количества фагоцитирующих клеток, уменьшения показателей Т-клеточного звена иммунитета с недостаточностью абсолютного содержания клеток CD3+ и CD4+) выявлены у детей, рождённых от женщин с токсоплазменной инфекцией [1]. Отсроченные нарушения неспецифических факторов защиты и адаптивного иммунитета у крысят при введении им АГ T. gondii в первые сутки после рождения реализовались нейтрофильным лейкоцитозом, эозинопенией, лимфопенией, депрессией клеточного и гуморального звеньев иммунитета. Следует отметить отсутствие дисплазии вилочковой железы у крысят при воздействии АГ T. gondii в пренатальном периоде, а также менее выраженное, с различием 7-9%, снижение количества Т-лимфоцитов в крови и селезёнке. Выявленные нарушения клеточного и гуморального звеньев иммунитета, сохраняющиеся длительное время после рождения, можно охарактеризовать как стадию декомпенсации адаптационных реакций иммунной системы и развитие вторичного иммунодефицитного состояния у крысят, подвергшихся действию АГ T. gondii как в пренатальном, так и в раннем постнатальном периодах. Подобные сдвиги в целом являются стереотипным ответом на введение АГ, проявляющимся поляризацией иммунного ответа по Th1-типу и завершающимся развитием иммунологической толерантности к АГ у плода [5] и новорождённого [6]. Обнаруженные нами отличия морфофункциональных характеристик иммунной системы у потомства крыс при воздействии АГ T. gondii в пренатальном и раннем постнатальном периодах, вероятно, связаны как с разной степенью зрелости иммунитета плода и новорождённого, так и с особенностями влияния данного АГ [3]. ВЫВОДЫ 1. Последствия действия антигена T. gondii на плод и новорождённую крысу проявляются вторичным иммунодефицитным состоянием, сохраняющимся на 60-е сутки онтогенеза. 2. Нарушения иммунитета у потомства крыс, рождённого от сенсибилизированных антигеном T. gondii в III триместре беременности самок, характеризуются лимфаденопатией, дисплазией вилочковой железы, уменьшением количества Т-лимфоцитов в селезёнке и крови, снижением гуморального иммунитета. 3. При введении антигена T. gondii в раннем постнатальном периоде отдалённые последствия его действия проявляются нейтрофильным лейкоцитозом, эозинопенией, лимфопенией, а также менее выраженными, чем при введении антигена T. gondii в пренатальном периоде, проявлениями депрессии клеточного и гуморального звеньев иммунитета. Таблица 1 Показатели системы крови и иммунитета у потомства крыс после ведения антигена T. gondii в пренатальном и раннем постнатальном периодах онтогенеза Показатель Группа контроля Экспериментальные группы Первая группа Вторая группа Лейкоциты, ×109/л 5,3±0,4 7,5±0,3* 7,7±0,4* Нейтрофилы, % 19,7±1,4 22,8±3,3 42,9±3,3*,** Моноциты, % 6,2 (4,2; 7,2) 5,4 (5,1; 7,2) 5,6 (5,2; 7,4) Эозинофилы, % 2,4±0,2 1,7±0,1* 1,2±0,1*,** Базофилы, % 1,7±0,2 2,3±0,8 2,2±0,4 Лимфоциты, % 68,9±1,8 65,3±2,0 49,7±2,4*,** Т-лимфоциты (CD3+) в крови, % 95,9±0,8 76,6±2,0* 83,1±0,6*,** Т-лимфоциты (CD3+) в селезёнке, % 81,3±1,9 62,9±2,9* 69,3±0,9*,** Антителообразующие клетки, ×103 58,1±3,2 41,9±2,9* 46,7±2,3* Примечание: M±m - для нормального распределения; Ме (1-й; 3-й квартили) - для распределения, отличающегося от нормального; статистическая значимость различий (p <0,05): *по отношению к группе контроля, **между экспериментальными группами.

About the authors

T F Sokolova

Omsk State Medical Academy, Omsk, Russia

D G Novikov

Omsk State Medical Academy, Omsk, Russia

Email: novikov.dm.omsk@gmail.com

A V Indutny

Omsk State Medical Academy, Omsk, Russia

References

Supplementary files