Reaction of the hemostatic system in response to hypercapnic hypoxia of maximum intensity ­depending on different types of preconditioning

Full Text

Один из вариантов развития гиперкапнической гипоксии (ГКГ) — длительное нахождение в небольших замкнутых помещениях при неисправности кислородного обеспечения в кабинах летательных аппаратов и подводных лодках [1]. При этом ГКГ достаточно широко используют в медицине для лечения заболеваний нервной [2] и дыхательной [3] систем, желудочно-кишечного тракта [4], а также для устранения тканевой гипоксии [5].

Известно, что адаптация к ГКГ вызывает ряд функциональных и биохимических изменений в организме, направленных в конечном счёте на обеспечение увеличения доставки кислорода тканям. В данном процессе участвуют все органы и системы организма, в частности система гемостаза [6, 7].

Установлено, что первичной реакцией системы коагуляционного гемостаза на однократную 20-минутную ГКГ (9–11% О2, 7–8% СО₂) бывает гиперкоагуляция [6, 7]. Ранее было установлено, что при различных патологических воздействиях на поверхности эндотелиальных клеток индуцируется экспрессия тканевого фактора, что может способствовать гиперкоагуляционным сдвигам в системе гемостаза [8]. Однако более длительное воздействие характеризуется компенсаторным увеличением активности системы фибринолиза при сохранившихся антикоагулянтных резервах, что способствует уменьшению риска развития внутрисосудистого свёртывания [6, 7].

Один из вариантов решения проблемы повышения устойчивости системы гемостаза к ГКГ — возможность применения тренировочных воздействий ГКГ. Прекондиционирование как способ формирования ишемической и гипоксической толерантности организма представляет собой перспективное научное направление в медицине. Возможна регуляция адаптивных реакций на воздействие гипоксии с помощью фармакологических препаратов, что позволяет проводить фармакологическое прекондиционирование [9].

Следует отметить, что в литературе есть ряд работ, демонстрирующих, что тренировки гипоксией в сочетании с гиперкапнией обладают значительно бóльшим по сравнению с изолированной гипоксией адаптогенным потенциалом [5, 10, 11]. Кроме того, возможно осуществление и фармакологической коррекции для повышения выживаемости животных [12]: использование антигипоксантов [13]. В исследованиях Д.В. Срубилина и соавт. (2011) показано, что антигипоксанты значительно увеличивают время жизни животных при использовании острой ГКГ [14].

Одним из антигипоксантов, широко используемых в отечественной медицине, служит этилметилгидроксипиридина сукцинат, эффект которого связан с активацией энергосинтезирующей функции митохондрий, способствующей доставке в дыхательную цепь энергетических субстратов (в данном случае сукцината) и выполняющих роль срочного адаптационного механизма при гипоксии [15].

Цель работы — изучить адаптационные реакции системы гемостаза к ГКГ максимальной интенсивности у крыс, подвергшихся предварительному многократному воздействию этилметилгидроксипиридина сукцината и ГКГ субмаксимальной интенсивности.

Эксперименты выполнены на 80 крысах-самцах линии Вистар со средней массой тела 246,0±32,0 г. Экспериментальные животные были разделены на семь групп: группа интактных животных (n=20), три контрольные и три опытные группы (по 10 крыс в каждой).

Интактная группа животных находилась на свободном пищевом рационе и не подвергалась каким-либо предварительным воздействиям. Остальные шесть групп (три опытных и три контрольных) на протяжении 30 дней ежедневно подвергали следующим воздействиям:
– первая опытная группа — ГКГ в газовой среде, содержащей 9,0±0,5% О2, 7,0±0,5% СО₂ в течение 20 мин;
– первая контрольная группа — воздействию нормоксии в специальных камерах в течение 20 мин;
– вторая опытная группа — введению внутрибрюшинно этилметилгидроксипиридина сукцината (50 мг/кг);
– вторая контрольная группа — введению 0,9% раствора NaCl в том же объёме;
– третья опытная группа — сочетанному воздействию ГКГ (9,0±0,5% О2, 7,0±0,5% СО₂) в течение 20 мин и этилметилгидроксипиридина сукцината (50 мг/кг);
– третья контрольная группа — нахождению в условиях нормоксии в течение 20 мин в специальной камере с введением 0,9% раствора NaCl в том же объёме, что и раствора этилметилгидроксипиридина сукцината у опытных групп.

На 31-й день, после завершения тренировочных режимов, все опытные и контрольные группы подвергались однократному тестовому воздействию — ГКГ максимальной интенсивности на протяжении 20 мин с концентрацией О₂ 5,0±0,5% и СО₂ 5,0±0,5%.

Для моделирования ГКГ использовали проточную камеру, в которую при помощи компрессора подавали заданную смесь газов со скоростью 15 л/мин.

Тренировочный режим — ГКГ субмаксимальной интенсивности (9,0±0,5% О2, 7,0±0,5% СО₂ в течение 20 мин на протяжении 30 дней) для эффективной адаптации к ГКГ — был выбран, исходя из литературных данных [11]. Тестовый режим — ГКГ максимальной интенсивности (5,0±0,5% О₂ и 5,0±0,5% СО₂ в течение 20 мин однократно) — был подобран экспериментальным путём, исходя из предельно допустимых концентраций кислорода и углекислого газа, при которых ещё была зарегистрирована 100% выживаемость животных.

Контрольную группу также помещали в камеру при аналогичных условиях, однако вместо газовой смеси компрессором нагнетали атмосферный воздух. Контроль газового состава камеры производили при помощи газоанализатора «Microlux O₂+CO₂» (ООО «Микролюкс», Екатеринбург, Россия).

С целью адаптации к условиям вивария всех крыс помещали в стандартные условия содержания за неделю до начала экспериментальных воздействий.

Проведение экспериментов на крысах осуществляли в соответствии с Европейской конвенцией по охране позвоночных животных, используемых в эксперименте, и директивами 86/609/EEC. Обезболивание и умерщвление животных проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» [16]. Работа была одобрена этическим комитетом Алтайского государственного медицинского университета, протокол №1 от 29.01.2018.

Для коррекции гипоксических нарушений, кроме тренировочного режима ГКГ, использовали фармакологический препарат-антигипоксант этилметилгидроксипиридина сукцинат (мексидол, 50 мг/кг; «Фармасофт», Москва). Препарат вводили экспериментальным животным внутрибрюшинно ежедневно в течение 30 дней. Объём введения для каждой крысы был индивидуален и рассчитывался, исходя из массы тела. Дозы препаратов для крыс подбирали из расчёта 5 мг на 100 г массы тела животного с применением констант биологической активности [17].

Кровь для исследования у опытных и контрольных животных забирали сразу после окончания однократного воздействия ГКГ максимальной интенсивности по завершении 30-дневных предварительных тренировочных циклов.

Забор крови у всех групп животных выполняли на фоне наркотизации путём внутрибрюшинного введения раствора золазепама в дозе 5 мг/100 г. Кровь для исследования забирали из печёночного синуса в объёме 5 мл.

Комплекс методик, позволяющий оценить состояние системы гемостаза, включал исследование агрегационной активности тромбоцитов, коагуляционного звена гемостаза, антикоагулянтной активности и фибринолитической системы крови.

В качестве реагентов для оценки системы гемостаза были выбраны диагностические наборы фирмы «Технология-Стандарт» (Россия) с использованием коагулометров «Минилаб» (Россия) и «Trombostat-2» (Германия). Подсчёт количества тромбоцитов периферической крови осуществляли при помощи гематологического анализатора «Drew-3» (США). Определение агрегационной активности тромбоцитов выполняли при помощи агрегометра «Биола» (­Россия). Уровень антитромбина III оценивали при помощи спектрофотометра «СФ-46» (­Россия).

Все цифровые данные, полученные в ходе исследования, подвергали статистической обработке. Данные исследований представлены в виде Me [Q₂₅; Q₇₅], где Me — медиана в выборочной совокупности; [Q₂₅; Q₇₅] — 25-й и 75-й перцентили.

Исходя из того, что не все наблюдаемые признаки подчинялись нормальному распределению, достоверность различий оценивали при помощи непараметрического U-критерия Манна–Уитни. Различия считали значимыми
при р <0,05.

Для обработки и хранения полученного экспериментального материала создавали базы данных с использованием редактора электронных таблиц Microsoft Excel 2010. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли при помощи программ математической статистики Jmp Statistical Discovery v. 6.1.2 и Biostat 5.03 на персональном компьютере.

Сравнительный анализ результатов исследования показателей системы гемостаза, зарегистрированных после тестового воздействия ГКГ максимальной интенсивности, которому подвергали животных по завершении 30-дневного тренировочного изолированного и сочетанного воздействий ГКГ и этилметилгидроксипиридина сукцината, приведён в табл. 1.

 

 

Для оценки эффективности того или иного адаптационного режима, используемого в данной работе, повышающего толерантность к ГКГ, необходимо знать, какое влияние на систему гемостаза оказывает однократная ГКГ максимальной интенсивности без предварительного тренировочного воздействия. Ранее нами было установлено, что реакцией системы гемостаза на однократное 20-минутное воздействие ГКГ максимальной интенсивности бывает активация сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного звеньев гемостаза на фоне активации фибринолитической системы ­
крови [18].

В ходе описываемых в статье экспериментов выявлено, что в ответ на однократную ГКГ максимальной интенсивности, последовавшую сразу по завершении предварительного 30-кратного ежедневного цикла изолированных воздействий ГКГ тренировочного режима (первая опытная группа), были зафиксированы (по сравнению с контрольной группой) разнонаправленные изменения в сосудисто-тромбоцитарном звене системы гемостаза, что характеризовалось повышением количества тромбоцитов на 19% (р <0,001) при снижении АДФ-агрегации тромбоцитов на 32% (р <0,001). Однако при сравнении показателей тромбоцитарного звена опытной группы с интактными животными было установлено отсутствие достоверных различий, что свидетельствует о нормализации данных параметров.

Со стороны плазменного гемостаза (по сравнению с контрольной группой) регистрировалась гипокоагуляция по внутреннему и внешнему путям, а также на конечном этапе свёртывания. Эти данные подтверждались увеличением активированного парциального тромбопластинового времени на 54% (р <0,001), протромбинового времени — на 6% (р <0,01), времени полимеризации фибрин-мономеров — на 40% (р <0,01). Концентрация фибриногена увеличивалась на 61% (р <0,001), уровень растворимых фибрин-мономерных комплексов снижался на 42% (р <0,001).

Описанные изменения сопровождались повышением антикоагулянтной активности на 6% (р <0,01) и угнетением фибринолитической — на 20% (p <0,05). По сравнению с показателями интактной группы у опытных животных был незначительно повышен (на 17%) только уровень растворимых фибрин-мономерных комплексов (p <0,001). Остальные показатели коагулограммы не отличались от исходных.

Многократное изолированное применение этилметилгидроксипиридина сукцината (вторая опытная группа) и воздействие ГКГ максимальной интенсивности приводили (по сравнению с контрольной группой) к угнетению тромбоцитарного звена гемостаза — снижалась агрегационная активность тромбоцитов на 56% (р <0,001). В показателях опытной группы в отличие от интактных крыс отмечено угнетение сосудисто-тромбоцитарного звена: снижение на 13% (p <0,01) количества тромбоцитов и на 44% (p <0,001) — их агрегационной активности.

В плазменном звене при сравнении опытной группы с контрольной отмечено увеличение времени свёртывания по внутреннему пути — удлинение активированного парциального тромбопластинового времени на 16% (р <0,01). В плазме крови было обнаружено снижение уровня растворимых фибрин-мономерных комплексов на 32% (р <0,01), повышение концентрации фибриногена на 14% (р <0,01). Наряду с этим активность фибринолиза снижалась на 34% (p <0,01).

При сравнении данных с интактными животными со стороны плазменного звена зарегистрирована гиперкоагуляция на конечном этапе свёртывания, о чём свидетельствовало укорочение на 17% (p <0,01) времени полимеризации фибрин-мономеров, а также были зафиксированы повышение на 43% уровня растворимых фибрин-мономерных комплексов (p <0,001) и угнетение на 18% (p <0,05) спонтанного эуглобулинового фибринолиза.

Предварительное совместное использование тренировочных режимов (третья опытная группа) в ответ на экспериментальное воздействие ГКГ приводило к достаточно серьёзным изменениям в системе гемостаза у группы опытных животных по сравнению с контрольными и интактными. Так, описываемое воздействие сопровождалось (по сравнению с контрольной группой) повышением количества тромбоцитов на 9% (p <0,001) и снижением на 42% их агрегационной функции (p <0,001).

Со стороны свёртывающей системы зафиксировано угнетение внутреннего механизма образования протромбиназы, на что указывало увеличение на 48% активированного парциального тромбопластинового времени (р <0,001). На конечном этапе свёртывания в опытной группе происходило повышение на 42% времени полимеризации фибрин-мономеров (р <0,001). Кроме того, по сравнению с контрольной группой выявлены повышение на 58% концентрации фибриногена (p <0,001), снижение на 45% уровня растворимых фибрин-мономерных комплексов (p <0,001), повышение на 13% содержания антитромбина III (p <0,001) и угнетение на 29% системы фибринолиза (p <0,001).

При сравнении данных опытной и интактной групп установлено отсутствие достоверных различий между показателями, характеризующими тромбоцитарное и коагуляционное звенья системы гемостаза. Однако по сравнению с группой интактных крыс в группе опытных животных установлено лишь повышение уровня антитромбина III на 13% (p <0,01), остальные же показатели коагулограммы возвращались под воздействием данного режима тренировок к исходному уровню.

Из результатов экспериментов следует, что у опытных животных тренировочный режим ГКГ вызывает нормализацию большинства параметров гемостаза (при сравнении с группой интактных животных), а сочетанный тренировочный режим ГКГ с этилметилгидроксипиридина сукцинатом не только приводит к восстановлению всех показателей системы гемостаза, но и способствует повышению антикоагулянтной активности плазмы крови. Данный эффект, по-видимому, можно расценить как действие антигипоксанта.

Кроме того, после сочетанных 30-кратных воздействий ГКГ в тренировочном режиме и этилметилгидроксипиридина сукцината отмечены угнетение сосудисто-тромбоцитарного звена (один из фармакологических эффектов препарата [19]) и исчезновение всех признаков состояния тромботической готовности, регистрируемой по окончании однократного воздействия ГКГ максимальной интенсивности в группе контрольных животных.

Можно сделать вывод о том, что применение ГКГ способствует существенному снижению риска развития претромботического состояния. Это подтверждается отсутствием маркёров состояния тромботической готовности (снижение уровня растворимых фибрин-мономерных комплексов) после эксперимента, а также гипокоагуляционными сдвигами в системе гемостаза.

Полученные данные подтверждаются А.Г. Рачковым и соавт. (1990). Гипокоагуляцию в системе гемостаза при экспериментальной гипоксии рассматривают как проявление адаптации, что приводит к улучшению микроциркуляции на фоне гипоксической полиглобулии и в условиях первоначальной активации тромбогенных факторов [20]. Другие же авторы видят в гипокоагуляции, регистрируемой при данном воздействии, одну из фаз синдрома диссеминированного внутрисосудистого свёртывания, когда происходит истощение факторов свёртывания крови [21]. Зафиксированное повышение концентрации фибриногена может свидетельствовать об отсутствии потребления фибриногена в организме в ходе тромбообразования у опытных крыс после гипоксического прекондиционирования.

При этом важно отметить повышение уровня антитромбина III, поскольку антикоагулянтная активность плазмы крови — один из наиболее чувствительных компонентов системы
гемостаза, реагирующей на стрессорное воздействие [22].

Также повышается содержание тромбоцитов, при этом их функциональная активность снижается. По литературным данным известно, что количество тромбоцитов в условиях кислородной недостаточности увеличивается. Установлено, что ГКГ стимулирует деятельность мегакариоцитов [23], а это приводит к повышению количества тромбоцитов.

В то же время установлено, что в ходе эксперимента снижается активность фибринолитической системы крови. Это может быть обусловлено более длительным периодом, необходимым для восстановления фибринолиза. Кроме того, по данным Z.G. Zhang (1999), острая гипоксия стимулирует синтез ингибитора активатора плазминогена 1-го типа, способного замедлять лизис фибриновых сгустков [24].

Состояние системы гемостаза, зарегистрированное после однократного воздействия ГКГ максимальной интенсивности, которому предшествовал 30-дневный цикл приёма этилметилгидроксипиридина сукцината, характеризуется угнетением сосудисто-тромбоцитарного звена системы гемостаза. В плазменном звене происходит лишь гипокоагуляционный сдвиг по внутреннему пути свёртывания.

Выявленные эффекты могут быть обусловлены обнаруженной у этилметилгидроксипиридина сукцината способностью подавлять агрегацию тромбоцитов. Этот препарат ингибирует фосфодиэстеразу циклических нуклеотидов тромбоцитов, а также защищает клетки крови при травме [21].

Выводы

1. Состояние системы гемостаза при тренировочном режиме применения гиперкапнической гипоксии субмаксимальной интенсивности на протяжении 30 дней, а также при сочетанном воздействии гиперкапнической гипоксии и этилметилгидроксипиридина сукцината характеризуется полноценной нормализацией параметров и развитием адаптации со стороны системы гемостаза к данному виду стрессора.

2. Курсовое 30-кратное применение этилметилгидроксипиридина сукцината приводит к развитию наиболее выраженных адаптационных резервов лишь в тромбоцитарном звене системы гемостаза, нормализация же остальных параметров в коагулограмме обусловлена действием гипоксического прекондиционирования.

 

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

About the authors

S V Moskalenko

Altai State Medical University; Research Institute of Physiology and Fundamental Medicine

Author for correspondence.
Email: sunrisemsv@gmail.com
Barnaul, Russia; Novosibirsk, Russia

I I Shakhmatov

Altai State Medical University; Research Institute of Physiology and Fundamental Medicine

Email: sunrisemsv@gmail.com
Barnaul, Russia; Novosibirsk, Russia

I V Kovalev

Siberian State Medical University

Email: sunrisemsv@gmail.com
Tomsk, Russia

K I Shakhmatova

Otdelenchesky clinical hospital at the station Barnaul of JSC “Russian Railways”

Email: sunrisemsv@gmail.com
Barnaul, Russia

V M Vdovin

Altai State Medical University; Research Institute of Physiology and Fundamental Medicine

Email: sunrisemsv@gmail.com
Barnaul, Russia; Novosibirsk, Russia

References

Supplementary files