Change of acute stage reactants level in experimental intramedullary osteosynthesis

Full Text

Перелом и последующая репозиция становятся тяжелейшим стрессом для организма. Вся история развития остеосинтеза, начиная от Г. Кунчера и Г.А. Илизарова, была направлена на малую инвазивность, прочность фиксации и функциональность [1]. На протяжении последних 10 лет новое поколение погружного синтеза значительно снизило количество осложнений. В основе успехов лежит содружество травматологов и инженеров. При этом совершенствование как формы, так и принципов фиксации во многом зависит от качества материалов, используемых для изготовления имплантатов [2]. Их механические и биологические свойства во многом определяют формирование быстрой и прочной связи с окружающей тканью. Как основа, так и покрытие фиксаторов или других погружаемых в организм человека конструкций должны обеспечивать такие физические характеристики, как поверхностная твёрдость, устойчивость к коррозии, низкий коэффициент трения, износостойкость. В то же время существенное значение для успеха или неудачи имплантации имеет взаимодействие между устройством и окружающими тканями, биологическая толерантность [3]. Реактанты (или белки) острой фазы воспаления (РОФ) представляют собой гетерогенную группу из более 30 белков, вовлечённых в защитные и адаптационные реакции при повреждении тканей. Стрессорные факторы, такие как ишемия, воспаление, травма, оперативное вмешательство, инициируют понижение содержания отрицательных РОФ (альбумин) и повышение положительных РОФ (глобулины), причём продолжительность ответа зависит от интенсивности и продолжительности повреждения [4]. РОФ выполняют ингибиторную, медиаторную, транспортную, иммуномодулирующую функции, большинство из них представляют собой многофункциональные белки. Мониторирование их уровня служит признанным маркёром для характеристики патологии у человека и животных [7]. Целью настоящего исследования была оценка динамики белковых фракций плазмы крови как индикатора реакции организма на остеосинтез при использовании имплантатов из медицинской стали и стали с покрытием смесью нитридов титана и гафния. Проведение эксперимента, содержание животных и уход за ними соответствовали требованиям «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (1986). Экспериментальные исследования были проведены согласно ГОСТ ИСО (Р) 10 993 (п. 11, 12) и одобрены Локальным этическим комитетом при Казанском государственном медицинском университете (протокол №5 от 25 июня 2013 г.). Исследования были проведены на 30 кроликах обоего пола в возрасте 6-7 мес с массой тела 2526,5±74,4 г. Кроликов содержали в одинаковых условиях, на одинаковом рационе, согласно рекомендациям по кормлению и содержанию лабораторных животных, а также приказу Минздрава СССР №755 от 12.08.1977. Всем животным проводили открытую остеотомию большеберцовой кости в области средней и нижней третей диафиза с последующим ретроградным введением имплантата в костномозговой канал. В группе сравнения (15 животных) вводили спицы из медицинской стали 12ХI8H9Т, d×2 мм, в опытной группе (15 животных) - спицы из медицинской стали 12ХI8H9Т с биоинертным покрытием нитридами титана и гафния, d×2 мм. Для покрытия использован способ ионно-плазменного нанесения с электроннодуговым испарением (метод конденсации с ионной бомбардировкой). Поскольку толщина покрытия находилась в пределах 10-3 мкм, его можно отнести к разряду нанопокрытий. Взятие крови осуществляли венепункцией до операции, на 1-е, 5-е 10-е, 20-е, 30-е, 60-е и 180-е сутки после оперативного вмешательства. Применяли вакуумные пробирки IMPROVE с гелем-активатором свёртывания крови. Разделение белков сыворотки крови проводили методом электрофореза на ацетатцеллюлозе с использованием вероналового буферного раствора (pH=8,6). В послеоперационном периоде нами не было выявлено каких либо осложнений в зоне оперативного вмешательства, что было подтверждено морфологическими исследованиями. Реактивные морфологические преобразования определяли на 10-е, 30-е, 60-е и 180-е сутки течения опыта. Для морфологических исследований проводили изъятие подколенных лимфатических узлов, кожи и подкожной клетчатки, частично мышц в зоне непосредственного контакта со спицей в проксимальном участке большеберцовой кости и в области операционной раны (над зоной перелома). Полученный материал обрабатывается и планируется к публикации в дальнейшем. За период исследования констатирована гибель трёх животных из группы сравнения на сроках от 160 до 180 сут эксперимента. Было проведено патологоанатомическое исследование. Патологических очагов выявлено не было. Обработку полученных данных производили с использованием программы «Image Master 1D Gel Analysis v3.0». Статистическую обработку данных проводили с применением пакета программ «SPSS» версия 13. Для наглядности использовали построение графических диаграмм статистических величин. Вычисляли среднее арифметическое выборочное значение показателя (М), стандартную ошибку среднего арифметического значения (m) по каждой из сравниваемых величин с определением достоверности различий (p) по методу Стьюдента-Фишера. Уровень общего белка сыворотки крови в ходе эксперимента в обеих группах животных не выходил за пределы видовой физиологической нормы для кроликов (54-75 г/л, табл. 1). Выявлено достоверное снижение содержания альбумина (по сравнению с нормой для кроликов - 23,65-38,35 г/л) у животных обеих групп на 5-е сутки после оперативного вмешательства (группа сравнения - р=0,001; опытная группа - р=0,012). Более выраженным оно было в группе сравнения (р=0,002). К 10-м суткам у животных опытной группы значения возвращались к таковыми до операции, а у животных группы сравнения это происходило лишь к 30-м суткам (табл. 2). На 5-е сутки после операции зарегистрировано достоверное повышение содержания α-глобулинов (по сравнению с нормой - 3,44-7,08 г/л) у животных обеих групп, причём в группе сравнения (р=0,001) оно было более выражено. У животных опытной группы уровень α-глобулинов достоверно снижался к 20-м суткам, а в группе сравнения - лишь к 30-м. В состав α-глобулиновой фракции входят такие РОФ, как ингибиторы протеаз α1-антитрипсин и α2-макроглобулин, антиоксиданты церулоплазмин и гаптоглобин. Каждый из них участвует в ограничении процессов вторичной альтерации на участке повреждения, и повышение их уровня свидетельствует о реализации защитного ответа организма, который в наших экспериментах оказался продолжительнее в группе сравнения (табл. 3). Фракция β-глобулинов имеет два пика электрофореграммы: β1, содержащий преимущественно трансферрин, и β2, в состав которого входят β-липопротеины, иммуноглобулин А (IgA), IgM, иногда IgG и белки комплемента [6]. В наших экспериментах мы не наблюдали статистически значимого изменения уровня β1-глобулинов. Отмечена лишь тенденция к повышению этой фракции на протяжении всего опыта у животных обеих групп по сравнению со значениями до операции (табл. 4). Что касается фракции β2-глобулинов, то их уровень повышался на 5-е сутки у животных обеих групп. В опытной группе рост был достоверным (р=0,044), и значения вернулись к дооперационным показателям к 60-м суткам (р=0,019). В группе сравнения также была тенденция к повышению содержания β2-фракции, но не имевшая статистической значимости (табл. 5). Характерно, что мы также наблюдали вторую волну подъёма уровня β2-глобулинов к 180-м суткам (р=0,01) в обеих группах животных, и вновь она была статистически значима в опытной группе. Этот факт, на наш взгляд, следует рассматривать в связи с динамикой фракции γ-глобулинов, поскольку, как было указано выше, β2-глобулины содержат в своем составе IgA, IgM и (частично) IgG. Уровень γ-глобулинов (норма для кроликов - 7,31-13,57 г/л) достоверно повышался к 180-м суткам в обеих группах (контрольная группа - р=0,0001, опытная группа - р=0,012; табл. 6). Подъём был более выражен в группе сравнения, значимое различие между животными разных групп наблюдалось на 10-е (р=0,008), 30-е (р=0,02) и 60-е (р=0,015) сутки. Фракция γ-глобулинов содержит преимущественно IgG, и её повышение отражает мобилизацию специфических иммунных защитных механизмов. ВЫВОДЫ 1. На фоне неизменного уровня общего белка после перенесённой травмы и развития процесса регенерации мы наблюдали характерную для ответа острой фазы диспротеинемию - изменение соотношения белковых фракций крови. Выявлено две «волны» реакции. Первая развивалась к 5-м суткам и характеризовалась снижением уровня альбуминов и повышением содержания α- и β2-глобулинов, эта реакция затухала в опытной группе раньше, чем в группе сравнения. Вторая развивалась к 180-м суткам и характеризовалась повышением концентрации β2- и γ-глобулинов. 2. Наблюдаемые сдвиги соответствовали фазам раннего неспецифического ответа, включающего усиление синтеза положительных и снижение образования отрицательных реактантов острой фазы воспаления печенью под влиянием цитокинов, а также более позднему специфическому адаптивному иммунному ответу. 3. В целом интенсивность реакций в опытной группе была меньше, чем в группе сравнения. Более продолжительное снижение уровня альбуминов и выраженный рост содержания γ-глобулинов в группе сравнения свидетельствуют о меньшем повреждающем стимуле при использовании имплантатов с покрытием нитридами титана и гафния. Таблица 1 Содержание общего белка сыворотки крови (г/л) Группы животных До операции 5-е сутки 10-е сутки 20-е сутки 30-е сутки 60-е сутки 180-е сутки Сравнения 63,34±0,94 50,68±5,03 64,51±1,99 65,59±2,08 63,95±2,09 66,23±1,88 70,29±3,64 Опытная 57,12±0,79 56,20±1,04 61,74±1,30 60,21±1,75 61,27±1,09 58,84±0,68 68,80±4,13 Таблица 2 Содержание альбумина в сыворотке крови (г/л) Группы животных До операции 5-е сутки 10-е сутки 20-е сутки 30-е сутки 60-е сутки 180-е сутки Сравнения 43,02±0,61*** 23,77±1,46 36,56±0,90*** 35,50±0,79*** 39,26±1,22*** 40,56±0,60*** 39,35±3,12*** Опытная 38,87±0,75* 31,34±0,88 37,79±0,94 35,44±2,67 39,92±1,24** 39,27±1,06** 41,59±1,12*** Примечание. Статистическая значимость различий с показателями 5-х суток: *р <0,05; **р <0,01; ***р <0,001. Таблица 3 Содержание α-глобулинов в сыворотке крови (г/л) Группы животных До операции 5-е сутки 10-е сутки 20-е сутки 30-е сутки 60-е сутки 180-е сутки Сравнения 4,42±0,17*** 9,19±1,09 6,84±0,86 6,94±0,47 5,51±0,47* 5,81±0,56* 4,81±0,01* Опытная 3,95±0,30*** 7,34±0,28 6,49±0,61^ 5,05±0,18** 4,93±0,15** 4,49±0,24*** 5,30±0,65* Примечание. Статистическая значимость различий с показателями 5-х суток: *р <0,05; **р <0,01; ***р <0,001; с показателями 60-х суток: ^р <0,05. Таблица 4 Содержание β1-глобулинов в сыворотке крови (г/л) Группы животных До операции 5-е сутки 10-е сутки 20-е сутки 30-е сутки 60-е сутки 180-е сутки Сравнения 5,68±0,60 6,60±1,04 8,50±0,61 8,72±1,03 7,26±0,46 7,62±0,84 7,46±0,12 Опытная 5,27±0,21 6,30±0,34 7,60±0,61 7,44±0,59 7,07±0,55 6,23±0,33 6,44±0,67 Таблица 5 Содержание β2-глобулинов в сыворотке крови (г/л) Группы животных До операции 5-е сутки 10-е сутки 20-е сутки 30-е сутки 60-е сутки 180-е сутки Сравнения 2,48±0,13 3,49±0,47 3,09±0,33 3,12±0,23 2,49±0,23 2,02±0,16* 3,10±0,14 Опытная 1,91±0,11* 3,64±0,39 3,01±0,28 2,46±0,26 2,23±0,24^ 1,87±0,25 3,98±0,72 Примечание. Статистическая значимость различий с показателями 5-х суток: *р <0,05; **р <0,01; ***р <0,001; с показателями 180-х суток: ^р <0,05. Таблица 6 Содержание γ-глобулинов (г/л) Группы животных До операции 5-е сутки 10-е сутки 20-е сутки 30-е сутки 60-е сутки 180-е сутки Сравнения 7,61±0,30 7,59±1,46 9,52±0,54 10,83±0,61 8,91±0,48+ 9,84±0,64 15,57±0,55*** Опытная 6,96±0,33 7,27±0,26 6,85±0,53 9,77±1,12 7,12±0,39 6,96±0,68 11,49±1,58* Примечание. Статистическая значимость различий с дооперационными значениями: *р <0,05; **р <0,01; ***р <0,001.

About the authors

I F Akhtyamov

Kazan State Medical University, Kazan, Russia; Republican Clinical Hospital, Kazan, Russia

Email: yalta60@mail.ru

F V Shakirova

Bauman Kazan State Medical Academy of Veterinary Medicine, Kazan, Russia

L D Zubairova

Kazan State Medical University, Kazan, Russia

E B Gatina

Kazan State Medical University, Kazan, Russia; Republican Clinical Hospital, Kazan, Russia

E I Aliev

Kazan State Medical University, Kazan, Russia; Republican Clinical Hospital, Kazan, Russia

References

Supplementary files