Effect of modification of the protein part of thromboplastin (factor III) on its interaction with factors VII and Viii

Abstract

The effect of enzymatic modification of the protein part of thromboplastin on its interaction with factors VII and V. was studied. It has been shown that the effect of papain on apoprotein disrupts the interaction of these factors with thromboplastin, resulting in the formation of a factor X activator with less activity than before modification.

Full Text

Было изучено влияние ферментативной модификации белковой части тромбопластина на его взаимодействие с факторами VII и V. Показано, что действие папаина на апопротеин нарушает взаимодействие указанных факторов с тромбопластином, в результате образуется активатор фактора X с меньшей активностью, чем до модификации.

Тканевой тромбопластин (фактор III) — белково-липидный комплекс, который состоит из апопротеина и смеси фосфолипидов [7, 8]. Подобный комплекс служит наиболее сильным пусковым механизмом свертывающей системы плазмы крови и в условиях поврежденного кровяного русла представлен осколками разрушенных клеток эндотелия и других тканей [3]. Апопротеин III является интегральным гликопротеидом клеточных мембран, молекулярная масса его составляет около 52000 дальтон, содержание углеводов — 6 — 7% [8].

Тромбопластин образует стабильный комплекс с фактором VII в присутствии Са²+, при этом образуется активный фактор VIIa [16].

Физиологическая роль комплекса тромбопластин—фактор VII заключается в активировании фактора X путем протеолитического отщепления пептида в его тяжелой цепи [9]. Фактор Ха в присутствии ионов кальция, фосфолипидов и плазменного фактора V действует на свой субстрат — протромбин, из которого образуется тромбин. До настоящего времени не изучено влияние фактора V на этап взаимодействия фактора VII с тромбопластином.

Кроме того, комплекс тромбопластин — фактор VIIa инициирует реакции внутренней системы свертывания посредством активирования фактора IX [13, 17]. Этот факт может служить объяснением сравнительно слабой кровоточивости у людей с врожденными нарушениями начальной части внутреннего пути свертывания — дефицитом факторов XII, XI, прекалликреина, высокомолекулярного кининогена (ВМК).

Основное значение для проявления тромбопластического действия осколками клеточных мембран имеет распределение в них фосфатидилэтаноламина и фосфатидилсерина [3, 4, 14, 23]. Однако в последнее время появились сообщения, указывающие на то, что для коагуляционной активности важную роль играет состояние белков, встроенных в клеточные мембраны [15, 18, 20]. В исследованиях Д. М. Зубаирова и соавт. (1981) была изучена роль белковой части тканевого тромбопластина путем ее специфической ферментативной модификации. Воздействие на тромбопластин папаина приводило к уменьшению биологической активности тромбопластина. Предполагается, что белковый компонент тромбопластина важен для специфического распределения липидных составных частей, обеспечивающих взаимодействие с кальций связывающими участками факторов II, VII, X.

Задачей настоящей работы является изучение взаимодействия тромбопластина с факторами VII и V в условиях специфической ферментативной модификации папаином его белковой части.

Фактор VII получали по методу Вильямса и др. (1965). Препарат фактора VII использовали в конечной концентрации с Е1см-280 =0,125 в 0,01 М трис-НСІ, pH — 7,4. Для определения активности фактора VII применяли субстрат — оксалатную плазму, полностью дефицитную по факторам VII, XII, XI, калликреину [1]. Субстратная плазма содержала фибриноген, протромбин, факторы X, IX, VIII, V. При рекальцификации и добавлении тканевого тромбопластина субстратная плазма ввиду отсутствия факторов VII и XII не свертывалась более 24 ч. Коагулирование субстратной плазмы восстанавливалось лишь при добавлении фактора VII или фактора ХІа.

Фактор V получали по методу Папахадиопоулоса и др. (1964). Активность фактора V определяли по методу Вольфа (1953). Применяли препарат фактора V с активностью 100% в 0,05 М трис-НСІ pH = 7,35.

Нами использован препарат тканевого тромбопластина (Каунасское предприятие). Содержание кальция в нем составляло 2,6 мкмоль на 1 мг. Белковую часть тромбопластина протеолитически модифицировали папаином [5]. В дальнейшем тромбопластин с модифицированной белковой частью обозначали как фактор Шм, а немодифицированный тромбопластин — фактор Шн. Величины парциального торможения активности тромбопластина вычисляли по формуле: і = 1——Тн

 Тм [2], где Тн — время свертывания плазмы крови в присутствии фактора Шн, Тм — время свертывания плазмы крови в присутствии фактора Шм.

Результаты анализировали статистически по Р. А. Фишеру (1958).

Было проделано 8 серий опытов по изучению взаимодействия факторов АП. А, Са²+ с тромбопластином путем различных сочетаний изучаемых компонентов. В первой серии опытов 4 мг фактора Шм или равное количество фактора Шн суспендировали в 1 мл раствора фактора VII, содержащего 0,005 М СаСl2. Обе пробы инкубировали в течение 3 мин при 37° С и охлаждали, помещая в тающий лед. Тромбопластин осаждали центрифугированием при 95000 d в течение 30 мин при 4° С. Супернатант удаляли. Эта комбинация обозначается как фактор III — (VII + Са²+).

Во второй серии были выполнены процедуры первой серии, но без добавления в систему кальция: фактор III—VII. Остаточное содержание кальция в препарате тромбопластина приблизительно в 500 раз меньше, чем в опытах с добавлением Са²+.

Осажденные центрифугированием препараты тромбопластина, полученные в этих сериях опытов, троекратно отмывали путем ресуспендирования и осаждения в 0,05 М трис-HCl, pH — 7,2. Отмытые препараты гомогенизировали пластиковым пестиком в 1 мл того же буфера. Об активности фактора VIIa, образовавшего комплекс с тромбопластином, судили по времени свертывания плазмы с полным дефицитом фактора VII [1]. Остаточную активность фактора VII в супернатантах, полученных в первой и второй сериях, определяли по времени свертывания той же плазмы в системе: 0,1 мл супернатанта + 0,1 мл фактора Шн (4мг/мл) + 0,1 плазмы с дефицитом фактора VII+0,2 мл хлористого кальция (0,025 М). Каждую серию опытов повторяли трижды. Результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1

Взаимодействие тромбопластина с фактором VII и Са² +

Серии №	Комплекс	Время свертывания, с
		осадок		супернатант
		фактор ІII н	фактор Ш м	фактор ІII н	фактор III м
1 2	Фактор III—(VІІ4-Са2 +) Фактор III—VII	2538±63 3433±83	3574±58 5041 ±99	7269±196 6136±218	5251±104 4807±203

Как видно из табл. 1, фактор VII, вступивший в комплекс С тканевым тромбопластином, восстанавливает способность к свертыванию субстратной плазмы с полным дефицитом факторов VIT, XI, XII, фактора Флетчера и ВМК. Полученные данные подтверждают известные сведения [16, 21], что ионы кальция необходимы для взаимодействия фактора VII с тромбопластином (табл. 1, серии 1, 2). В присутствии Са²+ большая часть фактора VII связывается с тромбопластином, а меньшая остается в супернатанте. Доля остающегося в супернатанте фактора VII после осаждения тромбопластина увеличивается в отсутствии Са²+ (Р< 0,01). Модификация белковой части тромбопластина приводит к увеличению остаточной активности фактора VII в супернатанте, не вступившего в комплекс с тканевым тромбопластином как в присутствии ионов Са²+ (Р< 0,001), так и без них (Р<0,002).

В третьей серии опытов последовательно инкубировали факторы IIIм и ІIIн сначала с фактором VII, а потом с фактором V в присутствии Са²+: фактор III — (VII + + Са²+)—(V + Са²+); в четвертой серии-—сначала с фактором V, а потом с фактором VII: фактор III — (V + Са²+) — (VII + Са²+); в пятой серии — одновременно с факторами V, VII и Са²+: фактор III— (VII + V + Са²+); в шестой серии факторы III м и III н инкубировали только с фактором VII и Са²+ фактор III — (ѴII + Са²+). Активность фактора VII определяли, как в первой серии опытов. Результаты приведены в табл. 2.

Таблица 2

 Взаимодействие тромбопластина, факторов VII и V

Серии №	Комплекс	Время свертывания, с		і
		фактор III н	фактор III м
3	Фактор III—(VI1 + +Са2+) —(V+Са2+)	2450±45(1) 26,8±0,1 (2)	3805±85(1) 43,4±1,2(2)	0,356±0,25 0,382±0,012
4	Фактор III—(V+Са2+) — — (VІІ+Са2+)	2529±73(1) 27,0±0,4(2)	3809±51 (1) 43,3±1,4(2)	0,337±0,009 0,376±0,018
5	Фактор III— (VII+V+ +Са2+)	2519±58(1) 26,6±0,9(2)	3794±79(1) 43,0±0,4(2)	0,336±0,012 0,381 ±0,006
6	Фактор III—(VІІ+Са2+)	2494±52(1) 26,9±0,9(2)	3757±52(1) 1 43,1±0,5(2)	0,336±0,012 0,375±0,013

Примечание. 1— время свертывания субстратной плазмы, дефицитной по факторам VII, XI, XII, фактору Флетчера и ВМК;

2 — время свертывания нормальной лиофилизированной плазмы.

Из данных табл. 2 (3 — 5-е серии) видно, что связывание фактора VII с фактором III н не зависит от того, был ли фактор V добавлен в систему до, одновременно или после инкубации фактора VII с тромбопластином. Более того, исключение фактора V (6-я серия) не влияет на связывание фактора VII с тканевым тромбопластином. Модификация белковой части тромбопластина уменьшает активность образующегося комплекса фактор III — фактор VII. При использовании тестирующей системы с нормальным содержанием плазменных факторов свертывания крови ингибирование в пятой серии опытов было выражено в большей мере (P< 0,001).

В седьмой серии опытов факторы III м и III н инкубировали только с фактором V в присутствии Са²+: фактор III— (V + Са²+), а в восьмой серии при этом не использовали Са²+: фактор III + V. В контрольных опытах (9-я серия) фактор заменяли буферным раствором. О биологической активности препаратов судили по времени свертывания человеческой плазмы, дефицитной по фактору V [22]. Результаты приведены в табл. 3.

Таблица 3

Взаимодействие тромбопластина с фактором V

Серии №	Комплекс	Время свертывания, с		і
		фактор III н	фактор III м
7	Фактор III—(V+Са2 + )	23,2±0,9	55,6±1,4	0,582±0,013
8	Фактор III—V	24,7±0,1	57,7±1,0	0,573±0,012
9	Фактор III	104,7± 1,6	157,0±1,6	0,333±0.054

Как видно, фактор V способен почти одинаковым образом взаимодействовать с тромбопластином как в присутствии, так и в отсутствии Са²⁺ (см. табл. 3, 7 и 8-я серии). Это объясняется, видимо, тем, что в составе самого фактора V им и я 1 грамм-атом на 300 000 дальтон прочно связанного кальция (11). Воздействие папаина на тромбопластин нарушает этот процесс, что выявляется при сравнении времени свертывания плазмы в присутствии фактора III м и фактора III н.

Как видно из сравнения результатов, приведенных в таблицах 2 и 3 (6 и 7-я серии), модификация белковой части тканевого тромбопластина в большей мере нарушает образование активного комплекса с фактором V, чем с фактором VII. Индексы ингибирования в седьмой (і = 0,528 ± 0,013) серии опытов больше (P< 0,001), чем в шестой (і = 0,336 ± 0,012).

На основании полученных данных можно заключить, что, помимо участия в активации фактора VII, апопротеин III важен еще для взаимодействия тканевого тромбопластина с фактором V. Об этом свидетельствует увеличение индекса ингибирования в тестирующей системе, специфически чувствительной к фактору V. Взаимодействие фактора V с тромбопластином (7 и 8-я серии) лишь незначительно зависит от ионов кальция. Отражением взаимодействия фактора V с апопротеином III, видимо, являются несколько большие индексы ингибирования в 3—6-й сериях опытов при выявлении активности тромбопластина не на дефицитной по фактору ѴП, а на нормальной плазме, где вклад фактора V в скорость образования фибрина, несомненно, больше ввиду меньшей специфичности данной тестирующей системы.

Фактор Va повышает сродство фактора Ха к отрицательно заряженным фосфолипидам [12]. В исследованиях методом ³¹Р-ЯМР показано, что добавление к смеси фосфатидилэтаноламина и фосфатидилхолина апопротеина тромбопластина приводит к иммобилизации на белке полярных головных групп этих липидов [10]. Ранее было показано [5], что при действии папаина на тромбопластин химическому изменению подвергается лишь его белковая часть, от которой отщепляется только 4,7 ±2,7% пептидного материала, а липидная часть остается химически неизмененной.

В наших исследованиях показано, что в специфичных системах по изучению факторов VII и V с тромбопластином в условиях модификации белковой части тромбопластина папаином образуется активатор фактора X с меньшей активностью, чем до модификации. Наблюдаемое явление в свете известных данных [5, 10] можно объяснить тем, что в результате воздействия папаина на белковую часть тромбопластина изменяется белково-липидное взаимодействие в тромбопластине и, как результат, нарушается взаимодействие тромбопластина с факторами VII и V.

Возможно, модификация белковой части тканевого тромбопластина отражается не только на взаимодействии с факторами VII, V, но и с протромбином и фактором X. Это вполне вероятно, так как, согласно матричной гипотезе свертывания крови [4], факторы VII, V, X и протромбин в присутствии Са²+ образуют функциональный ансамбль на поверхности осколков клеточных мембран.