The mechanisms of sensitization of gastrointestinal stromal tumor cells to DNA topoisomerase II inhibitors

Full Text

Гастроинтестинальные стромальные опухоли (ГИСО) представляют собой наиболее распространённые мезенхимальные опухоли желудочно-кишечного тракта, развивающиеся из интерстициальных клеток Кахаля, обладающих пейсмейкерной активностью и задающих ритм сокращений (перистальтики) полых органов желудочно-кишечного тракта [1]. Типичная локализация ГИСО — желудок (60–70%), тонкая кишка (25–35%), толстая и прямая кишка (5%). В редких случаях опухоль может быть расположена в пищеводе, брыжейке, сальнике, забрюшинном пространстве.

Основные патогенетические механизмы ГИСО — активирующие мутации с-KIT или PDFRA (мутации взаимоисключающие), приводящие к гиперактивации вышеуказанных тирозинкиназных рецепторов, что в свою очередь обусловливает высокую пролиферативную активность трансформированных клеток и их устойчивость к программированной клеточной гибели (апоптозу) [2–4]. Вышеуказанные мутации выявляются в подавляющем числе (до 85–90%) случаев ГИСО, поэтому данное заболевание в настоящее время является одним из ярких примеров успешного использования таргетных препаратов в практичес­кой онкологии.

В качестве первой линии терапии пациентов с ГИСО используют таргетный препарат иматиниб (иматиниба мезилат, гливек), являющийся ингибитором вышеназванных тирозинкиназных рецепторов. Воздействие препарата на клетки ГИСО существенно замедляет скорость их пролиферации и вызывает последующую гибель по механизму апоптоза. Тем не менее, несмотря на изначально высокую терапевтическую эффективность иматиниба, через определённый промежуток времени (1,5–2 года) после начала проведения таргетной терапии более чем у 50% пациентов с неоперабельными, метастатическими и рецидивирующими формами ГИСО развивается резистентность к иматинибу, обусловленная возникновением вторичных мутаций вышеописанных тирозинкиназных рецепторов, а также активацией других типов рецепторных и нерецепторных тирозин­-
киназ [5–7].

После развития резистентности ГИСО к иматинибу данным пациентам назначают таргетные препараты второй и третьей линий — сунитиниб (сутент) и регорафениб (стиварга) соответственно. Тем не менее, их применение сопряжено с развитием ряда тяжёлых побочных эффектов и также сопровождается развитием резистентности [8–10]. Попытки использования ингибиторов тирозинкиназ нового поколения (нилотиниба, масатиниба, сорафениба, пазопаниба, довитиниба и др.) в терапии пациентов с иматиниб-резистентными ГИСО не внесли существенных изменений в характер течения заболевания и его прогноз [11].

Таким образом, несмотря на многообещающие результаты, достигнутые на начальном этапе проведения таргетной терапии больным с ГИСО, неуклонное развитие резистентности опухоли к данным препаратам и относительно высокая частота побочных эффектов от их применения становятся основными факторами неблагоприятного прогноза у пациентов с неоперабельными и метастатическими формами ГИСО.

В настоящее время точку зрения об эффективности химиотерапии в лечении больных с ГИСО подвергают активному пересмотру. Несмотря на тот факт, что в течение долгого времени существовало общепринятое мнение о химиорезистентности ГИСО, результаты исследований последних лет (в том числе и нашей научной группы) показали, что отдельные химиопрепараты могут быть эффективными в отношении ГИСО как in vitro, так и in vivo [12, 13]. Было также показано, что ингибиторы ДНК-топоизомеразы II типа (доксорубицин, этопозид), а также препараты, влияющие на динамическое состояние микротрубочек веретена деления (винбластин, паклитаксел), способны оказывать цитостатический и проапоптотический эффекты в отношении различных клеточных линий ГИСО [14, 15]. Было также обнаружено, что таргетный препарат иматиниб обладает способностью повышать чувствительность клеток ГИСО к действию ингибиторов ДНК-топоизомеразы II типа [16, 17].

В связи с вышеизложенным целью настоящего исследования было комплексное изучение способности препаратов, ингибирующих активность рецепторных и нерецепторных тирозинкиназ, вызывать сенситизацию клеток ГИСО к действию ингибиторов ДНК-топоизомеразы II типа. Объектом исследования стал иматиниб-резистентный субклон линии ГИСО T1-R, полученный в нашей лаборатории [18]. Способность вызывать сенситизацию клеток ГИСО к ингибиторам ДНК-топоизомеразы II типа оценивали в отношении следующих препаратов:
1) иматиниба, ингибитора Bcr-Abl тирозинкиназы, а также с-KIT, используемого в терапии пациентов с хроническим миелолейкозом и ГИСО;
2) кризотиниба, селективного ингибитора рецепторных тирозинкиназ, в том числе киназы анапластической лимфомы (АLK) и её онкогенных вариантов (то есть продуктов слияния ALK и отдельных её мутаций), а также ингибитора рецепторов фактора роста гепатоцитов (HGFR, с-MET, представителей семейства рецепторных тирозинкиназ); в настоящее время препарат разрешён к применению у пациентов с ALK-позитивным немелкоклеточным раком лёгкого;
3) сунитиниба, основной мишенью которого являются α- и β-рецепторы тромбоцитарного фактора роста (PDGFR), фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR-1, VEGFR-2 и VEGFR-3), фактора стволовых клеток (KIT), Fms-подобной тирозинкиназы-3 (FLT-3), колониестимулирующего фактора (CSF-1R) и нейротрофического глиального фактора (RET); в настоящее время данный препарат используют для терапии пациентов с ГИСО после развившейся резистентности к иматинибу, при распространённом и/или метастатическом почечно-клеточном раке, а также неоперабельных или метастатических нейроэндокринных опухолях поджелудочной железы;
4) кабозантиниба, неселективного ингибитора достаточно большого количества киназ (МЕТ, VEGF, RET, KIT, Flt-1/3/4, Tie2 и AXL), используемого в настоящее время для терапии пациентов с метастатической или неоперабельной карциномой щитовидной железы, а также гепатоцеллюлярной и почечно-клеточной карциномы.

Клетки ГИСО культивировали в стандартных условиях (37 °С, 5% СО2) в среде RPMI-1640 с добавлением L-глутамина, пенициллина и стрептомицина (все реагенты — ПанЭко, Россия), а также 15% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США). Клетки преинкубировали с одним из ингибиторов тирозинкиназ (иматиниб, кризотиниб, кабозантиниб, сунитиниб) в течение 12 ч. Далее к клеточным культурам добавляли ингибитор ДНК-топоизомеразы II типа доксорубицин.

Чувствительность опухолевых клеток к доксорубицину оценивали колориметрическим методом (MTS-тест) с помощью реагента CellTiter 96® AQueous MTS Reagent Powder (Promega, США) на планшетном анализаторе Multiscan FC (Thermo Scientific, США) при длине волны 492 нм. Уровень экспрессии белков, служащих маркёрами апоптоза, а также репарации повреждений ДНК, оценивали методом иммуноблоттинга с использованием соответствующих моноклональных антител. Оценку пролиферативного потенциала клеток проводили в режиме реального времени с использованием прибора iCELLigence (ACEA Biosciences Inc., США).

Полученные данные обрабатывали с помощью компьютерных программ Microsoft Excel 2007 и Biostatistica (S.A. Glantz, McGraw Hill, США). Использовали метод однофакторного дисперсионного анализа. Для оценки достоверности различий изучаемых выборок применяли t-критерий Стьюдента. При р <0,05 различия считали статистически значимыми.

Результаты проведённых экспериментов свидетельствуют о том, что ингибиторы тирозинкиназ (кризотиниб, кабозантиниб, сунитиниб) обладали способностью снижать пролиферативную активность иматиниб-резистентных клеток ГИСО только при ­использовании в ­комбинации с ингибитором ДНК-топоизомеразы II типа доксорубицином (рис. 1).

Рис. 1. Ингибиторы рецепторных тирозинкиназ (иматиниб — ИМ, кризотиниб — КР, кабозатиниб — КБ, сунитиниб — СУ) снижают скорость пролиферации клеток гастроинтестинальных стромальных опухолей T1-R при их совместном культивировании с ингибитором ДНК-топоизомеразы II типа доксорубицином (Д)

Интересен, на наш взгляд, тот факт, что иматиниб был также эффективен в отношении иматиниб-резистентных клеточных линий, вызывая их сенситизацию к доксорубицину (см. рис. 1, А). Следовательно, данный эффект иматиниба не был следствием его способности ингибировать активность рецепторной тирозинкиназы с-KIT. Ожидаемо доксорубицин оказывал умеренный антипролиферативный эффект в отношении клеток ГИСО.

Результаты колориметрического MTS-­теста (рис. 2, А) показали, что значимое снижение жизнеспособности опухолевых клеток ГИСО отмечалось только в присутствии комбинации ингибитора тирозинкиназ с доксорубицином. К примеру, количество жизнеспособных клеток ГИСО, культивированных в течение 72 ч в присутствии комбинации кризотиниба и доксорубицина, не превышало 20%. В то же ­время каждый из препаратов, использованных в отдельности, обладал значительно меньшей цитотоксичностью в отношении иматиниб-резистентных клеток ГИСО (см. рис. 2, А).

