Стабильность антигенных и иммуногенных свойств очищенных сорбированных дифтерийных анатоксинов, изготовленных на среде триптического переваривания с энтерокиназой

Аннотация

Для профилактики дифтерии широко используются ассоциированные препараты (для вакцинации) и сорбированный дифтерийный анатоксин (для ревакцинации), и вопрос о стабильности антигенных и иммуногенных свойств приобретает особо важное значение.

Полный текст

Исследования Г. Рамона, А. Э. Озола, М. П. Вагнер-Сахаровой, Л. А. Левченко показали, что дифтерийные анатоксины, изготовленные на бульоне Мартена, сохраняют свои исходные свойства 4—5 лет. По данным Е. А. Ильницкой, дифтерийные анатоксины, полученные на среде триптического переваривания в модификации Вагнер-Сахаровой с сотрудниками, также стабильны по антигенным и иммуногенным свойствам.

Существующий метод проверки стабильности препарата путем выдерживания его при комнатной температуре в течение 2—5 лет мало приемлем в условиях производства из-за длительности срока наблюдения. По ускоренному методу Холта, предложенному в 1952 г., дифтерийные анатоксины выдерживают в течение трех месяцев при температуре +37°C с последующей проверкой качественных показателей препарата.

Так как ускоренный тест контроля стабильности дифтерийных анатоксинов имеет важное значение, мы исследовали влияние более высокой температуры на физические, антигенные и иммуногенные свойства выпускаемых нами сорбированных дифтерийных анатоксинов, изготовленных на среде триптического переваривания с энтерокиназой.

Предъявляя к препарату более высокие требования, мы модифицировали метод Холта и выдерживали отдельные производственные серии сорбированного дифтерийного анатоксина во флаконах емкостью 50 мл в термостате при температуре +40° С в течение двух месяцев. Через 30 и 60 дней изучали физические свойства, сохранение полноты сорбции, безвредность, антигенную и иммуногенную активность. Исследовано 15 производственных серий.

Физические свойства препарата определялись визуально, полнота сорбции антигена — реакцией флокуляции смеси токсина с надосадочной жидкостью по принятой методике, сохранение антигенной активности препарата определялось по содержанию АЕ в 1 мл элуата, безвредность проверялась на кроликах породы шиншила весом 2,5—3,2 кг путем введения внутрикожно 0,2 мл Элуата, а также на морских свинках весом 300—350 г введением под кожу в оба бока по 2,5 мл анатоксина. Иммуногенность препарата испытывалась на белых мышах и морских свинках двумя методами: 1) определением содержания антитоксина в крови иммунизированных животных и 2) определением устойчивости морских свинок к дифтерийному токсину.

Для определения полноты сорбции и титра сорбированные дифтерийные анатоксины, выдержанные в термостате в течение 30 и 60 дней при температуре 4-40° С, подвергались процессу десорбции по несколько измененной методике И. М. Хабас с соавторами. Препарат в количестве 25—50 мл разливали в центрифужные пробирки и подвергали центрифугированию 15—20 минут при 1500—2000 оборотах в минуту. Отделившуюся прозрачную надосадочную жидкость отсасывали пипеткой (или 5—20 см³ шприцем) и определяли в ней содержание АЕ в 1 мл. Образовавшийся осадок для более полной десорбции элуировали в два приема 2,4%. раствором двузамещенного фосфорнокислого натрия (Na2HPO4), подогретым до 30°. Эти воздействия не повлияли на физические свойства препарата. Все анатоксины имели прозрачную надосадочную жидкость и белый гомогенный осадок, при взбалтывании которого образовывалась так же, как у исходных серий препарата, гомогенная мелкодисперсная суспензия.

Все серии хорошо сохраняли полноту сорбции антигена, только в двух сериях в надосадочной жидкости мы определили наличие 2 АЕ. В десорбированном препарате после действия фактора температуры в течение 30 дней содержание АЕ в 1 мл полностью соответствовало исходному титру (60 АЕ). При выдерживании в условиях указанной температуры в течение 60 дней у отдельных серий отмечалось незначительное падение титра (на 2—4 АЕ).

Время флокуляции (КФ) десорбированного препарата в обоих случаях соответствовало исходному. При внутрикожном введении элуата шести серий кроликам на безвредность местная реакция или отсутствовала, или выражалась в виде небольшого покраснения в первые дни, исчезающего к 3—4 дню. При определении безвредности гретого препарата на морских свинках в первые дни наблюдались небольшие отеки, переходящие к 3—4 дню в инфильтраты, которые позднее формировались в уплотнения (депо) величиной с горошину. Животные на протяжении всего периода наблюдений (30—40 дней) прибывали в весе. Случаев изъязвления и некрозов на месте инъекции не наблюдалось.

Для определения иммуногенной активности гретого препарата использован метод биологического контроля на белых мышах и морских свинках.

Белые мыши весом 16—20 г были разделены на 3 группы по 10—15 в группе. Под кожу белым мышам 1-й группы вводили 0,5 мл исходного препарата, 2-й—0,5 мл анатоксина, выдержанного при температуре + 40° С в течение 30 дней, и 3-й — 0,5 мл выдержанного 60 дней. Спустя 3 недели животных обескровлизали, и в 1 мл смеси сывороток каждой группы определяли содержание антитоксина методом Ремера.

Сорбированный дифтерийный анатоксин в дозе 0,5 мл, выдержанный в течение 30 и 60 дней, способен вызвать образование антитоксина в титрах 2,2 АЕ и 2,1 АЕ в 1 мл у однократно иммунизированных белых мышей. Это показатели в 2 раза выше титров, допустимых инструкцией.

Результаты опытов на белых мышах было интересно сопоставить с титрами антитоксина, полученными у морских свинок. Морские свинки весом 300—350 г также были разбиты на три группы. Животные I группы иммунизировались гретым в течение 30 дней сорбированным дифтерийным анатоксином в дозе 0,1 мл, II группы — той же дозой препарата, гретого 60 дней, и III — исходным. Через 28 дней у морских свинок всех групп брали кровь, и в смеси сывороток каждой группы определяли содержание антитоксина. У морских свинок І и II групп содержание антитоксина в 1 мл сыворотки крови составляет по 2,1 АЕ, в III (контрольной) группе — 2,5 АЕ. Спустя 30 дней животным всех трех групп вводили 100 ДЛМ дифтерийного токсина,

Доза 0,1 мл (6 АЕ) сорбированного дифтерийного анатоксина, выдержанного при температуре +40° С в течение 30 дней, создает у однократно иммунизированных морских свинок хорошую резистентность к 100 ДЛМ дифтерийного токсина при проверке семи серий.

После прогревания из 7 серий препарата 5 серий сохранили -100-процентную иммуногенную активность. В двух сериях (с.с. 182, 185) из пяти иммунизированных животных пали по одной морской свинке. У четырех серий препарата испытана выборочно устойчивость животных к 200 ДЛМ дифтерийного токсина; иммуногенность была также 100%.

При воздействии температуры +40° С в течение 60 дней из 9 изученных серий 5 сохранили полностью иммуногенную активность (с.с. 151, 149, 147, 172, 168). В трех сериях (с.с. 145, 152, 163) пали по одной морской свинке, и только одна серия (с. 170) не обеспечила достаточной выработки иммунитета. Иммуногенная активность сохранилась лишь на 50%. Следовательно, воздействие температуры +40^о С в течение 30—60 дней позволяет при одной и той же иммунизирующей дозе — 0,1 мл (6 АЕ) более полно дифференцировать производственные серии препарата по их иммуногенной активности.

У животных, иммунизированных 0,1 мл препарата, выдержанного в термостате 30—60 дней, при введении 100 ДЛМ дифтерийного токсина показатели местной реакции существенно не отличаются от таковых у животных контрольной группы.

Для более дифференцированного изучения иммуногенной активности гретого препарата мы снижали величину дозы в 2 и 5 раз с последующим определением иммуногенности. Белым мышам, разделенным на три группы (по 10—15 животных), вводилось соответственно 0,5—0,25—0,1 мл очищенного сорбированного дифтерийного анатоксина.

Статистические исследования показали, что между иммунизирующей дозой (х} и исходным (у) и гретым (z) дифтерийными анатоксинами существует весьма тесная положительная линейная корреляционная связь, именно: гху = 0,91265; rxz = 0,9355.

Результаты опытов на белых мышах сопоставлены с таковыми на морских свинках. Испытуемая серия препарата в дозе 0,05 мл вводилась трем группам морских свинок. Первую группу животных иммунизировали препаратом, гретым при +40° С в течение 30 дней, вторую — гретым 60 дней и третью — исходным дифтерийным анатоксином (контроль). Спустя 30 дней у морских свинок всех групп определялась напряженность иммунитета к введению 100 ДЛМ дифтерийного токсина.

В первой группе 3 серии (сс. 145, 151, 149) сохранили 100% иммуногенную активность по отношению к контрольной, только в одной серии (с. 147) пала одна морская свинка. В трех сериях была испытана напряженность к введению 200 ДЛМ дифтерийного токсина. При этом из 6 морских свинок пала только одна с выраженными явлениями дифтерийной интоксикации. Во второй группе две серии (сс. 149, 151) сохранили 100% активность. В третьей группе (контроль) в трех сериях иммуногенная активность составила 100% и только в одной серии (с. 145) пала одна морская свинка.

Исследования с применением уменьшенной дозы препарата позволяют более четкой углубленно дифференцировать иммуногенную активность отдельных производственных серий очищенного сорбированного дифтерийного анатоксина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследования по изучению стабильности антигенных и иммуногенных свойств сорбированных дифтерийных анатоксинов, изготовленных на среде триптического переваривания с энтерокиназой, показали, что экспозиция препарата при температуре +40° в течение 30 и 60 дней не изменяет физических свойств. Все серии анатоксина хорошо сохранили гомогенность. При воздействии температуры в течение 30 дней антигенные свойства анатоксина сохраняются полностью, воздействие в течение 60 дней в отдельных сериях препарата снижает силу всего лишь на 2—4 АЕ. Действие температуры +40^о 30 и 60 дней не влияет на полноту сорбции антигена, а также на безвредность. Очищенные сорбированные дифтерийные анатоксины имеют хорошую иммуногенную активность и способны вырабатывать в крови однократно иммунизированных белых мышей антитоксин в количестве 2,2 АЕ и 2,1 АЕ и в крови морских свинок 2,1 АЕ. Морские свинки, иммунизированные гретым 30—60 дней препаратом, устойчивы к 100—200 ДЛМ дифтерийного токсина. Иммунизаторный эффект гретого препарата зависит от величины иммунизирующей дозы (Р. Г. Мухутдинова и В. М. Шаровская, 1963).

Использование модифицированного метода Холта (выдерживание при температуре +40° в течение 60 дней) в сочетании с уменьшением иммунизирующей дозы при биологическом контроле позволяет в условиях производства более четко дифференцировать изготовляемые серии прививочного препарата по их иммуногенным свойствам и объективно оценивать активность дифтерийного анатоксина в моно- и в ассоциированных препаратах.