Молекулярно-генетическая характеристика гемостаза пациентов при геморрагической лихорадке с почечным синдромом

Полный текст

Актуальность. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) — распространённое на территории Удмуртской Республики природно-очаговое заболевание, вызываемое РНК-содержащим1 вирусом из семейства Hantaviridae. Несмотря на значительное генетическое разнообразие представителей этого семейства, на территории республики встречается преимущественно серотип Puumala [1, 2].

Клиническая картина и течение ГЛПС отличаются известным полиморфизмом — наряду с типичными легко и среднетяжело протекающими цикличными формами заболевания встречаются тяжёлые случаи, осложнённые инфекционно-токсическим шоком, отёком лёгких, синдромом диссеминированного внутрисосудистого свёртывания (ДВС-синдромом), острой почечной недостаточностью, возникают летальные исходы [2].

Одним из вариантов объяснения разнообразия клинической картины заболевания может быть индивидуальность реакции организма человека на хантавирусную инфекцию, обусловленная генетическими особенностями. Так, в последнее время изучены ассоциации полиморфизмов в генах белков иммунной системы (МНС, TNF, IL1) [3–7], эндотелия (VE-кадгерин, NOS) [8, 9], гемостаза (SERPINE1, ITGA2B) [10, 11], системы детоксикации (CYP1A1, GSTP1) [12] и их связь с тяжестью течения ГЛПС.

Существуют данные о том, что гаплотипы B*08-DRB1*03 [4, 13] и B*46-DRB1*09, B*51-DRB1*09 в гене HLA связаны с более тяжёлой формой ГЛПС [14, 15], а аллели В*27 и DRB1*15 — с лёгким течением заболевания [16].

Есть указания, что аллель А и генотип АА полиморфизма –308G>A (rs1800629) в гене TNF [6, 7, 17], генотип ТТ 1550T>C гена CDH5 (rs1049970) [8], аллель G в полиморфизме –844A>G (rs2227631) гена SERPINE1 [10], аллели HPA3 B [18], генотип TT гена eNOS:894G/T [9], генотипы 1А2С и AG полиморфных локусов rs1048943 гена CYP1A1 и rs1695 гена GSTP влияют на тяжесть течения ГЛПС [12].

Известно об изменении уровня экспрессии генов GATA3 [19, 20], T-BET, CD3, IFNβ, NFkB, STAT1 и MxA [20] в клеточных культурах при инфицировании хантавирусом.

В этой связи считаем актуальным проведение молекулярно-генетического исследования однонуклеотидного полиморфизма генов свёртывающей системы крови и обмена фолатов больных ГЛПС для установления их влияния на особенности клинической картины заболевания.

Однонуклеотидный полиморфизм представляет собой отличие последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) размером в один нуклеотид в геноме человека и возникает в результате точечных мутаций. Считают, что однонуклеотидные полиморфизмы генов самостоятельно не приводят к ­заболеваниям, а лишь сказываются на ­восприимчивости к ­заболеваниям и вносят особенности в их ­течение.

Цель работы: оценить прогностическое значение однонуклеотидных полиморфизмов генов системы гемостаза и фолатного цикла при ГЛПС.

Материал и методы исследования. В основу работы положены результаты ретроспективного исследования, организованного в весенне-летний период 2019 г. Больные ГЛПС находились на стационарном лечении в Республиканской клинической инфекционной больнице г. Ижевска [21]. Все больные проживали на территории природного очага, диагноз ГЛПС во всех случаях имел серологическое подтверждение с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) [2].

Критерии включения — поступление на стационарное лечение в первые 48 ч от начала заболевания, клинико-эпидемиологические признаки ГЛПС при поступлении, возраст 25–66 лет, отсутствие хронической соматической патологии, курения и злоупотребления алкоголем.

Критерии последующего исключения — отрицательный результат в ИФА (серологичес­кое исключение ГЛПС), лёгкое течение забо­левания.

Все больные получали однотипную патогенетическую терапию, при возникновении осложнений лечение дополняли согласно клиническим рекомендациям. Для оценки тяжести течения ГЛПС использовали балльную систему, в которой учитываются нарушения гемодинамики, мочеобразования, появление геморрагического синдрома, уровень креатинина сыворотки крови, наличие отёка мозга и лёгких, разрыва почки [22]. В качестве осложнений регистрировали инфекционно-токсический шок (ИТШ) в декомпенсированной стадии, отёк лёгких в альвеолярной стадии, острое повреждение почек (ОПП) класса F по классификации RIFLE2 [2, 23].

Исследование одобрено локальным этическим комитетом Ижевской государственной медицинской академии (протокол №654 от 23.04.2019). Все пациенты дали письменное информированное согласие на участие в исследовании.

В ходе пилотного исследования были сформированы две группы больных (табл. 1, 2):
– первая группа — 13 человек, перенёсших среднетяжёлую (неосложнённую) клиническую форму заболевания;
– во вторую группу объединили 30 больных с тяжёлым и осложнённым течением ГЛПС.

 

Таблица 1. Клинико-лабораторная характеристика пациентов, включённых в исследование

Оцениваемые параметры	Больные первой группы — ГЛПС, средней степени тяжести (n=13)	Больные второй группы — ГЛПС, тяжёлое (осложнённое) течение (n=30)	Уровень значимости различий между группами
Возраст, годы	39,0 [34, 0; 45, 0]	42,5 [37, 0; 52, 0]	0,255
Мужчины	12	25	0,4354
Женщины	1	5	0,4354
Степень тяжести течения ГЛПС, баллы	5,0 [5, 0; 6, 0]	22,0 [21, 0; 26, 0]	˂0,001
Температура тела (макс.), °С	39,0 [39, 0; 39, 0]	39,0 [39, 0; 39, 5]	0,457
Длительность лихорадки >37 °С, дни	6,0 [5, 0; 8, 0]	7,0 [6, 0; 8, 0]	0,15
Геморрагический синдром (кровоподтёки на коже, носовое кровотечение), %	0	16,67	0,1174
Боль в поясничной области, %	53,85	76,67	0,1345
Олигурия, анурия, %	84,62	96,67	0,1543
Эритроциты крови, ×1012/л	4,77 [4, 42; 5, 07]	4,75 [4, 1; 5, 36]	1,0
Лейкоциты крови, ×109/л	10,9 [8; 13, 3]	15,1 [10, 9; 19, 1]	0,012
Палочкоядерные нейтрофилы, %	8,0 [5, 0; 12, 0]	7,0 [4, 0; 14, 0]	0,851
Лимфоциты, %	17,0 [15, 0; 21, 0]	13,0 [8, 0; 17, 0]	0,056
Тромбоциты, ×109/л	64,0 [53, 0; 83, 0]	58,5 [38, 7; 87, 0]	0,751
Скорость оседания эритроцитов, мм/ч	20,0 [17, 0; 31, 0]	11,5 [6, 0; 18, 0]	0,003
Протеинурия >0,030 г/л, %	100	100	—
Протеинурия, г/л	502,0 [396, 0; 1016, 0]	1920,0 [1205, 0; 3307, 0]	˂0,001
Лейкоцитурия >4 в поле зрения, %	7,69	60	0,0015
Эритроцитурия >2 в поле зрения, %	30,77	76,67	0,0042
Клетки почечного эпителия >2 в поле зрения, %	23,08	83,33	0,0001
Мочевина >8,5 ммоль/л, %	46,15	96,67	0,0001
Мочевина, ммоль/л	8,3 [6, 5; 10, 7]	32,95 [16, 4; 48, 6]	˂0,001
Креатинин >100 мкмоль/л, %	61,54	100	0,0003
Креатинин, мкмоль/л	132,0 [98, 0; 143, 0]	432,75 [211, 4; 701, 0]	˂0,001
Антитела к вирусу ГЛПС класса IgM (+), %	100	100	—

Примечание: ГЛПС — геморрагическая лихорадка с почечным синдромом; Ig — иммуноглобулин.

 

Таблица 2. Частота регистрации осложнений геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) у ­пациентов сравниваемых групп

Осложнения	Больные первой группы — ГЛПС, средней степени тяжести (n=13)	Больные второй группы — ГЛПС, тяжёлое (осложнённое) течение (n=30)	Уровень значимости различий между группами
Летальность, %	0	3,33	0,5054
Инфекционно-токсический шок, %	0	33,33	0,0175
Отёк лёгких, %	0	20	0,0822
Острое повреждение почек класса F по RIFLE, %	7,69	63,33	0,0008
Гемодиализ, %	0	10	0,2372

 

Группы были сопоставимы по возрасту: в первой группе возраст составил 39 [34, 0; 45, 0] лет, во второй — 42,5 [37, 0;52, 0] года (p=0,255).

