Влияние модификации белковой частитромбопластина (фактора III) на его взаимодействие с факторами VII И V
- Авторы: Байкеев Р.Ф.1, Ченборисова Г.Ш.1
-
Учреждения:
- Казанский ордена Трудового Красного Знамени государственный медицинский институт им. С. В. Курашова
- Выпуск: Том 64, № 1 (1983)
- Страницы: 28-32
- Тип: Статьи
- Статья получена: 03.11.2021
- Статья одобрена: 03.11.2021
- Статья опубликована: 15.01.1983
- URL: https://kazanmedjournal.ru/kazanmedj/article/view/86313
- DOI: https://doi.org/10.17816/kazmj86313
- ID: 86313
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Было изучено влияние ферментативной модификации белковой части тромбопластина на его взаимодействие с факторами VII и V. Показано, что действие папаина на апопротеин нарушает взаимодействие указанных факторов с тромбопластином, в результате образуется активатор фактора X с меньшей активностью, чем до модификации.
Ключевые слова
Полный текст
Было изучено влияние ферментативной модификации белковой части тромбопластина на его взаимодействие с факторами VII и V. Показано, что действие папаина на апопротеин нарушает взаимодействие указанных факторов с тромбопластином, в результате образуется активатор фактора X с меньшей активностью, чем до модификации.
Тканевой тромбопластин (фактор III) — белково-липидный комплекс, который состоит из апопротеина и смеси фосфолипидов [7, 8]. Подобный комплекс служит наиболее сильным пусковым механизмом свертывающей системы плазмы крови и в условиях поврежденного кровяного русла представлен осколками разрушенных клеток эндотелия и других тканей [3]. Апопротеин III является интегральным гликопротеидом клеточных мембран, молекулярная масса его составляет около 52000 дальтон, содержание углеводов — 6 — 7% [8].
Тромбопластин образует стабильный комплекс с фактором VII в присутствии Са2+, при этом образуется активный фактор VIIa [16].
Физиологическая роль комплекса тромбопластин—фактор VII заключается в активировании фактора X путем протеолитического отщепления пептида в его тяжелой цепи [9]. Фактор Ха в присутствии ионов кальция, фосфолипидов и плазменного фактора V действует на свой субстрат — протромбин, из которого образуется тромбин. До настоящего времени не изучено влияние фактора V на этап взаимодействия фактора VII с тромбопластином.
Кроме того, комплекс тромбопластин — фактор VIIa инициирует реакции внутренней системы свертывания посредством активирования фактора IX [13, 17]. Этот факт может служить объяснением сравнительно слабой кровоточивости у людей с врожденными нарушениями начальной части внутреннего пути свертывания — дефицитом факторов XII, XI, прекалликреина, высокомолекулярного кининогена (ВМК).
Основное значение для проявления тромбопластического действия осколками клеточных мембран имеет распределение в них фосфатидилэтаноламина и фосфатидилсерина [3, 4, 14, 23]. Однако в последнее время появились сообщения, указывающие на то, что для коагуляционной активности важную роль играет состояние белков, встроенных в клеточные мембраны [15, 18, 20]. В исследованиях Д. М. Зубаирова и соавт. (1981) была изучена роль белковой части тканевого тромбопластина путем ее специфической ферментативной модификации. Воздействие на тромбопластин папаина приводило к уменьшению биологической активности тромбопластина. Предполагается, что белковый компонент тромбопластина важен для специфического распределения липидных составных частей, обеспечивающих взаимодействие с кальций связывающими участками факторов II, VII, X.
Задачей настоящей работы является изучение взаимодействия тромбопластина с факторами VII и V в условиях специфической ферментативной модификации папаином его белковой части.
Фактор VII получали по методу Вильямса и др. (1965). Препарат фактора VII использовали в конечной концентрации с Е1см-280 =0,125 в 0,01 М трис-НСІ, pH — 7,4. Для определения активности фактора VII применяли субстрат — оксалатную плазму, полностью дефицитную по факторам VII, XII, XI, калликреину [1]. Субстратная плазма содержала фибриноген, протромбин, факторы X, IX, VIII, V. При рекальцификации и добавлении тканевого тромбопластина субстратная плазма ввиду отсутствия факторов VII и XII не свертывалась более 24 ч. Коагулирование субстратной плазмы восстанавливалось лишь при добавлении фактора VII или фактора ХІа.
Фактор V получали по методу Папахадиопоулоса и др. (1964). Активность фактора V определяли по методу Вольфа (1953). Применяли препарат фактора V с активностью 100% в 0,05 М трис-НСІ pH = 7,35.
Нами использован препарат тканевого тромбопластина (Каунасское предприятие). Содержание кальция в нем составляло 2,6 мкмоль на 1 мг. Белковую часть тромбопластина протеолитически модифицировали папаином [5]. В дальнейшем тромбопластин с модифицированной белковой частью обозначали как фактор Шм, а немодифицированный тромбопластин — фактор Шн. Величины парциального торможения активности тромбопластина вычисляли по формуле: і = 1——Тн
Тм [2], где Тн — время свертывания плазмы крови в присутствии фактора Шн, Тм — время свертывания плазмы крови в присутствии фактора Шм.
Результаты анализировали статистически по Р. А. Фишеру (1958).
Было проделано 8 серий опытов по изучению взаимодействия факторов АП. А, Са2+ с тромбопластином путем различных сочетаний изучаемых компонентов. В первой серии опытов 4 мг фактора Шм или равное количество фактора Шн суспендировали в 1 мл раствора фактора VII, содержащего 0,005 М СаСl2. Обе пробы инкубировали в течение 3 мин при 37° С и охлаждали, помещая в тающий лед. Тромбопластин осаждали центрифугированием при 95000 d в течение 30 мин при 4° С. Супернатант удаляли. Эта комбинация обозначается как фактор III — (VII + Са2+).
Во второй серии были выполнены процедуры первой серии, но без добавления в систему кальция: фактор III—VII. Остаточное содержание кальция в препарате тромбопластина приблизительно в 500 раз меньше, чем в опытах с добавлением Са2+.
Осажденные центрифугированием препараты тромбопластина, полученные в этих сериях опытов, троекратно отмывали путем ресуспендирования и осаждения в 0,05 М трис-HCl, pH — 7,2. Отмытые препараты гомогенизировали пластиковым пестиком в 1 мл того же буфера. Об активности фактора VIIa, образовавшего комплекс с тромбопластином, судили по времени свертывания плазмы с полным дефицитом фактора VII [1]. Остаточную активность фактора VII в супернатантах, полученных в первой и второй сериях, определяли по времени свертывания той же плазмы в системе: 0,1 мл супернатанта + 0,1 мл фактора Шн (4мг/мл) + 0,1 плазмы с дефицитом фактора VII+0,2 мл хлористого кальция (0,025 М). Каждую серию опытов повторяли трижды. Результаты представлены в табл. 1.
Таблица 1
Взаимодействие тромбопластина с фактором VII и Са2 +
Серии № | Комплекс | Время свертывания, с | |||
осадок | супернатант | ||||
фактор ІII н | фактор Ш м | фактор ІII н | фактор III м | ||
1 2 | Фактор III—(VІІ4-Са2 +) Фактор III—VII | 2538±63 3433±83 | 3574±58 5041 ±99 | 7269±196 6136±218 | 5251±104 4807±203 |
Как видно из табл. 1, фактор VII, вступивший в комплекс С тканевым тромбопластином, восстанавливает способность к свертыванию субстратной плазмы с полным дефицитом факторов VIT, XI, XII, фактора Флетчера и ВМК. Полученные данные подтверждают известные сведения [16, 21], что ионы кальция необходимы для взаимодействия фактора VII с тромбопластином (табл. 1, серии 1, 2). В присутствии Са2+ большая часть фактора VII связывается с тромбопластином, а меньшая остается в супернатанте. Доля остающегося в супернатанте фактора VII после осаждения тромбопластина увеличивается в отсутствии Са2+ (Р< 0,01). Модификация белковой части тромбопластина приводит к увеличению остаточной активности фактора VII в супернатанте, не вступившего в комплекс с тканевым тромбопластином как в присутствии ионов Са2+ (Р< 0,001), так и без них (Р<0,002).
В третьей серии опытов последовательно инкубировали факторы IIIм и ІIIн сначала с фактором VII, а потом с фактором V в присутствии Са2+: фактор III — (VII + + Са2+)—(V + Са2+); в четвертой серии-—сначала с фактором V, а потом с фактором VII: фактор III — (V + Са2+) — (VII + Са2+); в пятой серии — одновременно с факторами V, VII и Са2+: фактор III— (VII + V + Са2+); в шестой серии факторы III м и III н инкубировали только с фактором VII и Са2+ фактор III — (ѴII + Са2+). Активность фактора VII определяли, как в первой серии опытов. Результаты приведены в табл. 2.
Таблица 2
Взаимодействие тромбопластина, факторов VII и V
Серии № | Комплекс | Время свертывания, с | і | |
фактор III н | фактор III м | |||
3 | Фактор III—(VI1 + +Са2+) —(V+Са2+) | 2450±45(1) 26,8±0,1 (2) | 3805±85(1) 43,4±1,2(2) | 0,356±0,25 0,382±0,012 |
4 | Фактор III—(V+Са2+) — — (VІІ+Са2+) | 2529±73(1) 27,0±0,4(2) | 3809±51 (1) 43,3±1,4(2) | 0,337±0,009 0,376±0,018 |
5 | Фактор III— (VII+V+ +Са2+) | 2519±58(1) 26,6±0,9(2) | 3794±79(1) 43,0±0,4(2) | 0,336±0,012 0,381 ±0,006 |
6 | Фактор III—(VІІ+Са2+) | 2494±52(1) 26,9±0,9(2) | 3757±52(1) 1 43,1±0,5(2) | 0,336±0,012 0,375±0,013 |
Примечание. 1— время свертывания субстратной плазмы, дефицитной по факторам VII, XI, XII, фактору Флетчера и ВМК;
2 — время свертывания нормальной лиофилизированной плазмы.
Из данных табл. 2 (3 — 5-е серии) видно, что связывание фактора VII с фактором III н не зависит от того, был ли фактор V добавлен в систему до, одновременно или после инкубации фактора VII с тромбопластином. Более того, исключение фактора V (6-я серия) не влияет на связывание фактора VII с тканевым тромбопластином. Модификация белковой части тромбопластина уменьшает активность образующегося комплекса фактор III — фактор VII. При использовании тестирующей системы с нормальным содержанием плазменных факторов свертывания крови ингибирование в пятой серии опытов было выражено в большей мере (P< 0,001).
В седьмой серии опытов факторы III м и III н инкубировали только с фактором V в присутствии Са2+: фактор III— (V + Са2+), а в восьмой серии при этом не использовали Са2+: фактор III + V. В контрольных опытах (9-я серия) фактор заменяли буферным раствором. О биологической активности препаратов судили по времени свертывания человеческой плазмы, дефицитной по фактору V [22]. Результаты приведены в табл. 3.
Таблица 3
Взаимодействие тромбопластина с фактором V
Серии № | Комплекс | Время свертывания, с | і | |
фактор III н | фактор III м | |||
7 | Фактор III—(V+Са2 + ) | 23,2±0,9 | 55,6±1,4 | 0,582±0,013 |
8 | Фактор III—V | 24,7±0,1 | 57,7±1,0 | 0,573±0,012 |
9 | Фактор III | 104,7± 1,6 | 157,0±1,6 | 0,333±0.054 |
Как видно, фактор V способен почти одинаковым образом взаимодействовать с тромбопластином как в присутствии, так и в отсутствии Са2+ (см. табл. 3, 7 и 8-я серии). Это объясняется, видимо, тем, что в составе самого фактора V им и я 1 грамм-атом на 300 000 дальтон прочно связанного кальция (11). Воздействие папаина на тромбопластин нарушает этот процесс, что выявляется при сравнении времени свертывания плазмы в присутствии фактора III м и фактора III н.
Как видно из сравнения результатов, приведенных в таблицах 2 и 3 (6 и 7-я серии), модификация белковой части тканевого тромбопластина в большей мере нарушает образование активного комплекса с фактором V, чем с фактором VII. Индексы ингибирования в седьмой (і = 0,528 ± 0,013) серии опытов больше (P< 0,001), чем в шестой (і = 0,336 ± 0,012).
На основании полученных данных можно заключить, что, помимо участия в активации фактора VII, апопротеин III важен еще для взаимодействия тканевого тромбопластина с фактором V. Об этом свидетельствует увеличение индекса ингибирования в тестирующей системе, специфически чувствительной к фактору V. Взаимодействие фактора V с тромбопластином (7 и 8-я серии) лишь незначительно зависит от ионов кальция. Отражением взаимодействия фактора V с апопротеином III, видимо, являются несколько большие индексы ингибирования в 3—6-й сериях опытов при выявлении активности тромбопластина не на дефицитной по фактору ѴП, а на нормальной плазме, где вклад фактора V в скорость образования фибрина, несомненно, больше ввиду меньшей специфичности данной тестирующей системы.
Фактор Va повышает сродство фактора Ха к отрицательно заряженным фосфолипидам [12]. В исследованиях методом 31Р-ЯМР показано, что добавление к смеси фосфатидилэтаноламина и фосфатидилхолина апопротеина тромбопластина приводит к иммобилизации на белке полярных головных групп этих липидов [10]. Ранее было показано [5], что при действии папаина на тромбопластин химическому изменению подвергается лишь его белковая часть, от которой отщепляется только 4,7 ±2,7% пептидного материала, а липидная часть остается химически неизмененной.
В наших исследованиях показано, что в специфичных системах по изучению факторов VII и V с тромбопластином в условиях модификации белковой части тромбопластина папаином образуется активатор фактора X с меньшей активностью, чем до модификации. Наблюдаемое явление в свете известных данных [5, 10] можно объяснить тем, что в результате воздействия папаина на белковую часть тромбопластина изменяется белково-липидное взаимодействие в тромбопластине и, как результат, нарушается взаимодействие тромбопластина с факторами VII и V.
Возможно, модификация белковой части тканевого тромбопластина отражается не только на взаимодействии с факторами VII, V, но и с протромбином и фактором X. Это вполне вероятно, так как, согласно матричной гипотезе свертывания крови [4], факторы VII, V, X и протромбин в присутствии Са2+ образуют функциональный ансамбль на поверхности осколков клеточных мембран.
Об авторах
Р. Ф. Байкеев
Казанский ордена Трудового Красного Знамени государственный медицинский институт им. С. В. Курашова
Автор, ответственный за переписку.
Email: info@eco-vector.com
кафедра биохимии
Россия, КазаньГ. Ш. Ченборисова
Казанский ордена Трудового Красного Знамени государственный медицинский институт им. С. В. Курашова
Email: info@eco-vector.com
кафедра биохимии
Россия, КазаньСписок литературы
- Байкеев Р. Ф. В кн.: Тезисы докладов V Всесоюзного симпозиума «Синтетические полимеры медицинского назначения». Рига, 1981 Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М., изд-во «Иностранная литература», М., 1961.
- Зубаиров Д. М., Грицук Г. Н., Владимирова Л. Ф. и др. В кн.: Система свертывания крови и фибринолиз. Киев, Здоров’я, 1969
- Зубаиров Д. М. Казанский мед. ж., 1977, 6.
- Зубаиров Д. М., Соболева И. В., Важинская 3. В. и др. Биохимия, 1981, 7.
- Фишер Р. А. Статистические методы для исследователей, М., 1958.
- Вjorklid E., Storm E., Prydz H. Biochem Biophys Res. Communs, 1973, 55, 3.
- Bjorklid E., Storm E., Biochem. J., 1977, 165, 1,
- Fujikawa К-, Titani K., Davie E. W. Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 1975, 72, 9.
- Gau-74, 12.— 18. Osterud B., Bö gw aid J., Lindahl U., S el j elie R., FEBSdiner I. E., Howell R. M. Biochem. Soc. Trans., 1981, 9, 1.
- Green- quist A. C., Colman R. W., Blood. 1975, 46, 5.
- Lindhout M., Gоwer- RiemslagJ., Rosing J., Hemker H., Thromb. and Haemost., 1981, 46, 1.
- Lindquist P. A., Fujikawa K., Davie E. W. J. Biol. Chem., 1978, 253, 6.
- Liy D. T. H., McCoy L. E., Thromb. Res., 1975, 7, 1.
- LybergT., Prydz H., Biochemistry, 1981, 194, 3.
- Nemerson Y., Esnouf M. P. Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 1937, 70, 2.
- Osterud B., Rapaport S. I. Jbid. 1977,Lett, 1981, 127, 1.— 19. Papahadjopoulos D., Hongie C., Nanahan D. J. Biochemistry, 1964, 3, 2.
- Prydz H., Allison A. C. Thromb. and Haemost., 1978, 39, 3.
- Williams W. J., Norris D. G., J. Biol. Chem., 1965, 241, 8.
- Wolf P. A. J. Clin. Path, 1953, 6, 1.
- Zwaal R. F. A., Biochim. et biophys acta, 1978, 515, 1.
Дополнительные файлы
![](/img/style/loading.gif)