The mechanisms of sensitization of gastrointestinal stromal tumor cells to DNA topoisomerase II inhibitors

Cover Page

Abstract


Aim. To examine the ability of receptor tyrosine kinase inhibitors to modulate gastrointestinal stromal tumor cells sensitivity to DNA topoisomerase II inhibitors.

Methods. The following receptor tyrosine kinase inhibitors were used in the present study - imatinib, crizotinib, cabozantinib and sunitinib. An ability of the named medications to sensitize gastrointestinal stromal tumor cells to DNA topoisomerase II inhibitor (doxorubicin) was examined by using an MTS-based colorimetric assay. The expression of apoptotic, DNA damage and repair markers was assessed with western blotting by using the corresponding monoclonal antibodies. Proliferative activity was examined in a real-time by utilizing an iCELLigence system (ACEA Biosciences Inc., USA).

Results. We found that all above-mentioned receptor tyrosine kinase inhibitors were able to sensitize gastrointestinal stromal tumor cells to topoisomerase II inhibitors. This leads to the decrease of proliferative activity of tumors cells and enhancement of apoptotic cell death. Importantly, this effect was observed in imatinib-resistant gastrointestinal stromal tumor cells. One of the possible molecular mechanisms responsible for sensitization of these cells to topoisomerase II inhibitors was the ability of the target medications to inhibit the homologous recombination. This is evidenced by substantial decrease of Rad51 recombinase expression as a result of receptor tyrosine kinase inhibitor effect on the cells with DNA damage caused by topoisomerase II inhibitors.

Conclusion. Receptor tyrosine kinase inhibitors are able to sensitize imatinib-resistant gastrointestinal stromal tumor cells to topoisomerase II inhibitors by inhibiting DNA homologous recombination.


Гастроинтестинальные стромальные опухоли (ГИСО) представляют собой наиболее распространённые мезенхимальные опухоли желудочно-кишечного тракта, развивающиеся из интерстициальных клеток Кахаля, обладающих пейсмейкерной активностью и задающих ритм сокращений (перистальтики) полых органов желудочно-кишечного тракта [1]. Типичная локализация ГИСО — желудок (60–70%), тонкая кишка (25–35%), толстая и прямая кишка (5%). В редких случаях опухоль может быть расположена в пищеводе, брыжейке, сальнике, забрюшинном пространстве.

Основные патогенетические механизмы ГИСО — активирующие мутации с-KIT или PDFRA (мутации взаимоисключающие), приводящие к гиперактивации вышеуказанных тирозинкиназных рецепторов, что в свою очередь обусловливает высокую пролиферативную активность трансформированных клеток и их устойчивость к программированной клеточной гибели (апоптозу) [2–4]. Вышеуказанные мутации выявляются в подавляющем числе (до 85–90%) случаев ГИСО, поэтому данное заболевание в настоящее время является одним из ярких примеров успешного использования таргетных препаратов в практичес­кой онкологии.

В качестве первой линии терапии пациентов с ГИСО используют таргетный препарат иматиниб (иматиниба мезилат, гливек), являющийся ингибитором вышеназванных тирозинкиназных рецепторов. Воздействие препарата на клетки ГИСО существенно замедляет скорость их пролиферации и вызывает последующую гибель по механизму апоптоза. Тем не менее, несмотря на изначально высокую терапевтическую эффективность иматиниба, через определённый промежуток времени (1,5–2 года) после начала проведения таргетной терапии более чем у 50% пациентов с неоперабельными, метастатическими и рецидивирующими формами ГИСО развивается резистентность к иматинибу, обусловленная возникновением вторичных мутаций вышеописанных тирозинкиназных рецепторов, а также активацией других типов рецепторных и нерецепторных тирозин­-
киназ [5–7].

После развития резистентности ГИСО к иматинибу данным пациентам назначают таргетные препараты второй и третьей линий — сунитиниб (сутент) и регорафениб (стиварга) соответственно. Тем не менее, их применение сопряжено с развитием ряда тяжёлых побочных эффектов и также сопровождается развитием резистентности [8–10]. Попытки использования ингибиторов тирозинкиназ нового поколения (нилотиниба, масатиниба, сорафениба, пазопаниба, довитиниба и др.) в терапии пациентов с иматиниб-резистентными ГИСО не внесли существенных изменений в характер течения заболевания и его прогноз [11].

Таким образом, несмотря на многообещающие результаты, достигнутые на начальном этапе проведения таргетной терапии больным с ГИСО, неуклонное развитие резистентности опухоли к данным препаратам и относительно высокая частота побочных эффектов от их применения становятся основными факторами неблагоприятного прогноза у пациентов с неоперабельными и метастатическими формами ГИСО.

В настоящее время точку зрения об эффективности химиотерапии в лечении больных с ГИСО подвергают активному пересмотру. Несмотря на тот факт, что в течение долгого времени существовало общепринятое мнение о химиорезистентности ГИСО, результаты исследований последних лет (в том числе и нашей научной группы) показали, что отдельные химиопрепараты могут быть эффективными в отношении ГИСО как in vitro, так и in vivo [12, 13]. Было также показано, что ингибиторы ДНК-топоизомеразы II типа (доксорубицин, этопозид), а также препараты, влияющие на динамическое состояние микротрубочек веретена деления (винбластин, паклитаксел), способны оказывать цитостатический и проапоптотический эффекты в отношении различных клеточных линий ГИСО [14, 15]. Было также обнаружено, что таргетный препарат иматиниб обладает способностью повышать чувствительность клеток ГИСО к действию ингибиторов ДНК-топоизомеразы II типа [16, 17].

В связи с вышеизложенным целью настоящего исследования было комплексное изучение способности препаратов, ингибирующих активность рецепторных и нерецепторных тирозинкиназ, вызывать сенситизацию клеток ГИСО к действию ингибиторов ДНК-топоизомеразы II типа. Объектом исследования стал иматиниб-резистентный субклон линии ГИСО T1-R, полученный в нашей лаборатории [18]. Способность вызывать сенситизацию клеток ГИСО к ингибиторам ДНК-топоизомеразы II типа оценивали в отношении следующих препаратов:
1) иматиниба, ингибитора Bcr-Abl тирозинкиназы, а также с-KIT, используемого в терапии пациентов с хроническим миелолейкозом и ГИСО;
2) кризотиниба, селективного ингибитора рецепторных тирозинкиназ, в том числе киназы анапластической лимфомы (АLK) и её онкогенных вариантов (то есть продуктов слияния ALK и отдельных её мутаций), а также ингибитора рецепторов фактора роста гепатоцитов (HGFR, с-MET, представителей семейства рецепторных тирозинкиназ); в настоящее время препарат разрешён к применению у пациентов с ALK-позитивным немелкоклеточным раком лёгкого;
3) сунитиниба, основной мишенью которого являются α- и β-рецепторы тромбоцитарного фактора роста (PDGFR), фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR-1, VEGFR-2 и VEGFR-3), фактора стволовых клеток (KIT), Fms-подобной тирозинкиназы-3 (FLT-3), колониестимулирующего фактора (CSF-1R) и нейротрофического глиального фактора (RET); в настоящее время данный препарат используют для терапии пациентов с ГИСО после развившейся резистентности к иматинибу, при распространённом и/или метастатическом почечно-клеточном раке, а также неоперабельных или метастатических нейроэндокринных опухолях поджелудочной железы;
4) кабозантиниба, неселективного ингибитора достаточно большого количества киназ (МЕТ, VEGF, RET, KIT, Flt-1/3/4, Tie2 и AXL), используемого в настоящее время для терапии пациентов с метастатической или неоперабельной карциномой щитовидной железы, а также гепатоцеллюлярной и почечно-клеточной карциномы.

Клетки ГИСО культивировали в стандартных условиях (37 °С, 5% СО2) в среде RPMI-1640 с добавлением L-глутамина, пенициллина и стрептомицина (все реагенты — ПанЭко, Россия), а также 15% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США). Клетки преинкубировали с одним из ингибиторов тирозинкиназ (иматиниб, кризотиниб, кабозантиниб, сунитиниб) в течение 12 ч. Далее к клеточным культурам добавляли ингибитор ДНК-топоизомеразы II типа доксорубицин.

Чувствительность опухолевых клеток к доксорубицину оценивали колориметрическим методом (MTS-тест) с помощью реагента CellTiter 96® AQueous MTS Reagent Powder (Promega, США) на планшетном анализаторе Multiscan FC (Thermo Scientific, США) при длине волны 492 нм. Уровень экспрессии белков, служащих маркёрами апоптоза, а также репарации повреждений ДНК, оценивали методом иммуноблоттинга с использованием соответствующих моноклональных антител. Оценку пролиферативного потенциала клеток проводили в режиме реального времени с использованием прибора iCELLigence (ACEA Biosciences Inc., США).