Рис. 2. Изучение способности доксорубицина (Д) и кризотиниба (КР) вызывать повреждения ДНК и индуцировать гибель по механизму апоптоза клеток гастроинтестинальных стромальных опухолей T1-R. (A) Жизнеспособность клеток, оцениваемая колориметрическим MTS-тестом; ***р <0,001. (Б, В) Экспрессия маркёров апоптоза — расщеплённых форм каспазы-3 и поли(АДФ)-рибоза-полимеразы (ПАРП); маркера двунитевых разрывов ДНК — рН2АХ; рекомбиназы Rad51, участвующей в процессах гомологичной рекомбинации. Актин отражает уровень белковой нагрузки в исследуемых образцах. (Г) Количественные показатели уровней экспрессии маркёров апоптоза в образцах, представленных на рис. 2B

Основной механизм гибели клеток ГИСО, культивированных в присутствии комбинации кризотиниба и доксорубицина, — апо­птоз, о чём свидетельствовало повышение уровней экспрессии расщеплённых форм каспазы-3 и поли(АДФ)-рибоза-полимеразы (ПАРП), служащих, как известно, традиционными маркёрами программированной клеточной гибели (рис. 2, В, Г). Важно отметить, что комбинированное воздействие вышеуказанных препаратов на клетки ГИСО приводило к значительному увеличению уровня экспрессии гистона 2А, фосфорилированного по остаткам серина в положении 139, являющегося общепризнанным маркёром двунитевых разрывов ДНК (рис. 2, Б). В присутствии кризотиниба у клеток ГИСО снижался уровень экспрессии рекомбиназы Rad51 — белка, участвующего в репарации двунитевых разрывов ДНК по механизму ­гомологичной рекомбинации. Следовательно, апоптоз клеток ГИСО, индуцированный комбинацией кризотиниба и доксорубицина, возникал вследствие двунитевых разрывов ДНК (эффект доксорубицина), а также из-за нарушений механизмов репарации этих повреждений (эффект кризотиниба).

Аналогичные закономерности были выявлены в клетках ГИСО, культивированных с иматинибом, кабозатинибом и сунитинибом, подтверждая предположение о том, что ингибиторы рецепторных тирозинкиназ могут вызывать сенситизацию опухолевых клеток к ДНК-повреждающим соединениям (химиопрепаратам) по единому механизму, мало зависящему от типа ингибируемых рецепторных тирозинкиназ. Общность молекулярных механизмов действия данных ингибиторов рецепторных тирозинкиназ заключается в их способности нарушать в опухолевых клетках процессы репарации повреждений ДНК и вызывать тем самым сенситизацию клеток к действию ДНК-повреждающих агентов, в частности ингибиторов ДНК-топоизомеразы II типа.

Полученные нами факты коррелируют с результатами ряда зарубежных научных исследований. К примеру, результаты исследований, проведённых T. Tanaka и соавт., показали способность гефитиниба (ирессы), являющегося ингибитором рецепторов эпидермального фактора роста EGFR, ингибировать процессы репарации повреждений ДНК и приводить тем самым к радиосенситизации опухолевых клеток [19].

Ингибирование процессов репарации повреждений ДНК по механизму негомологичного связывания концов было также обнаружено в опухолевых клетках при воздействии на них цетуксимаба (эрбитукса), оно приводило к аналогичным последствиям, ­повышая ­чувствительность опухолевых клеток к ионизирующему излучению [20].

Результаты проведённых нами ранее исследований иллюстрируют способность ингибиторов FGF-сигнального пути (BGJ398) вызывать сенситизацию клеток ГИСО к действию химиопрепаратов [21].

Вышеизложенное свидетельствует о важной роли рецепторных тирозинкиназ в регуляции процессов репарации повреждений ДНК и открывает перспективы для их применения, обусловленные их способностью вызвать радио- и химиосенситизацию злокачественных новообразований, в том числе резистентных к используемым в настоящее время таргетным препаратам.

Вывод

Ингибиторы рецепторных тирозинкиназ с различным механизмом действия вызывают сенситизацию иматиниб-резистентных клеток гастроинтестинальных стромальных опухолей к химиопрепаратам (ингибиторам ДНК-топо­изомеразы II типа) за счёт угнетения процессов репарации повреждений ДНК по механизму гомологичной рекомбинации.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант №17-04-00158).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

About the authors

P D Dunaev

Author for correspondence.
Email: boichuksergei@mail.ru
Kazan, Russia

A R Galembikova

Email: boichuksergei@mail.ru
Kazan, Russia

S V Boichuk

Email: boichuksergei@mail.ru
Kazan, Russia

References

Supplementary files