Stability of antigenic and immunogenic properties of purified sorbed diphtheria toxoids prepared on tryptic digestion medium with enterokinase

Abstract

Associated preparations (for vaccination) and sorbed diphtheria toxoid (for revaccination) are widely used for diphtheria prophylaxis, and the issue of stability of antigenic and immunogenic properties is particularly important.

Full Text

Для профилактики дифтерии широко используются ассоциированные препараты (для вакцинации) и сорбированный дифтерийный анатоксин (для ревакцинации), и вопрос о стабильности антигенных и иммуногенных свойств приобретает особо важное значение.

Исследования Г. Рамона, А. Э. Озола, М. П. Вагнер-Сахаровой, Л. А. Левченко показали, что дифтерийные анатоксины, изготовленные на бульоне Мартена, сохраняют свои исходные свойства 4—5 лет. По данным Е. А. Ильницкой, дифтерийные анатоксины, полученные на среде триптического переваривания в модификации Вагнер-Сахаровой с сотрудниками, также стабильны по антигенным и иммуногенным свойствам.

Существующий метод проверки стабильности препарата путем выдерживания его при комнатной температуре в течение 2—5 лет мало приемлем в условиях производства из-за длительности срока наблюдения. По ускоренному методу Холта, предложенному в 1952 г., дифтерийные анатоксины выдерживают в течение трех месяцев при температуре +37°C с последующей проверкой качественных показателей препарата.

Так как ускоренный тест контроля стабильности дифтерийных анатоксинов имеет важное значение, мы исследовали влияние более высокой температуры на физические, антигенные и иммуногенные свойства выпускаемых нами сорбированных дифтерийных анатоксинов, изготовленных на среде триптического переваривания с энтерокиназой.

Предъявляя к препарату более высокие требования, мы модифицировали метод Холта и выдерживали отдельные производственные серии сорбированного дифтерийного анатоксина во флаконах емкостью 50 мл в термостате при температуре +40° С в течение двух месяцев. Через 30 и 60 дней изучали физические свойства, сохранение полноты сорбции, безвредность, антигенную и иммуногенную активность. Исследовано 15 производственных серий.

Физические свойства препарата определялись визуально, полнота сорбции антигена — реакцией флокуляции смеси токсина с надосадочной жидкостью по принятой методике, сохранение антигенной активности препарата определялось по содержанию АЕ в 1 мл элуата, безвредность проверялась на кроликах породы шиншила весом 2,5—3,2 кг путем введения внутрикожно 0,2 мл Элуата, а также на морских свинках весом 300—350 г введением под кожу в оба бока по 2,5 мл анатоксина. Иммуногенность препарата испытывалась на белых мышах и морских свинках двумя методами: 1) определением содержания антитоксина в крови иммунизированных животных и 2) определением устойчивости морских свинок к дифтерийному токсину.

Для определения полноты сорбции и титра сорбированные дифтерийные анатоксины, выдержанные в термостате в течение 30 и 60 дней при температуре 4-40° С, подвергались процессу десорбции по несколько измененной методике И. М. Хабас с соавторами. Препарат в количестве 25—50 мл разливали в центрифужные пробирки и подвергали центрифугированию 15—20 минут при 1500—2000 оборотах в минуту. Отделившуюся прозрачную надосадочную жидкость отсасывали пипеткой (или 5—20 см³ шприцем) и определяли в ней содержание АЕ в 1 мл. Образовавшийся осадок для более полной десорбции элуировали в два приема 2,4%. раствором двузамещенного фосфорнокислого натрия (Na2HPO4), подогретым до 30°. Эти воздействия не повлияли на физические свойства препарата. Все анатоксины имели прозрачную надосадочную жидкость и белый гомогенный осадок, при взбалтывании которого образовывалась так же, как у исходных серий препарата, гомогенная мелкодисперсная суспензия.

Все серии хорошо сохраняли полноту сорбции антигена, только в двух сериях в надосадочной жидкости мы определили наличие 2 АЕ. В десорбированном препарате после действия фактора температуры в течение 30 дней содержание АЕ в 1 мл полностью соответствовало исходному титру (60 АЕ). При выдерживании в условиях указанной температуры в течение 60 дней у отдельных серий отмечалось незначительное падение титра (на 2—4 АЕ).

Время флокуляции (КФ) десорбированного препарата в обоих случаях соответствовало исходному. При внутрикожном введении элуата шести серий кроликам на безвредность местная реакция или отсутствовала, или выражалась в виде небольшого покраснения в первые дни, исчезающего к 3—4 дню. При определении безвредности гретого препарата на морских свинках в первые дни наблюдались небольшие отеки, переходящие к 3—4 дню в инфильтраты, которые позднее формировались в уплотнения (депо) величиной с горошину. Животные на протяжении всего периода наблюдений (30—40 дней) прибывали в весе. Случаев изъязвления и некрозов на месте инъекции не наблюдалось.

Для определения иммуногенной активности гретого препарата использован метод биологического контроля на белых мышах и морских свинках.

Белые мыши весом 16—20 г были разделены на 3 группы по 10—15 в группе. Под кожу белым мышам 1-й группы вводили 0,5 мл исходного препарата, 2-й—0,5 мл анатоксина, выдержанного при температуре + 40° С в течение 30 дней, и 3-й — 0,5 мл выдержанного 60 дней. Спустя 3 недели животных обескровлизали, и в 1 мл смеси сывороток каждой группы определяли содержание антитоксина методом Ремера.

Сорбированный дифтерийный анатоксин в дозе 0,5 мл, выдержанный в течение 30 и 60 дней, способен вызвать образование антитоксина в титрах 2,2 АЕ и 2,1 АЕ в 1 мл у однократно иммунизированных белых мышей. Это показатели в 2 раза выше титров, допустимых инструкцией.

Результаты опытов на белых мышах было интересно сопоставить с титрами антитоксина, полученными у морских свинок. Морские свинки весом 300—350 г также были разбиты на три группы. Животные I группы иммунизировались гретым в течение 30 дней сорбированным дифтерийным анатоксином в дозе 0,1 мл, II группы — той же дозой препарата, гретого 60 дней, и III — исходным. Через 28 дней у морских свинок всех групп брали кровь, и в смеси сывороток каждой группы определяли содержание антитоксина. У морских свинок І и II групп содержание антитоксина в 1 мл сыворотки крови составляет по 2,1 АЕ, в III (контрольной) группе — 2,5 АЕ. Спустя 30 дней животным всех трех групп вводили 100 ДЛМ дифтерийного токсина,

Доза 0,1 мл (6 АЕ) сорбированного дифтерийного анатоксина, выдержанного при температуре +40° С в течение 30 дней, создает у однократно иммунизированных морских свинок хорошую резистентность к 100 ДЛМ дифтерийного токсина при проверке семи серий.

После прогревания из 7 серий препарата 5 серий сохранили -100-процентную иммуногенную активность. В двух сериях (с.с. 182, 185) из пяти иммунизированных животных пали по одной морской свинке. У четырех серий препарата испытана выборочно устойчивость животных к 200 ДЛМ дифтерийного токсина; иммуногенность была также 100%.

При воздействии температуры +40° С в течение 60 дней из 9 изученных серий 5 сохранили полностью иммуногенную активность (с.с. 151, 149, 147, 172, 168). В трех сериях (с.с. 145, 152, 163) пали по одной морской свинке, и только одна серия (с. 170) не обеспечила достаточной выработки иммунитета. Иммуногенная активность сохранилась лишь на 50%. Следовательно, воздействие температуры +40^о С в течение 30—60 дней позволяет при одной и той же иммунизирующей дозе — 0,1 мл (6 АЕ) более полно дифференцировать производственные серии препарата по их иммуногенной активности.

У животных, иммунизированных 0,1 мл препарата, выдержанного в термостате 30—60 дней, при введении 100 ДЛМ дифтерийного токсина показатели местной реакции существенно не отличаются от таковых у животных контрольной группы.

Для более дифференцированного изучения иммуногенной активности гретого препарата мы снижали величину дозы в 2 и 5 раз с последующим определением иммуногенности. Белым мышам, разделенным на три группы (по 10—15 животных), вводилось соответственно 0,5—0,25—0,1 мл очищенного сорбированного дифтерийного анатоксина.

Статистические исследования показали, что между иммунизирующей дозой (х} и исходным (у) и гретым (z) дифтерийными анатоксинами существует весьма тесная положительная линейная корреляционная связь, именно: гху = 0,91265; rxz = 0,9355.

Результаты опытов на белых мышах сопоставлены с таковыми на морских свинках. Испытуемая серия препарата в дозе 0,05 мл вводилась трем группам морских свинок. Первую группу животных иммунизировали препаратом, гретым при +40° С в течение 30 дней, вторую — гретым 60 дней и третью — исходным дифтерийным анатоксином (контроль). Спустя 30 дней у морских свинок всех групп определялась напряженность иммунитета к введению 100 ДЛМ дифтерийного токсина.

В первой группе 3 серии (сс. 145, 151, 149) сохранили 100% иммуногенную активность по отношению к контрольной, только в одной серии (с. 147) пала одна морская свинка. В трех сериях была испытана напряженность к введению 200 ДЛМ дифтерийного токсина. При этом из 6 морских свинок пала только одна с выраженными явлениями дифтерийной интоксикации. Во второй группе две серии (сс. 149, 151) сохранили 100% активность. В третьей группе (контроль) в трех сериях иммуногенная активность составила 100% и только в одной серии (с. 145) пала одна морская свинка.

Исследования с применением уменьшенной дозы препарата позволяют более четкой углубленно дифференцировать иммуногенную активность отдельных производственных серий очищенного сорбированного дифтерийного анатоксина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследования по изучению стабильности антигенных и иммуногенных свойств сорбированных дифтерийных анатоксинов, изготовленных на среде триптического переваривания с энтерокиназой, показали, что экспозиция препарата при температуре +40° в течение 30 и 60 дней не изменяет физических свойств. Все серии анатоксина хорошо сохранили гомогенность. При воздействии температуры в течение 30 дней антигенные свойства анатоксина сохраняются полностью, воздействие в течение 60 дней в отдельных сериях препарата снижает силу всего лишь на 2—4 АЕ. Действие температуры +40^о 30 и 60 дней не влияет на полноту сорбции антигена, а также на безвредность. Очищенные сорбированные дифтерийные анатоксины имеют хорошую иммуногенную активность и способны вырабатывать в крови однократно иммунизированных белых мышей антитоксин в количестве 2,2 АЕ и 2,1 АЕ и в крови морских свинок 2,1 АЕ. Морские свинки, иммунизированные гретым 30—60 дней препаратом, устойчивы к 100—200 ДЛМ дифтерийного токсина. Иммунизаторный эффект гретого препарата зависит от величины иммунизирующей дозы (Р. Г. Мухутдинова и В. М. Шаровская, 1963).

Использование модифицированного метода Холта (выдерживание при температуре +40° в течение 60 дней) в сочетании с уменьшением иммунизирующей дозы при биологическом контроле позволяет в условиях производства более четко дифференцировать изготовляемые серии прививочного препарата по их иммуногенным свойствам и объективно оценивать активность дифтерийного анатоксина в моно- и в ассоциированных препаратах.