Полученные данные обрабатывали с помощью компьютерных программ Microsoft Excel 2007 и Biostatistica (S.A. Glantz, McGraw Hill, США). Использовали метод однофакторного дисперсионного анализа. Для оценки достоверности различий изучаемых выборок применяли t-критерий Стьюдента. При р <0,05 различия считали статистически значимыми.

Результаты проведённых экспериментов свидетельствуют о том, что ингибиторы тирозинкиназ (кризотиниб, кабозантиниб, сунитиниб) обладали способностью снижать пролиферативную активность иматиниб-резистентных клеток ГИСО только при ­использовании в ­комбинации с ингибитором ДНК-топоизомеразы II типа доксорубицином (рис. 1).

 

Рис. 1. Ингибиторы рецепторных тирозинкиназ (иматиниб — ИМ, кризотиниб — КР, кабозатиниб — КБ, сунитиниб — СУ) снижают скорость пролиферации клеток гастроинтестинальных стромальных опухолей T1-R при их совместном культивировании с ингибитором ДНК-топоизомеразы II типа доксорубицином (Д)

 

Интересен, на наш взгляд, тот факт, что иматиниб был также эффективен в отношении иматиниб-резистентных клеточных линий, вызывая их сенситизацию к доксорубицину (см. рис. 1, А). Следовательно, данный эффект иматиниба не был следствием его способности ингибировать активность рецепторной тирозинкиназы с-KIT. Ожидаемо доксорубицин оказывал умеренный антипролиферативный эффект в отношении клеток ГИСО.

Результаты колориметрического MTS-­теста (рис. 2, А) показали, что значимое снижение жизнеспособности опухолевых клеток ГИСО отмечалось только в присутствии комбинации ингибитора тирозинкиназ с доксорубицином. К примеру, количество жизнеспособных клеток ГИСО, культивированных в течение 72 ч в присутствии комбинации кризотиниба и доксорубицина, не превышало 20%. В то же ­время каждый из препаратов, использованных в отдельности, обладал значительно меньшей цитотоксичностью в отношении иматиниб-резистентных клеток ГИСО (см. рис. 2, А).

 

Рис. 2. Изучение способности доксорубицина (Д) и кризотиниба (КР) вызывать повреждения ДНК и индуцировать гибель по механизму апоптоза клеток гастроинтестинальных стромальных опухолей T1-R. (A) Жизнеспособность клеток, оцениваемая колориметрическим MTS-тестом; ***р <0,001. (Б, В) Экспрессия маркёров апоптоза — расщеплённых форм каспазы-3 и поли(АДФ)-рибоза-полимеразы (ПАРП); маркера двунитевых разрывов ДНК — рН2АХ; рекомбиназы Rad51, участвующей в процессах гомологичной рекомбинации. Актин отражает уровень белковой нагрузки в исследуемых образцах. (Г) Количественные показатели уровней экспрессии маркёров апоптоза в образцах, представленных на рис. 2B

 

Основной механизм гибели клеток ГИСО, культивированных в присутствии комбинации кризотиниба и доксорубицина, — апо­птоз, о чём свидетельствовало повышение уровней экспрессии расщеплённых форм каспазы-3 и поли(АДФ)-рибоза-полимеразы (ПАРП), служащих, как известно, традиционными маркёрами программированной клеточной гибели (рис. 2, В, Г). Важно отметить, что комбинированное воздействие вышеуказанных препаратов на клетки ГИСО приводило к значительному увеличению уровня экспрессии гистона 2А, фосфорилированного по остаткам серина в положении 139, являющегося общепризнанным маркёром двунитевых разрывов ДНК (рис. 2, Б). В присутствии кризотиниба у клеток ГИСО снижался уровень экспрессии рекомбиназы Rad51 — белка, участвующего в репарации двунитевых разрывов ДНК по механизму ­гомологичной рекомбинации. Следовательно, апоптоз клеток ГИСО, индуцированный комбинацией кризотиниба и доксорубицина, возникал вследствие двунитевых разрывов ДНК (эффект доксорубицина), а также из-за нарушений механизмов репарации этих повреждений (эффект кризотиниба).

Аналогичные закономерности были выявлены в клетках ГИСО, культивированных с иматинибом, кабозатинибом и сунитинибом, подтверждая предположение о том, что ингибиторы рецепторных тирозинкиназ могут вызывать сенситизацию опухолевых клеток к ДНК-повреждающим соединениям (химиопрепаратам) по единому механизму, мало зависящему от типа ингибируемых рецепторных тирозинкиназ. Общность молекулярных механизмов действия данных ингибиторов рецепторных тирозинкиназ заключается в их способности нарушать в опухолевых клетках процессы репарации повреждений ДНК и вызывать тем самым сенситизацию клеток к действию ДНК-повреждающих агентов, в частности ингибиторов ДНК-топоизомеразы II типа.

Полученные нами факты коррелируют с результатами ряда зарубежных научных исследований. К примеру, результаты исследований, проведённых T. Tanaka и соавт., показали способность гефитиниба (ирессы), являющегося ингибитором рецепторов эпидермального фактора роста EGFR, ингибировать процессы репарации повреждений ДНК и приводить тем самым к радиосенситизации опухолевых клеток [19].

Ингибирование процессов репарации повреждений ДНК по механизму негомологичного связывания концов было также обнаружено в опухолевых клетках при воздействии на них цетуксимаба (эрбитукса), оно приводило к аналогичным последствиям, ­повышая ­чувствительность опухолевых клеток к ионизирующему излучению [20].

Результаты проведённых нами ранее исследований иллюстрируют способность ингибиторов FGF-сигнального пути (BGJ398) вызывать сенситизацию клеток ГИСО к действию химиопрепаратов [21].

Вышеизложенное свидетельствует о важной роли рецепторных тирозинкиназ в регуляции процессов репарации повреждений ДНК и открывает перспективы для их применения, обусловленные их способностью вызвать радио- и химиосенситизацию злокачественных новообразований, в том числе резистентных к используемым в настоящее время таргетным препаратам.

Вывод

Ингибиторы рецепторных тирозинкиназ с различным механизмом действия вызывают сенситизацию иматиниб-резистентных клеток гастроинтестинальных стромальных опухолей к химиопрепаратам (ингибиторам ДНК-топо­изомеразы II типа) за счёт угнетения процессов репарации повреждений ДНК по механизму гомологичной рекомбинации.

 

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант №17-04-00158).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

P D Dunaev

Kazan State Medical University

Author for correspondence.
Email: boichuksergei@mail.ru
Kazan, Russia

A R Galembikova

Kazan State Medical University

Email: boichuksergei@mail.ru
Kazan, Russia

S V Boichuk

Kazan State Medical University

Email: boichuksergei@mail.ru
Kazan, Russia

  1. Jakhetiya A., Garg P.K., Prakash G. et al. Targeted therapy of gastrointestinal stromal tumours. World J. Gastrointest. Surg. 2016; 8 (5): 345–352. doi: 10.4240/wjgs.v8.i5.345.
  2. Hirota S., Isozaki K., Moriyama Y. et al. Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors. Science. 1998; 279: 577–580. DOI: 10.1126/
  3. science.279.5350.577.
  4. Demetri G.D., Mehren von M., Blanke C.D. et al. Efficacy and safety of imatinib mesylate in advanced gastro­intestinal stromal tumors. N. Engl. J. Med. 2002; 347: ­472–480. doi: 10.1056/NEJMoa020461.
  5. Rubin B.P., Singer S., Tsao C. et al. KIT activation is a ubiquitous feature of gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res. 2001; 61: 8118–8121. PMID: 11719439.
  6. Gramza A.W., Christopher L.C., Michael C.H. Resistance to tyrosine kinase inhibitors in gastrointestinal stromal tumors. Clin. Cancer Res. 2009; 15 (24): 7510–7518. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-09-0190.
  7. De Silva C.M., Reid R. Gastrointestinal stromal tumors (GIST): с-kit mutations, CD117 expression, differential diagnosis and targeted cancer therapy with Imatinib. Pathol. Oncol. Res. 2003; 9 (1): 13-19. PMID: 12704441.
  8. Boichuk S., Galembikova A., Dunaev P. et al. A no­vel receptor tyrosine kinase switch promotes gastrointestinal stromal tumor drug resistance. Molecules. 2017; 22 (12): E2152. doi: 10.3390/molecules22122152.
  9. Rock E.P., Goodman V., Jiang J.X. et al. Food and Drug Administration drug approval summary: sunitinib malate for the treatment of gastrointestinal stromal tumor and advanced renal cell carcinoma. Oncologist. 2007; 12: 107–113. doi: 10.1634/theoncologist.12-1-107.
  10. Demetri G.D., Reichardt P., Kang Y.-K. et al. Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, pla­cebo-controlled, phase 3 trial. Lancet. 2013; 381: 295–302. doi: 10.1016/S0140-6736(12)61857-1.
  11. Boichuk S., Rausch J.L., Duensing A. New developments in management of gastrointestinal stromal tumors: regorafenib, the new player in the team. Gastrointestinal. Cancer: Targets and Therapy. 2014; 4: 1–10. doi: 10.2147/GICTT.S20679.
  12. Wozniak A., Gebreyohannes Y.K., Debiec-Rychter M. et al. New targets and therapies for gastrointestinal stromal tumors. Expert. Re.v Anticancer Ther. 2017; 17: 1117–1129. doi: 10.1080/14737140.2017.1400386.
  13. Boichuk S., Lee D.J., Mehalek K.R. et al. Unbiased compound screening identifies unexpected drug sensiti­vities and novel treatment options for gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res. 2014; 74 (4): 1200–1213. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-13-1955.
  14. Pessetto Z., Ma Y., Hirst J. et al. Drug repurposing identifies a synergistic combination therapy with imatinib mesylate for gastrointestinal stromal tumor. Mol. Cancer Ther. 2014; 13 (10): 2276–2287. doi: 10.1158/1535-7163.MCT-14-0043.
  15. Boichuk S.V., Ramazanov B.R., Galembikova A.R. et al. Mecha­nisms of chemosensitivity of gastrointestinal stromal tumor cell lines in vitro. Geny i kletki. 2014; 9 (4): 116–120. (In Russ.)
  16. Galembikova A.R., Dunaev P.D., Boichuk S.V. Sensitivity of gastrointestinal stromal tumors (GISTs) to the various chemotherapeutic agents. Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya. 2015; 6. http://www.science-education.ru/130-23728 (access date: 4.07.2017). (In Russ.)
  17. Boichuk S.V., Galembikova A.R., Ramaza­nov B.R. et al. Imatinib sensitizes gastrointestinal stromal tumors cells to the topoisomerase II inhibitors. Uspekhi moleku­lyarnoy onkologii. 2015; (1): 76–81. (In Russ.)
  18. Boichuk S.V., Galembikova A.R., Martynova E.V. et al. Imatinib inhibits homology-mediated DNA repair and sensitizes gastrointestinal stromal tumor cells to topoisomerase II inhibitors. Tsitologiya. 2016; (3): 178–188. (In Russ.)
  19. Dunaev P.D., Boichuk S.V., Galembikova A.R. et al. Establishment of imatinib-resistant subclone of gastrointestinal stromal tumor and assessment of its sensitivity to chemotherapeutic agents. Kazansky meditsinskiy zhurnal. 2017; 98 (6): ­993–997. (In Russ.)
  20. Tanaka T., Munshi A., Brooks C. et al. Gefitinib radiosensitizes non-small cell lung cancer cells by suppres­sing cellular DNA repair capacity. Clin. Cancer Res. 2008; 14: 1266–1273. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-07-1606.
  21. Dittmann K., Mayer C., Rodemann H.P. Inhibition of radiation-induced EGFR nuclear import by C225 (Cetu­ximab) suppresses DNA-PK activity. Radiother. Oncol. 2005; 76: 157–161. doi: 10.1016/j.radonc.2005.06.022.
  22. Boichuk S., Dunaev P., Galembikova A. et al. Inhibition of fibroblast growth factor receptor-signaling sensiti­zes imatinib-resistant gastrointestinal stromal tumors to low doses of topoisomerase II inhibitors. Anticancer Drugs. 2018; 29 (6): 549–559. doi: 10.1097/CAD.0000000000000637.

Supplementary files

There are no supplementary files to display.

Views

Abstract - 226

PDF (Russian) - 176

Cited-By


PlumX


© 2019 Dunaev P.D., Galembikova A.R., Boichuk S.V.

Creative Commons License

This work is licensed
under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.


Свидетельство о регистрации СМИ ЭЛ № ФС 77-75008 от 1 февраля 2019 года выдано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор)