Time-dependent systemic hemostatic effects of fibrin monomer in controlled liver injury in the experiment

Full Text

Геморрагические осложнения обширных травм при неотложных состояниях часто представляют собой серьёзную угрозу для здоровья и жизни людей, что объясняет высокий интерес учёных и врачей разных специальностей к этой проблеме [1]. В последние годы подходы к лечению пациентов с обширными кровотечениями меняются в соответствии с появлением новых знаний о патогенезе травматической коагулопатии [2].

В современной практике особое место принадлежит ряду препаратов (таких, как эптаког альфа активированный, концентраты факторов протромбинового комплекса, транексамовая кислота), обладающих доказанным и объяснимым системным гемостатическим действием [3]. При этом установлено, что польза от их применения связана с усилением коагуляционных свойств крови, повышением тромботического потенциала, что, однако, помимо терапевтического эффекта, не исключает риска развития артериальных и/или венозных тромбозов [1, 4].

Следует отметить, что клиническая эффективность современных системных гемостатиков и антидотов остаётся не всегда высокой, особенно при посттравматических кровотечениях, возникших на фоне приёма антикоагулянтов [3, 5, 6]. Данное обстоятельство представляется побудительным мотивом к поиску эффективных кровоостанавливающих препаратов, обладающих системным действием.

Одним из них может стать фибрин-мономер (ФМ; синоним дезААВВ-фибриноген), интерес к которому проявлен более 45 лет назад в исследованиях профессора Б.А. Кудряшова, в которых изучали эффекты системного введения высоких доз (25 мг/кг и выше) ФМ [7]. Как известно, основная функция ФМ как продукта протеолитического расщепления фибриногена тромбином (фактором свёртывания IIа) связана с полимеризацией и формированием основы тромба [8, 9].

Проведённые ранее в нашей лаборатории исследования [10] показали, что и сравнительно меньшие, физиологические дозы ФМ обладают выраженным гемостатическим действием при его внутривенном введении. Вместе с тем, зависимость гемостатического эффекта от времени, прошедшего после введения ФМ, пока не установлена, что и послужило основанием для выполнения настоящего исследования.

Целью работы была оценка кровоостанавливающего действия ФМ в различные промежутки времени после его внутривенного введения на фоне экспериментальной травмы.

Исследования выполнены на 97 кроликах-самцах породы шиншилла с массой тела 3,0–4,0 кг, разделённых на семь экспериментальных групп (рис. 1):
– первая группа — контрольная;
– животным второй, четвёртой и шестой групп в краевую вену уха при помощи иглы-катетера («Cathy», фирма HMD) вводили плацебо (4,0 М раствор мочевины, соответствующий её концентрации в растворе ФМ) объёмом 0,5 мл;
– животным третьей, пятой и седьмой групп аналогичным образом внутривенно вводили ФМ в дозе 0,25 мг/кг, разработанный и произведённый фирмой «Технология-Стандарт» (Россия) в соответствии с ранее зарегистрированной технологией [11].

 

Рис. 1. Дизайн экспериментов с дозированной травмой печени; ФМ — фибрин-мономер.

 

После предварительной наркотизации животным всех групп выполняли лапаротомию с последующей дозированной травмой печени в соответствии с существующими рекомендациями [12]. После лапаротомии в рану выводили левую долю печени, на её диафрагмальной поверхности наносили травму, стандартную по площади и глубине, при помощи специального приспособления-ограничителя. Образовавшаяся кровоточащая рана с ­ровными краями и равномерной кривизной имела диаметр около 15 мм и глубину приблизительно 5 мм. При помощи стерильных марлевых салфеток оценивали объём кровопотери (% объёма циркулирующей крови с учётом массы тела животных) и темп кровопотери в единицу времени (мг/с).

Эксперименты выполняли следующим образом: животным первой группы (контрольные, n=14) травматизацию осуществляли сразу после введения в наркоз; во второй (плацебо, n=15) и третьей (ФМ, n=17) группах травму наносили через 5 мин после внутривенного введения плацебо или ФМ; в четвёртой (плацебо, n=11) и пятой (ФМ, n=15) группах травму наносили через 1 ч после внутривенного введения плацебо или ФМ; в шестой (плацебо, n=12) и седьмой (ФМ, n=13) группах травму наносили через 3 ч после введения плацебо или ФМ. Эксперимент заканчивали во время прекращения кровотечения из раны либо после остановки сердечно-лёгочной деятельности у животного (летальный исход). Выживших животных выводили из опыта путём передозировки средства для наркоза.

Для исследования системы гемостаза получали кровь из краевой вены уха (самотёком), не используя первые капли. Кровь у животных первой группы забирали за 5 мин до травмы печени; во второй-седьмой группах забор осуществляли дважды: непосредственно перед внутривенным введением плацебо или ФМ, а также через 5 мин (вторая и третья группы), 1 ч (четвёртая и пятая группы) или 3 ч (шестая и седьмая группы) после инъекции плацебо или ФМ — перед нанесением дозированной травмы печени (см. рис. 1).

Полученную таким образом кровь помещали в пробирки, содержащие этилендиаминтетрауксусную кислоту, для подсчёта количества тромбоцитов и пробирки с 0,11 М (3,8%) раствором цитрата натрия (соотношение крови и стабилизатора 9:1) для исследования системы гемостаза в соответствии с отечественными рекомендациями [13].

Оценка параметров гемокоагуляции включала подсчёт количества тромбоцитов в крови (с помощью гематологического анализатора Drew 3 фирмы Drew Scientific Inc., Англия), определение активированного парциального тромбопластинового времени, протромбинового времени, тромбинового времени и эхитоксового времени свёртывания крови, а также концентрации фибриногена на коагулометре Thrombostat 2 (Behnk Electronik, Германия). Кроме того, определяли уровень растворимых ФМ-комплексов, активность антитромбина III (на спектрофотометре Photometer 5010 v5+ фирмы Robert Riele GmbH Co & KG, Германия) и концентрацию D-димера в плазме крови (на анализаторе-рефлектометре NycoCard Rader II фирмы Axis-Shield PoC AS, Норвегия).

Результаты оценки активированного парциального тромбопластинового времени, протромбинового времени, тромбинового времени и эхитоксового времени представляли в виде отношения времени свёртывания в опытной плазме крови (с) ко времени свёртывания в контрольной плазме (с).

Для получения коагулограммы применяли наборы реагентов фирмы «Технология-Стандарт» (Россия). При определении уровня D-димера использовали тест-систему NycoCard® D-Dimer (Axis-Shield PoC AS, Норвегия).

Распределение признаков в выборках оценивали по критерию Шапиро–Уилка. В зависимости от распределения признаков в независимых группах использовали t-критерий Стьюдента или U-критерий Манна–Уитни; сравнение зависимых переменных проводили при помощи W-критерия Уилкоксона или парного критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при уровне статистической значимости различий p ≤0,05. Обработку экспериментальных данных проводили с использованием пакета статистического программного обеспечения MedCalc Version 17.9.7.

Эксперименты на животных ­выполнены в соответствии с Европейской конвенцией и директивами по охране позвоночных животных, используемых в эксперименте, 86/609/ЕЕС, а также Хельсинской декларацией и «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Работа была одобрена локальным этическим комитетом ­ФГБОУ ВО «Алтайский государственный медицинский университет» МЗ РФ (протокол №12 от 12.11.2015).

В ходе экспериментов определено, что введение плацебо животным (вторая, четвёртая и шестая группы) до нанесения травмы в разные интервалы времени не оказывает влияния как на объём, так и на темп кровопотери (рис. 2).

 

Рис. 2. Сравнительный анализ параметров кровопотери (объёма и темпа) у экспериментальных животных при изучении гемостатического действия фибрина-мономера; ОЦК — объём циркулирующей крови; значения представлены в виде медианы — горизонтальной линии внутри прямоугольника, включающего 50% полученных значений и значений, соответствующих перцентилям 2,5 и 97,5 (нижний и верхний вертикальные бары); а — объём кровопотери (% объёма циркулирующей крови); б — темп кровопотери (мг/с)

 

В то же время применение ФМ за 1 ч до травмы (пятая группа) снижало объём посттравматической кровопотери в 6,3 раза в сравнении с животными, получившими плацебо (четвёртая группа), — по медиане соответственно 1,6 [1,0÷3,0] против 10,1 [4,1÷13,5] доли объёма циркулирующей крови (р <0,001). Тенденция к уменьшению темпа кровопотери в пятой группе животных прослеживалась, однако не была статистически значимой.

Можно видеть также, что введение ФМ за 5 мин (третья группа), а также за 3 ч до травмы (седьмая группа) не проявило его сколько-­нибудь видимой гемостатической активности.

В ходе эксперимента в ряде случаев фиксировали летальный исход — остановку сердечно-лёгочной деятельности, на фоне продолжающейся кровопотери. Такие исходы отсутствовали в группах с применением как плацебо (четвёртая группа), так и ФМ (пятая группа) за 1 ч до нанесения травмы печени. В остальных экспериментальных группах зарегистрирована гибель от 12 до 35% животных.

Несмотря на значительное снижение кровопотери у животных в пятой группе, статистически значимого влияния экзогенного ФМ на исследованные показатели системы гемостаза не найдено во всех обозначенных временных точках (табл. 1). Полученные результаты, свидетельствующие об отсутствии изменений показателей свёртывания крови при введении ФМ, соотносились с таковыми, показанными в более ранних исследованиях Б.А. Кудряшова и соавт. [7], применявших ФМ в гораздо больших дозах (25–75 мг/кг).

 

Таблица 1. Показатели системы гемостаза у экспериментальных животных

Группы	Тромбоциты ×109/л	АПТВ, отношение	ПВ, отношение	ТВ, отношение	ЭВ, отношение	Фг г/л	РФМК мг/100 мл	D-димер нг/мл	АТ III %
Первая, контрольные, 1	516,0 [304,0÷597,5]	1,0 [0,9÷1,0]	1,0 [0,9÷1,0]	0,9 [0,8÷1,1]	1,0 [0,9÷1,1]	2,93 [2,60÷3,40]	4,3 [3,0÷7,4]	100,0 [100,0÷125,0]	100,0 [94,7÷101,6]
Вторая, плацебо до 2а	490,0 [407,0÷522,0]	1,0 [0,9÷1,1]	1,0 [1,0÷1,1]	0,9 [0,9÷1,0]	1,0 [0,9÷1,1]	2,70 [2,35÷3,48]	5,0 [3,3÷7,8]	125,0 [100,0÷200,0]	100,0 [98,5÷122,3]
Вторая, плацебо после 2б	486,0 [429,0÷540,0] р1–2б=0,897 р2а–2б=0,279	0,9 [0,8÷1,1] р1–2б=0,585 р2а–2б=0,232	1,0 [1,0÷1,1] р1–2б=0,883 р2а–2б=0,123	0,9 [0,9÷1,0] р1–2б=0,541 р2а–2б=0,460	1,0 [1,0÷1,1] р1–2б=0,718 р2а–2б=0,363	2,65 [2,23÷3,23] р1–2б=0,294 р2а–2б=0,530	3,5 [3,3÷4,5] р1–2б=0,431 р2а–2б=0,844	100,0 [100,0÷200] р1–2б=0,728 р2а–2б=0,483	104,5 [78,5÷114,8] р1–2б=0,488 р2а–2б=0,233
Третья, ФМ до 3а	583,0 [485,0÷615,0]	1,1 [0,8÷1,2]	1,1 [1,0÷1,1]	1,0 [0,8÷1,1]	1,0 [1,0÷1,1]	3,20 [2,80÷3,50]	3,5 [3,0÷5,6]	100,0 [100,0÷100,0]	102,0 [98,5÷113,5]
Третья, ФМ после 3б	600,0 [550,5÷657,0] р3а–3б=0,478	1,0 [0,9÷1,1] р3а–3б=0,504	1,1 [1,0÷1,1] р3а–3б=0,457	1,0 [0,8÷1,2] р3а–3б=0,349	1,0 [1,0÷1,1] р3а–3б=0,380	2,95 [2,56÷3,53] р3а–3б=0,487	3,5 [3,0÷4,5] р3а–3б=0,139	100,0 [100,0÷200,0] р3а–3б=0,594	102,0 [79,0÷110,0] р3а–3б=0,069
Четвёртая, плацебо до 4а	617,0 [456,0÷760,5]	1,1 [1,0÷1,2]	0,9 [0,9÷1,2]	1,0 [0,9÷1,0]	1,0 [1,0÷1,1]	3,30 [2,80÷4,40]	3,0 [3,0÷6,0]	100,0 [100,0÷100,0]	100,0 [94,0÷103,8]
Четвёртая, плацебо после 4б	524,0 [480,5÷686,5] р1–4б=0,066 р4а–4б=0,080	1,1 [0,9÷1,2] р1–4б=0,427 р4а–4б=0,240	0,9 [0,9÷1,1] р1–4б=0,773 р4а–4б=0,476	0,9 [0,9÷1,0] р1–4б=0,289 р4а–4б=0,215	1,0 [0,9÷1,1] р1–4б=0,402 р4а–4б=0,511	3,70 [2,80÷4,50] р1–4б=0,377 р4а–4б=0,811	3,0 [3,0÷3,5] р1–4б=0,324 р4а–4б=0,867	100,0 [100,0÷175,0] р1–4б=0,790 р4а–4б=0,201	104,0 [96,3÷104,8] р1–4б=0,536 р4а–4б=0,502
Пятая, ФМ до 5а	526,0 [464,3÷602,8]	1,0 [0,9÷1,2]	1,2 [0,8÷1,7]	0,9 [0,9÷1,0]	1,1 [1,0÷1,2]	3,75 [2,80÷4,45]	3,0 [3,0÷8,5]	100,0 [100,0÷175,0]	101,0 [95,7÷104,0]
Пятая, ФМ после 5б	524,0 [452,0÷600,5] р5а–5б=0,578	1,0 [0,9÷1,1] р5а–5б=0,590	0,9 [0,8÷1,4] р5а–5б=0,139	0,9 [0,8÷0,9] р5а–5б=0,006	1,1 [1,0÷1,2] р5а–5б=0,173	3,40 [2,80÷4,80] р5а–5б=0,701	8,0 [3,0÷10,0] р5а–5б=0,151	100,0 [100,0÷200,0] р5а–5б=0,176	101,0 [97,8÷103,0] р5а–5б=0,917
Шестая, плацебо до 6а	477,0 [383,0÷584,8]	0,9 [0,8÷1,2]	1,1 [1,0÷1,4]	1,1 [0,9÷1,1]	1,1 [0,9÷1,2]	2,58 [2,40÷3,80]	3,0 [3,0÷4,4]	200,0 [100,0÷300,0]	101,0 [100,0÷104,0]
Шестая, плацебо после 6б	501,0 [456,8÷573,5] р1–6б=0,687 р6а–6б=0,725	1,0 [0,8÷1,2] р1–6б=0,949 р6а–6б=0,929	1,1 [0,9÷1,3] р1–6б=0,232 р6а–6б=0,520	0,9 [0,9÷1,0] р1–6б=0,644 р6а–6б=158	1,0 [1,0÷1,1] р1–6б=0,792 р6а–6б=0,347	2,60 [2,38÷3,24] р1–6б=0,185 р6а–6б=0,374	3,3 [3,0÷5,3] р1–6б=0,537 р6а–6б=0,866	100,0 [100,0÷200,0] р1–6б=0,714 р6а–6б=0,345	102,0 [98,0÷105,0] р1–6б=0,533 р6а–6б=0,798
Седьмая, ФМ до 7а	497,0 [391,0÷564,8]	0,9 [0,8÷1,1]	0,9 [0,8÷1,1]	1,0 [0,9÷1,1]	1,0 [1,0÷1,0]	3,10 [2,60÷3,60]	3,0 [3,0÷4,5]	100,0 [100,0÷225,0]	101,5 [99,5÷104,3]
Седьмая, ФМ после 7б	442,0 [396,0÷500,0] р7а–7б=0,430	0,9 [0,8÷1,2] р7а–7б=0,701	1,0 [0,9÷1,1] р7а–7б=0,650	0,9 [0,9÷1,0] р7а–7б=0,017	1,0 [0,9÷1,0] р7а–7б=0,279	3,15 [2,50÷3,90] р7а–7б=0,433	4,0 [3,0÷6,0] р7а–7б=0,161	200,0 [175,0÷225,0] р7а–7б=0,500	100,5 [95,3÷103,0] р7а–7б=0,445

Примечание: результаты представлены в виде Ме [25÷75], где Ме — медиана в выборочной совокупности; [25÷75] — 25-й и 75-й перцентили; р — уровень статистической значимости различий сравниваемых показателей; n — количество особей в группе; «до» — показатели до внутривенного введения плацебо или фибрина-мономера (ФМ), «­после» — показатели через 5 мин, 1 или 3 ч после введения плацебо или ФМ (соответственно группы 2 и 3; 4 и 5; 6 и 7); АПТВ — активированное парциальное тромбопластиновое время; ПВ — протромбиновое время; ТВ — тромбиновое время; ЭВ — эхитоксовое время; Фг — фибриноген; РФМК — растворимые фибрин-мономерные комплексы; АТ III — антитромбин III.

 

Ранее было отмечено, что вводимый в сосудистое русло ФМ способен циркулировать в нём длительное время (до нескольких суток), перемещаясь между кровеносной системой и периваскулярным пространством, попадая в лимфатические сосуды и снова возвращаясь в кровоток. В частности, И.В. Соболевой и соавт. [14] установлено присутствие ФМ в лимфе уже через 15 мин после его внутривенного введения, а через 2 ч концентрация данного белка превышает половину его концентрации в крови.

Переход ФМ в сгусток фибрина лимитируется рядом факторов, прежде всего фибриногеном, продуктами фибринолиза и фибриногенолиза, а также фибронектином, концентрация которых в плазме крови существенно выше по сравнению с взятой в работе дозой ФМ [8, 15]. Следовательно, можно допустить, что отсутствие системного гемостатического действия ФМ через 5 мин после его введения связано с недостаточным распределением в общей циркуляции в крови, а через 3 ч обусловлено перемещением данного производного фибриногена в периваскулярное пространство. Кроме того, действие ФМ может реализовываться через эффекторы, природа которых пока неизвестна.

Выводы

1. Фибрин-мономер в малых дозах (0,25 мг/кг) способен оказывать выраженный гемостатический эффект при его системном введении в период, предшествующий травме.

2. Кровоостанавливающая способность фибрина-мономера в применённой дозе максимально проявляется при его внутривенном введении за 1 ч до нанесения травмы.

 

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

Источники финансирования: грант РФФИ на реализацию научного проекта №18-415-220001; поддержка ООО «Технология-Стандарт» (г. Барнаул); ФГБОУ ВО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздрава России (г. Барнаул).

About the authors

V M Vdovin

Altai State Medical University; National Research Institute of Physiology and Basic Medicine

Author for correspondence.
Email: erytrab@gmail.com
Barnaul, Russia; Novosibirsk, Russia

A P Momot

National Research Institute of Physiology and Basic Medicine; National Research Center for Hematology, Altai Branch

Email: erytrab@gmail.com
Novosibirsk, Russia; Barnaul, Russia

D A Orekhov

Altai Regional Cardiology Health Center

Email: erytrab@gmail.com
Barnaul, Russia

I G Tolstokorov

Consulting Diagnostic Center «Dobryy Doktor» Ltd

Email: erytrab@gmail.com
Barnaul; Russia

V O Shevchenko

Consulting Diagnostic Center «Dobryy Doktor» Ltd

Email: erytrab@gmail.com
Barnaul; Russia

V O Krasyukova

Altai State Medical University

Email: erytrab@gmail.com
Barnaul, Russia

I I Shakhmatov

Altai State Medical University; National Research Institute of Physiology and Basic Medicine

Email: erytrab@gmail.com
Barnaul, Russia; Novosibirsk, Russia

N A Lycheva

Altai State Medical University; National Research Institute of Physiology and Basic Medicine

Email: erytrab@gmail.com
Barnaul, Russia; Novosibirsk, Russia

G G Belozerskaya

National Research Center for Hematology

Email: erytrab@gmail.com
Moscow, Russia

References

Supplementary files