Молекулярно-генетический анализ геномной ДНК больных производили при взятии контрольных анализов крови при выписке из стационара из клеток периферической крови с помощью набора реагентов «РеалБест Экстракция 100». Для определения полиморфизмов генов использовали набор реагентов «РеалБест-Генетика Гемостаз (12)». Всего проанализирован однонуклеотидный полиморфизм (SNP) 12 генов, имеющих значение для функционирования свёртывающей системы крови, фибринолиза, сосудистой стенки и тромбоцитов (табл. 3).

 

Таблица 3. Результаты исследования однонуклеотидных полиморфизмов генов системы гемостаза и фолатного ­цикла у больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом

Полиморфизм генов тромбофилии		Группа больных средней степени тяжести (n=13)	Группа больных тяжёлой степени тяжести (n=30)	Уровень значимости различий между группами
F5:1691 G/A	G/A, %	7,69	10	0,8109
	A/A, %	0	0	—
	A, %	3,85	5	0,8155
F2:20210 G/A	G/A, %	0	3,33	0,5054
	A/A, %	0	0	—
	A, %	0	1,67	0,5079
F7:10976 G/A	G/A, %	30,77	30	0,9598
	A/A, %	7,69	0	0,1243
	A, %	23,08	15	0,3647
F13:c.103 G/A	G/T, %	38,46	26,67	0,4393
	T/T, %	7,69	6,67	0,9035
	T, %	26,92	20	0,4773
FGB:–455 G/A	G/A, %	46,15	30	0,3074
	A/A, %	15,38	3,33	0,1543
	A, %	38,46	18,33	0,046
PAI-1:–675 5G/4G	5G/4G, %	46,15	46,67	0,9753
	4G/4G, %	53,85	53,33	0,9753
	4G, %	76,92	76,67	0,9794
MTHFR:1298 A/C	A/C, %	30,77	36,67	0,7094
	C/C, %	23,08	3,33	0,0407
	C, %	38,46	21,67	0,1061
MTHFR:677 C/T	C/T, %	46,15	46,67	0,9753
	T/T, %	7,69	3,33	0,533
	T, %	30,77	26,67	0,6969
MTR:2756 A/G	A/G, %	38,46	30	0,5866
	G/G, %	7,69	6,67	0,9035
	G, %	26,92	21,67	0,5962
MTRR:66 A/G	A/G, %	53,85	43,33	0,5256
	G/G, %	15,38	36,67	0,1629
	G, %	42,31	58,33	0,1712
ITGB3:1565 T/C	T/C, %	30,77	20	0,4427
	C/C, %	15,38	0	0,0278
	C, %	30,77	10	0,0166
ITGA2:807 C/T	C/T, %	38,46	36,67	0,911
	T/T, %	7,69	26,67	0,1601
	T, %	26,92	45	0,1153

Примечание. Плазменное звено гемостаза, свёртывающая система: F5 — фактор Лейдена; F2 — протромбин; F7 — проконвертин; F13 — 13-й фактор свёртывания; FGB — фибриноген. Фибринолиз: PAI-1 — ингибитор активатора плазминогена 1-го типа. Сосудистое звено гемостаза, фолатный цикл: MTHFR — метилентетрагидрофолатредуктаза; MTR — метионинсинтаза; MTRR — метионинсинтаза-редуктаза. Тромбоцитарное звено: ITGB3 — тромбоцитарный рецептор фибриногена, кодирующий белок интегрин β₃; ITGA2 — тромбоцитарный рецептор к коллагену, кодирующий белок интегрин α₂.

 

Генотипирование производили методом мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с конформационно-блокированными зондами. Использовали регистрирующий амплификатор CFX96 (фирма Bio-Rad, США). Информация о частотах аллелей SNP для европеоидов была получена из результатов исследований, выполненных в рамках международных проектов.

Клинико-лабораторные данные сохраняли в базе данных Microsoft Office Excel, для статистического анализа использовали лицензированную программу SPSS 22.0. Уровень значимости различий между группами определяли с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни (для количественных переменных) и точного критерия Фишера (для качественных переменных) [21].

Результаты. Клинико-лабораторная характеристика пациентов, включённых в исследование, и частота развития осложнений ГЛПС в сравниваемых группах представлены в табл. 1 и 2. Как следует из представленных данных, при тяжёлом течении заболевания были значительно более выраженные проявления почечного повреждения (протеинурия, патологический мочевой осадок) и нарушения азотовыделительной функции почек (степень повышения уровня креатинина и мочевины). Более чем у половины пациентов с тяжёлой ГЛПС развивалось ОПП класса F по RIFLE, а у каждого третьего — клиническая картина ИТШ.

Частоты однонуклеотидных полиморфизмов генов системы гемостаза и фолатного ­цикла у больных ГЛПС представлены в табл. 3. Сравнение частот распределения гомозиготных мутаций в группах свидетельствует об их вероятной связи с тяжестью течения ГЛПС.

Так, у больных второй группы реже встречались генотип C/C гена ITGB3:1565T/C (p=0,0278) и генотип C/C гена MTHFR1298 A/C (p=0,0407). Также при тяжёлом течении ГЛПС (у больных второй группы) отмечено более частое выявление аллеля G гена FGB:–455G/A (p=0,046) и аллеля T гена ITGB3:1565T/C (p=0,0166).

Кроме того, установлено более частое выявление генотипа 5G/4G гена PAI-1:675 5G/4G в случае возникновения ИТШ у больных второй группы (p=0,0433).

В ходе исследования установлено, что в случае развития ОПП класса F (критерии RIFLE) почти в 2 раза реже встречались генотип C/C гена ITGB3:1565T/C (p=0,0145) и сочетание генотипов A/C и C/C гена MTHFR1298A/C (p=0,0004). Также при ОПП регистрировали более частое выявление патологических генотипов A/G и G/G гена MTRR66A/G (p=0,0011). Установлено, что в группе больных ГЛПС, осложнённой ОПП, реже встречается аллель C гена ITGB3:1565T/C (p=0,0204), реже выявляется аллель C гена MTHFR1298 A/C (p=0,0012), чаще выявлялся аллель G гена MTRR66A/G (p=0,0065).

Установлено влияние некоторых генов на отдельные клинико-лабораторные показатели ГЛПС.

Так, мутации C/T и T/T в гене ITGA2:807 C/T становятся причиной более длительной лихорадки [при нормальном полиморфизме C/C — 6,0 [4, 0; 7, 0] дней, при гетерозиготной мутации C/T — 8,0 [6, 5; 10] дней (p=0,009), при гомозиготной мутации T/T — 8,0 [6, 0; 8, 0] дней (p=0,045)]. Генотип C/C в гене MTHFR:677 C/T обусловливает низкое количество тромбоцитов при поступлении [при нормальном полиморфизме C/C — 62,0 [39, 0; 79, 0] ×10⁹/л, при гетерозиготной мутации C/T — 56,0 [40, 5; 88, 5] ×109/л (p=0,548), при гомозиготной мутации T/T — 111,5 [92, 0; 131, 0] ×10⁹/л (p=0,049)].

Отдельно укажем, что в ходе исследования не было установлено различий в частоте мутаций изучаемых генов у пациентов в зависимости от развития отёка лёгких — характерного осложнения ГЛПС.

Обсуждение. Известно, что в основе патогенеза ГЛПС лежит вирус-индуцированное иммуноопосредованное поражение эндотелиальных клеток. В итоге повреждение эндотелия сопровождается повышением проницаемости капилляров, транссудацией плазмы, отёком интерстициальной ткани, развитием гемоконцентрации и тромбообразованием. Именно повреждение эндотелия и его дезинтеграция ведут к динамическим нарушениям микроциркуляции в отдельных органах, развитию ОПП, возникновению респираторного дистресс-синдрома, ИТШ, появлению характерной для ГЛПС тромбоцитопении и ДВС-синдрома.

Ожидаемо, что в патогенезе ГЛПС белки системы гемостаза будут иметь ключевое значение, а дисбаланс системы усугубит сосудистые и геморрагические проявления заболевания.

В работе изучено влияние однонуклеотидных SNP-мутаций некоторых генов системы свёртывания крови и фолатного цикла на течение и частоту осложнений при ГЛПС.

В ходе работы впервые показана ассоциация аллеля G гена FGB:–455 G/A, аллеля T гена ITGB3:1565T/C с тяжёлым течением заболевания; генотипа 5G/4G гена PAI-1:675 5G/4G — с развитием ИТШ; аллеля T гена ITGB3:1565T/C, аллеля A и генотипа A/A гена MTHFR1298 A/C, патологических генотипов A/G и G/G и аллеля G гена MTRR:66A/G — с развитием ОПП.

При этом известно, что полиморфизм –455 G/A гена FGB (ген фибриногена) приводит к увеличению продукции фибриногена и обу­словливает развитие тромбофилии, является предрасполагающим фактором к развитию ишемической болезни сердца, острого коронарного синдрома, болезни периферических артерий и инсульта [24, 25].

Известно, что ген ITGB3 (гликопротеина — тромбоцитарного рецептора к фибриногену) кодирует синтез β₃-цепи интегринового комплекса GP2b/3a, участвующего в межклеточных взаимодействиях. Аллель C обусловливает повышенную адгезию тромбоцитов и повышает риск развития острого коронарного синдрома [26], также установлено его влияние на невынашивание беременности [27], понижение эффективности ацетилсалициловой кислоты (аспирина) [28].

Есть указания, что патологический полиморфизм гена PAI-1 (плазменного активатора плазминогена) обусловливает более высокую концентрацию ингибитора активатора плазминогена и уменьшает активность противосвёртывающей системы. Генотип 4G/4G ассоциирован с повышением риска тромбообразования [29]; PAI-1 выявляют в высоких концентрациях в тканях умерших больных при сепсисе [30].

Существует мнение, что мутация гена MTHFR влияет на развитие тромбозов, в частности в почечных венах, есть указания, что патологический полиморфизм обусловливает гипергомоцистеинемию при почечной патологии [31], а изменение гена MTRR влияет на поражение венечных (коронарных) артерий [32].

В ходе работы не получено подтверждения результатов схожих исследований о влиянии мутаций в гене ITGA2 (ген тромбоцитарного рецептора к коллагену) на тяжесть течения ГЛПС [11].

При этом обращает на себя внимание крайне высокая частота гетерозиготной мутации 675 5G/4G в гене PAI-1 в обеих группах больных. Этот феномен нельзя объяснить в рамках выполненного исследования, но теоретически, данная мутация может быть ассоциирована с большей предрасположенностью к возникновению ГЛПС.

Выводы

1. Предикторы тяжёлого течения геморрагической лихорадки с почечным синдромом — наличие аллеля G гена FGB:–455G/A и аллеля T гена ITGB3:1565T/C, а также отсутствие генотипа C/C гена ITGB3:1565T/C и генотипа C/C гена MTHFR1298A/C.

2. Генотип 5G/4G гена PAI:675 5G/4G предрасполагает к развитию инфекционно-токсического шока.

3. Тяжёлое острое повреждение почек чаще развивается у больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом с генотипами A/G и G/G, а также аллелем G гена MTRR66A/G, и значительно реже у пациентов, имеющих генотип C/C гена ITGB3:1565 T/C и генотипы A/C и C/C гена MTHFR1298A/C.

 

Участие авторов. К.М.М. — поиск и анализ литературных источников, сбор и статистическая обработка материала, анализ результатов, редактирование окончательного варианта рукописи; Д.С.С. — поиск и анализ литературных источников, анализ и интерпретация полученных результатов, редактирование окончательного варианта рукописи; М.В.Д. и В.В.М. — руководители исследования, редактирование окончательного варианта рукописи; Т.О.Т. и Н.С.П. — проведение исследования.

Источники финансирования. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

Об авторах

Константин Михайлович Манахов

Ижевская государственная медицинская академия

Автор, ответственный за переписку.
Email: kmanakhov@yandex.ru
Россия, г. Ижевск, Россия

Денис Сосович Сарксян

Ижевская государственная медицинская академия

Email: kmanakhov@yandex.ru
Россия, г. Ижевск, Россия

Михаил Валерьевич Дударев

Ижевская государственная медицинская академия

Email: kmanakhov@yandex.ru
Россия, г. Ижевск, Россия

Татьяна Олеговна Толстолуцкая

Ижевская государственная медицинская академия; Первая республиканская клиническая больница

Email: kmanakhov@yandex.ru
Россия, г. Ижевск, Россия; г. Ижевск, Россия

Наталья Сергеевна Пономаренко

Первая республиканская клиническая больница

Email: kmanakhov@yandex.ru
Россия, г. Ижевск, Россия

Виктор Васильевич Малеев

Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора

Email: kmanakhov@yandex.ru
Россия, г. Москва, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы