Особенности иммунофенотипической диагностики В-клеточных лимфопролиферативных заболеваний методом проточной цитометрии

Полный текст

Преимущества метода многоцветной проточной цитометрии определяют широкие возможности его использования, прежде всего в диагностике и классификации лимфопролиферативных заболеваний (ЛПЗ) [1], мониторинге остаточного опухолевого клона, оценке факторов прогноза и резистентности к терапии. Традиционное морфологическое исследование при ЛПЗ не позволяет определить принадлежность опухолевых лимфоидных клеток к какой-либо линии (Т-, В- или NK) или стадии дифференцировки. Метод проточной цитометрии позволяет быстро выявить клональность опухолевых В-лимфоцитов, коэкспрессию основных для конкретной опухоли поверхностных и/или цитоплазматических маркёров. Однако не всегда иммунофенотипическая характеристика опухолевых лимфоцитов отдельных пациентов соответствует классической картине того или иного варианта В-ЛПЗ, что затрудняет интерпретацию полученных данных и может привести к неверному диагнозу.

В некоторых публикациях [2–5] появились данные об использовании относительно новых моноклональных антител в диагностической панели для иммунофенотипирования В-ЛПЗ. Мы проанализировали информативность традиционных и дополнительных иммунофенотипических маркёров (CD200, CD305) при различных вариантах В-клеточных ЛПЗ.

CD200 (OX2) — трансмембранный гликопротеид, относящийся к суперсемейству иммуноглобулинов, экспрессируется на тимоцитах, покоящихся и активированных Т- лимфоцитах, В-лимфоцитах, дендритных, эндотелиальных клетках, нейронах, но отсутствует на NK-клетках, моноцитах, гранулоцитах, тромбоцитах. Опухолевые В-клетки характеризуются яркой гомогенной экспрессией CD200 при В-клеточном хроническом лимфолейкозе (ХЛЛ), волосатоклеточном лейкозе (ВКЛ), значительно слабее её выраженность при лимфоме клеток мантийной зоны (ЛКМЗ) [4, 5]. Экспрессию CD200 считают неблагоприятным прогностическим признаком при множественной миеломе [6–8].

CD305, или LAIR-1 (от англ. Leukocyte-Associated Ig-Like Receptor-1), — трансмембранный гликопротеид, относится к суперсемейству иммуноглобулинов, экспрессируется на значительной части Т-, В-, NK-лимфоцитов, моноцитах, дендритных клетках, тимоцитах. Экспрессию LAIR-1 отмечают на ранних стадиях дифференцировки В-лимфоцитов, но она отсутствует на плазмобластах и плазмоцитах. Кроме того, LAIR-1 может функционировать как ингибирующий рецептор на Т- и NK-лимфоцитах [9, 10].

В рекомендациях Европейского консорциума по проточной цитометрии (EuroFlow) маркёр LAIR-1 включён в дифференциально-диагностическую панель В-ЛПЗ для диагностики ВКЛ (Leukemia, 2012).

Цель исследования — оценить информативность традиционных и дополнительных иммунофенотипических маркёров (CD200, CD305) при дифференциальной диагностике В-ЛПЗ методом проточной цитометрии.

Иммунофенотипическое исследование проведено 204 пациентам с подозрением на В-ЛПЗ в научно-исследовательской лаборатории ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского». Также обследована группа из 20 пациентов с реактивным лимфоцитозом, у которых наличие В-ЛПЗ было исключено. Материалом для исследования служили периферическая кровь и костный мозг.

Исследования были одобрены на заседании независимого комитета по этике ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского» (протокол №10 от 15.10.2015) и проведены с получением добровольного и информированного согласия пациентов.

Возраст пациентов варьировал от 30 до 80 лет, средний возраст составил 56±15 лет.

Иммунофенотипическое исследование проводили методом лазерной проточной цитометрии, применяя четырёхцветный проточный цитофлюориметр FACSCalibur (Becton Dickin­son, США) с использованием программного обеспечения CellQwest, моноклональных антител, конъюгированных с флюоресцентными красителями (производство BD Biosciences, США). Использовали следующую панель моноклональных антител: Анти-CD45-FITC, Per-CP или Per-CP-Сy5,5, APC; анти-CD3-FITC, анти-CD19-APC, Per-CP или Per-CP-Сy5,5; анти-CD20-FITC, Per-CP или Per-CP-Сy5,5; анти-CD5, анти-FMC7, анти-CD38, анти-CD103, анти-CD43, анти-sIg kappa, меченные FITC; анти-CD(16+CD56), анти-CD10, анти-CD23, анти-CD56, анти-CD22, анти-CD79b, анти-CD25, анти-CD11c, анти-sIg lambda, меченные PE. Дополнительно в панель были включены моноклональные антитела анти-CD200 — PE (Clone MRC OX-104 BD Pharmingen), анти-CD305-PE (Clone DX26 BD Pharmingen).

Иммунофенотипическое исследование проводили с применением стандартной методики пробоподготовки. Критерием позитивности считали наличие экспрессии антигена на поверхности или в цитоплазме более чем 20% опухолевых клеток. Оценку интенсивности экспрессии антигенов проводили по параметру средней интенсивности флюоресценции (MFI — от англ. Mean Fluorescence Intensity), выраженной в условных единицах (у.е.).

Статистическая обработка полученных результатов проведена с использованием статистической программы Statistica 8.0 c расчётом средней величины и квадратичной ошибки средней (М±m). Для определения статистической значимости различий в средних значениях количественных показателей использовали t-критерий Стьюдента. Частоту антигенов в исследуемых когортах пациентов сравнивали по критерию Фишера.

Из 204 обследованных пациентов ХЛЛ был диагностирован у 104, у 18 человек — ВКЛ, у 41 пациента — ЛКМЗ, у 34 больных — лимфома маргинальной зоны селезёнки (ЛМЗС), у 7 пациентов — лейкемизация фолликулярной лимфомы. Диагноз ЛКМЗ был подтверждён цитогенетическими исследованиями t(11;14) и/или выявлением экспрессии циклина D1 иммуногистохимическими методами.

Данные по оценке традиционных иммунофенотипических маркёров при В-ЛПЗ представлены в табл. 1.

 

Общий иммунофенотипический признак всех В-ЛПЗ — обнаружение рестрикции мембранных лёгких цепей иммуноглобулинов (kappa- либо lambda-тип), что служит подтверждением клональности В-лимфоцитов при опухолевой трансформации. Оценка интенсивности экспрессии CD20 по параметру MFI позволяет дифференцировать клетки В-ХЛЛ с низкой/слабой (dim) степенью экспрессии от остальных опухолевых клеток В-ЛПЗ, для которых характерна промежуточная (mod), либо высокая/яркая (bright) интенсивность экспрессии данной молекулы, что служит одним из основных традиционных дифференциально-­диагностических критериев, позволяющих отличить ХЛЛ от зрелоклеточных лимфом и ВКЛ. Общепринятым традиционным иммунофенотипическим признаком лейкемизации неходжкинских лимфом и ВКЛ считают позитивность FMC7, который обычно не экспрессирован при ХЛЛ, что также служит дифференциально-диагностическим критерием.

Иммунофенотип лимфоцитов при ХЛЛ характеризовался классическими признаками: позитивной экспрессией антигенов CD5, CD23, CD43, отсутствием экспрессии CD10, FMC7. Все пациенты с ХЛЛ демонстрировали слабую (dim) экспрессию молекулы CD20, часть пациентов (4,5%) имели нетипичную яркую (bright) экспрессию CD22, у 33,8% пациентов обнаружено отсутствие мембранной экспрессии CD79b. У 14,4% больных не было выявлено рестрикции по мембранным лёгким цепям иммуноглобулинов. Отсутствие молекулы CD79b на поверхности клеток В-ХЛЛ может служить признаком делеции (13)(q14.3) или нарушения формирования В-клеточного рецепторного комплекса [11]. 26% пациентов демонстрировали позитивную экспрессию CD38 на клетках В-ХЛЛ, что расценивают как иммунофенотипический показатель неблагоприятного прогноза и резистентности к терапии [12]. У 73% пациентов с ХЛЛ обнаружена позитивная экспрессия рецептора к интерлейкину-2 (CD25) на опухолевых В-лимфоцитах в диапазоне от 20 до 89% позитивных клеток. По данным литературы, у таких больных отмечают более агрессивное течение заболевания, есть связь с хромосомными аномалиями, стимуляцией Toll-like-рецепторов [13, 14]. По нашим данным, выраженная экспрессия CD25 на клетках В-ХЛЛ уже на этапе первичной иммунофенотипической диагностики служит маркёром высокой вероятности рефрактерности к проводимой терапии и низкого качества ремиссии заболевания, а также может быть показателем прогрессирования или развития рецидива заболевания [15].

Иммунофенотипический профиль опухолевых В-лимфоцитов при лейкемизации ЛКМЗ характеризовался позитивной экспрессией CD5, отсутствием экспрессии CD23, CD43, CD10. У 20 и 15% пациентов с ЛКМЗ выявлена слабая (dim) экспрессия CD20 и CD22 соответственно, у 11,4% пациентов отсутствовала экспрессия CD79b. Позитивная экспрессия FMC7 выявлена только у 57,1% пациентов.

Особой проблемой при иммунофенотипировании становится дифференциальная диагностика между CD5-позитивными ХЛЛ и ЛКМЗ при вариабельности антигенов CD23, реже CD43, а также при вариабельности интенсивности экспрессии CD20. Использование маркёра СD200 может помочь в разрешении этой проблемы. Оценка экспрессии СD200 у исследованных пациентов представлена в табл. 2 и 3.

 

 

Во всех случаях ХЛЛ и в большинстве случаев реактивного лимфоцитоза выявлена позитивная экспрессия СD200 на В-лимфоцитах. Позитивная экспрессия СD200 обнаружена у пациентов с ЛКМЗ в значительно (p=0,000) меньшем количестве наблюдений, чем при ХЛЛ, что согласуется с данными литературы, хотя доля позитивных по СD200 пациентов с ЛКМЗ несколько выше, чем у других исследователей [2, 3, 5]. Другие варианты В-ЛПЗ характеризовались большей выявляемостью СD200 по сравнению с ЛКМЗ. Однако у 11,5% пациентов с ЛКМЗ были обнаружены СD200-позитивные опухолевые В-клетки, в связи с чем мы оценили интенсивность экспрессии СD200 на В-лимфоцитах по параметру MFI (см. табл. 3).

Наиболее высокий показатель MFI СD200 обнаружен у больных ХЛЛ и ВКЛ, статистически значимо превышая значения MFI СD200 у пациентов с ЛКМЗ, фолликулярной лимфомой и ЛМЗС, реактивным лимфоцитозом. Определение MFI СD200 служит существенным критерием при дифференциальной диагностике CD5-позитивных ХЛЛ и ЛКМЗ с наличием высокого содержания СD200+ В-клеток. На рис. 1 представлены цитограммы больных ХЛЛ, ЛКМЗ и реактивным лимфоцитозом, отражающие различные варианты и интенсивность экспрессии антигена СD200 (пояснения под рисунком).

 

Рис. 1. Экспрессия CD200 на В-клетках при хроническом лимфолейкозе, реактивном лимфоцитозе и лимфоме клеток мантийной зоны (ЛКМЗ): А — хронический лимфолейкоз, экспрессия CD200 на 94% клеток В-хронического лимфолейкоза, интенсивность флюоресценции (MFI) 350 y.e.; Б — реактивный лимфоцитоз, экспрессия CD200 на 0,12% В-клеток, MFI=112,1 y.e.; В — ЛКМЗ, экспрессия CD200 на 1,22% В-лимфоцитов (негативная), MFI=57,9 y.e.; Г — ЛКМЗ, экспрессия CD200 на 82,9% В-лимфоцитов (позитивная), MFI=115,4 y.e.

 

Особую группу лимфом из клеток мантии составляет так называемый бластоидный подвариант заболевания, при котором опухолевые клетки имеют бластную морфологию. Иммунофенотипически у таких пациентов (4 наблюдения) отмечена позитивная экспрессия CD10, слабая экспрессия CD45 и CD19, выраженная позитивная экспрессия активационных антигенов CD38 и CD25, в некоторых случаях отсутствовала экспрессия CD79b, но присутствовала экспрессия CD79a. Экспрессии CD200 не было во всех случаях. На рис. 2 представлены варианты позитивной экспрессии антигена CD10, выявленного при фолликулярной лимфоме (А) и бластоидном варианте ЛКМЗ (Б).

 

Рис. 2. Экспрессия CD10 на В-лимфоидных элементах при фолликулярной лимфоме и бластоидном варианте лимфомы клеток мантийной зоны: А — фолликулярная лимфома, экспрессия CD10 на 68,12% В-клеток, интенсивность флюоресценции 105,4 y.e.; Б — лимфома клеток мантийной зоны, бластоидный вариант, экспрессия CD10 на 55,5% В-клеток, интенсивность флюоресценции 88,1 y.e.

 

Для фенотипа опухолевых клеток фолликулярной лимфомы была характерна яркая (bright) экспрессия всех пан В-клеточных маркёров в 100% наблюдений, позитивность CD10, вариабельность маркёров CD23, CD43 и CD38. В 43% случаев рестрикция лёгких цепей иммуноглобулинов выявлена только при внутрицитоплазматическом окрашивании. Позитивная экспрессия FMC7 обнаружена только у половины обследованных пациентов (57,1%), а позитивная экспрессия CD23 — в 28,6% наблюдений. В последней классификации Всемирной организации здравоохранения (2016) выделен новый вариант преимущественно диффузной CD23-позитивной фолликулярной лимфомы с фенотипом CD10⁺bcl-2⁺bcl-6⁺, характеризующийся более агрессивным течением и del 1p36 [16].

Иммунофенотип В-лимфоцитов при ЛМЗС характеризовался преимущественно яркой (bright) экспрессией всех пан В-клеточных маркёров, отсутствием экспрессии CD5, CD10, CD43, CD103 и CD38, вариабельностью CD23, CD25 и FMC7. В частности, не характерная для данной группы пациентов позитивная экспрессия антигена CD23 обнаружена практически у трети (27,3%) больных, а позитивная экспрессия классического традиционного маркёра FMC7 выявлена только у половины (54,5%) пациентов.

Опухолевые клетки при классической форме ВКЛ демонстрировали яркую (bright) экспрессию всех пан В-клеточных маркёров, отсутствие CD5, наличие позитивной экспрессии антигенов FMC7, CD11с, CD103 и CD25. Из 18 пациентов с иммунофенотипически верифицированным диагнозом ВКЛ у 27,7% нами установлена вариантная форма с позитивной экспрессией либо CD5, либо CD10, с отсутствием экспрессии либо CD103, либо CD25, либо CD11с, либо CD305. В некоторых случаях отсутствовала экспрессия CD79b, но выявлялась экспрессия CD79a. Только в 48% случаев иммунофенотипически верифицированного диагноза ВКЛ морфологически были выявлены типичные «волосатые клетки» или дана описательная характеристика лимфоидных элементов с цитоплазматическими выростами.

Определённые трудности возникают при диагностике ЛМЗС и ВКЛ, что связано с наличием отростчатых или виллёзных клеток и «волосатых» клеток соответственно при данных заболеваниях. Помимо традиционных антигенов CD25, CD11с, CD103, нами была исследована экспрессия CD305 (LAIR-1) при ЛМЗС и ВКЛ, что представлено в табл. 4.

 

 

Не было обнаружено достоверных различий по содержанию СD305-позитивных клеток между данными группами пациентов, но средняя интенсивность флюоресценции СD305 при ВКЛ была достоверно выше, чем при лейкемизации ЛМЗС (рис. 3). Этот факт может быть использован при иммунофенотипической дифференциальной диагностике этих вариантов В-ЛПЗ со сходной морфологической характеристикой лимфоидных элементов.

 

Рис. 3. Экспрессия CD305 (LAIR-1) на В-лимфоцитах при волосатоклеточном лейкозе (ВКЛ) и лимфоме маргинальной зоны селезёнки (ЛМЗС): А — ВКЛ, гетерогенная экспрессия CD305 на 94,5% В-клеток, MFI=1404 y.e.; Б — ЛМЗС, экспрессия CD305 на 59,3% В-клеток, интенсивность флюоресценции 320,5 y.e.

 

Выводы

1. Обнаружены некоторые особенности иммунофенотипической характеристики опухолевых клеток у пациентов с В-клеточными лимфопролиферативными заболеваниями.

2. От 7,5 до 20% пациентов с лейкемизацией лимфомы клеток мантийной зоны и лимфомы маргинальной зоны селезёнки могут демонстрировать нетипичную слабую (dim) интенсивность экспрессии CD20, CD22 и CD79b, что затрудняет дифференциальную диагностику с хроническим лимфолейкозом.

3. Позитивная экспрессия традиционного маркёра FMC7, характерная для лейкемизации зрелоклеточных лимфом и волосатоклеточного лейкоза, выявлена только у половины пациентов с лимфомой клеток мантийной зоны, фолликулярной лимфомой и лимфомой маргинальной зоны селезёнки.

4. Обнаружено относительно много наблюдений с нетипичной позитивной экспрессией CD23 у пациентов с фолликулярной лимфомой и лимфомой маргинальной зоны селезёнки (28,6 и 27,3% соответственно).

5. Позитивная экспрессия СD200 на опухолевых клетках выявлена у пациентов с лимфомой клеток мантийной зоны в значительно (p <0,0001) меньшем количестве наблюдений, чем при хроническом лимфолейкозе и других вариантах В-клеточных лимфопролиферативных заболеваний.

6. Cтатистически значимое (p <0,001) снижение средней интенсивности флюоресценции СD200 при лимфоме клеток мантийной зоны по сравнению с хроническим лимфолейкозом даёт возможность использования данного критерия в дифференциальной диагностике этих вариантов В-клеточных лимфопролиферативных заболеваний у больных с высоким содержанием СD200-позитивных опухолевых В-клеток.

7. Показатель средней интенсивности флюоресценции СD305 при волосатоклеточном лейкозе достоверно выше, чем при лейкемизации лимфомы маргинальной зоны селезёнки, что может быть использовано при дифференциальной диагностике этих вариантов В-клеточных лимфопролиферативных заболеваний со сходной морфологической характеристикой лимфоидных элементов.

 

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

Об авторах

Юлия Юрьевна Чуксина

Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского

Автор, ответственный за переписку.
Email: tchuxina2009@yandex.ru
Россия, г. Москва, Россия

Елена Васильевна Катаева

Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского

Email: tchuxina2009@yandex.ru
Россия, г. Москва, Россия

Татьяна Алексеевна Митина

Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского

Email: tchuxina2009@yandex.ru
Россия, г. Москва, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы