Влияние трипептида Leu-Ile-Lys на активность свободнорадикального окисления и уровень экспрессии циклооксигеназы-1 и -2 в слизистой оболочке желудка при экспериментальной индометациновой язве крыс

Полный текст

В процессе разработки нового противоязвенного средства пептидной природы нами было установлено, что пептидный комплекс из тканей свиных почек в условиях экспериментальной индометациновой язвы оказывает выраженное гастропротективное действие, которое сопровождается существенным ослаблением активности процесса свободнорадикального окисления в слизистой оболочке желудка и снижением уровня экспрессии циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2) [1, 2].

В дальнейшем на основе данных об аминокислотном составе пептидного комплекса из тканей свиных почек посредством драг-дизайна нами были смоделированы 7 химических структур индивидуальных пептидов с потенциальной гастропротективной активностью, экспериментальная апробация которой позволила установить, что трипептид Leu-Ile-Lys (лейцин-изолейцин-лизин) обладает выраженным терапевтическим действием при индометациновой гастропатии, сопоставимым по силе с лекарственным препаратом омепразолом [3].

Учитывая большое значение оксидативного повреждения слизистой оболочки желудка и роль ферментов ЦОГ-1 и ЦОГ-2 в развитии гастропатии [4, 5], а также полученные ранее результаты, нас заинтересовало изучение влияния трипептида Leu-Ile-Lys на активность свободнорадикального окисления и уровень экспрессии ЦОГ-1 и ЦОГ-2 в желудке крыс при экспериментальной гастропатии.

Цель исследования: определить характер влияния трипептида Leu-Ile-Lys на показатели оксидативного стресса и уровень экспрессии ферментов ЦОГ-1 и ЦОГ-2 в слизистой оболочке желудка на фоне экспериментальной индометациновой язвы.

Эксперименты проведены на 35 самцах крыс линии Wistar с массой тела 200–250 г в возрасте 2–3 мес. Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище. Исследования на крысах проводили согласно «Правилам надлежащей лабораторной практики» (GLP), утверждённым приказом Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 23.08.2010 №708, и требованиям Федерального закона «О защите животных от жестокого обращения» от 01.09.1997.

Экспериментальные животные были разделены на три группы:
– группа сравнения (интактные крысы, 8 особей);
– контрольная группа (моделирование индометациновой гастропатии, 12 особей);
– подопытная группа (моделирование индометациновой гастропатии + введение трипептида Leu-Ile-Lys, 15 особей).

Трипептид Leu-Ile-Lys получали методом химического синтеза на предприятии SHANGHAI APEPTIDE CO., LTD (г. Шанхай, Китайская народная республика) при посредничестве ЗАО «Эвалар» (г. Бийск, Россия). Чистота образца составляла не менее 98%.

Трипептид Leu-Ile-Lys вводили животным подопытной группы внутрижелудочно через зонд ежесуточно в течение 7 дней до моделирования индометацинового повреждения ­слизистой оболочки желудка (СОЖ) в дозе 11,5 мг/кг. Последнее введение осуществляли за 1 ч до начала действия язвообразующего фактора. Животные группы сравнения получали эквиобъёмное количество изотонического раствора натрия хлорида в соответствующих режимах введения. Модель индометацинового повреждения СОЖ крыс воспроизводили путём однократного внутрижелудочного введения индометацина в дозе 60 мг/кг в 1 мл изотонического раствора натрия хлорида [6, 7].

Через 4 ч после введения индометацина животных подвергали эвтаназии под эфирным наркозом, желудки извлекали, вскрывали по малой кривизне, промывали изотоническим раствором натрия хлорида, измельчали, гомогенизировали 3-кратным циклом замораживания-размораживания.

В гомогенате желудка крыс определяли показатели активности свободнорадикального окисления по общепринятым методикам [8]. Для оценки прооксидантного статуса определяли концентрацию тиобарбитурат-реактивных продуктов окисления жирных кислот (ТБРП), основной представитель которых — малоновый диальдегид, колориметрическим методом, оценивая интенсивность окраски раствора в ходе химической реакции ТБРП с тиобарбитуровой кислотой. Суммарный показатель концентрации всех прооксидантов и свободнорадикальных метаболитов — общую прооксидантную активность — определяли по интенсивности окраски флюоресцентного комплекса, образующегося при взаимодействии продуктов перекисного окисления ТВИН-80 с тиобарбитуровой кислотой.

Для оценки антиоксидантного статуса клеток определяли общую антиоксидантную активность (ОАА) и активность антиоксидантных ферментов: глутатионпероксидазы, каталазы и супероксиддисмутазы.

ОАА оценивали как интегративный показатель активности всех ферментных и неферментных факторов нейтрализации свободных радикалов по степени угнетения Fe2+/аскорбат-зависимого окисления ТВИН-80 гомогенатом ткани.

Активность каталазы определяли по подавлению ферментом окисления молибдата натрия перекисью водорода.

Активность супероксиддисмутазы оценивали по содержанию в пробе нитроформазана, окрашенного продукта восстановления нитротетразолия супероксидными радикалами.

Маркёром активности глутатионпероксидазы служило определение неокисленного глутатиона по цветной реакции с реактивом Эллмана.

Для количественного определения ­ЦОГ-1 и ЦОГ-2 в гомогенате желудка методом иммуноферментного анализа использовали набор для определения простагландин-эндопероксид-синтетазы 1,2 (PTGS 1,2) фирмы Cloud-Clone Corp. Микропланшет, входящий в данный набор, был предварительно покрыт антителами, характерными для PTGS 1,2. Затем стандарты и образцы добавляли в соответствующие лунки микропланшета с биотинилированными антителами, характерными для PTGS 1,2. Далее в каждую лунку микропланшета добавляли авидин, конъюгированный с пероксидазой хрена, и помещали в инкубатор. После этого добавлялся раствор субстрата тетраметилбензидина. Только в тех лунках, которые содержат PTGS 1,2, биотинилированные антитела и конъюгированный авидин, происходило изменение цвета.

Фермент-субстратная реакция прекращалась при добавлении раствора серной кислоты, и изменение цвета оценивали спектрометрически при длине волны 450±10 нм. Концентрацию PTGS 1,2 в образцах определяли при помощи сравнения оптической плотности образцов со стандартной кривой.

Статистическая обработка проведена с помощью программы Statistica for Windows 12.0. Результаты при наличии нормальности распределения представлены в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего (M±m), при отсутствии нормальности распределения представлены в виде медианы и интерквартильного размаха Me (25%; 75%). Нормальность распределения определяли по критерию Колмогорова–Смирнова в модификации Лиллиефорса. Для выявления статистической значимости межгрупповых различий при наличии нормальности распределения использовали параметрический t-критерий Стьюдента, при отсутствии нормальности распределения применяли непараметрический критерий Манна–Уитни. Разницу считали достоверной при значении p <0,05 [9].

Результаты определения показателей прооксидантного и антиоксидантного статусов в СОЖ крыс представлены в табл. 1 (показатели нормальности распределения полученных данных: K-S d <0,2; Lilleofors <0,2).

 

 

Оказалось, что концентрация ТБРП в контрольной группе при моделировании гастропатии увеличилась на 96% по сравнению с уровнем у интактных крыс. При этом в подопытной группе, где животным вводили ­трипептид ­Leu-Ile-Lys, величина описываемого показателя была на 30% меньше, чем в контрольной группе, и практически не отличалась от уровня группы сравнения.

На этом фоне ОАА у крыс контрольной группы уменьшалась на 63% относительно уровня интактных животных. В подопытной группе при применении трипептида Leu-Ile-Lys ОАА была на 51% больше, чем в контроле.

Активность глутатионпероксидазы в контрольной группе относительно группы сравнения возросла на 37%. В то же время величина данного показателя в подопытной группе существенно снижалась как относительно контроля, так и в сравнении с интактными животными: на 60 и 45% соответственно.

Активность каталазы в контрольной группе также увеличилась относительно группы сравнения — на 16%. В подопытной группе произошло уменьшение активности каталазы относительно контрольной группы на 67%, а в сравнении с интактными животными — на 61%.

Активность супероксиддисмутазы в СОЖ крыс контрольной группы приобретала тенденцию к росту относительно интактных крыс, однако это изменение не носило статистически значимого характера. В условиях коррекции экспериментальной гастропатии изучаемым трипептидом Leu-Ile-Lys зарегистрировано существенное снижение активности супероксиддисмутазы: на 79% относительно контроля заболевания и на 72% относительно группы сравнения.

Результаты определения показателей уровня экспрессии ЦОГ-1 и ЦОГ-2 в СОЖ крыс представлены на рис. 1 (показатели нормальности распределения полученных данных: K-S d >0,2; Lilleofors >0,2).

 

Рис. 1. Показатели уровня экспрессии циклооксигеназы-1 и -2 в слизистой оболочке желудка экспериментальных крыс. По вертикальной оси — значения концентрации циклооксигеназы-1 и -2 в гомогенате слизистой оболочки желудка крыс (нг/мл), по горизонтальной оси — экспериментальные группы. Статистическая значимость различий: *относительно группы сравнения; #относительно контрольной группы. ЦОГ — циклооксигеназа

 

Оказалось, что концентрация ЦОГ-1 в гомогенате желудков крыс не имела статистически значимых различий между контрольной и подопытной группами: 5,4±0,26 и 7,5±1,09 нг/мл соответственно.

На этом фоне концентрация ЦОГ-2, в группе сравнения составившая 3,1±0,18 нг/мл, у крыс контрольной группы (которым с целью моделирования гастропатии вводили индометацин) уменьшилась в 1,2 раза и составила 2,5±0,12 нг/мл (p=0,016). При этом в подопытной группе (где крысы получали трипептид Leu-Ile-Lys) концентрация ЦОГ-2 составила 1,1±0,05 нг/мл, что было ниже уровня крыс контрольной группы в 2,3 раза (p <0,00001), а также в 2,8 раза уступало уровню у интактных крыс (p <0,00001).

Таким образом, проведённые эксперименты показали, что применение трипептида Leu-Ile-Lys в условиях индометациновой гастропатии сопровождалось существенным ослаблением оксидативного повреждения СОЖ.

Во-первых, об этом свидетельствовала нормализация концентрации ТБРП, значительно повышенной в контроле заболевания. Как известно, основным представителем ТБРП служит малоновый диальдегид — главный продукт перекисного окисления мембранных фосфолипидов. По-видимому, на фоне применения трипептида Leu-Ile-Lys ослаблялось повреждение мембран клеток желудка активными формами кислорода.

Во-вторых, происходило существенное увеличение ОАА — интегративного показателя ферментной и неферментной антиоксидантной защиты клеток.

В-третьих, были зафиксированы весьма характерные изменения активности антиоксидантных ферментов: глутатионпероксидазы, каталазы и супероксиддисмутазы. В контроле заболевания их активность значительно возрастала, что указывает на компенсаторную реакцию ферментных систем клеток в ответ на развивающийся оксидативный стресс. На фоне же применения трипептида Leu-Ile-Lys активность всех трёх ферментов существенно уменьшалась. Вероятно, под влиянием трипептида Leu-Ile-Lys происходило снижение интенсивности образования свободных радикалов кислорода, вследствие чего не возникало субстратной стимуляции ферментной активности. В совокупности это может свидетельствовать о прямом антиоксидантном действии трипептида Leu-Ile-Lys.

Достаточно давно существует мнение, что оксидативное повреждение СОЖ при язвенной болезни тесно сопряжено развитием воспалительных процессов, маркёром которых служит уровень экспрессии провоспалительного фермента ЦОГ-2 [10, 11]. В наших экспериментах было установлено, что концентрация ­ЦОГ-2 в контроле снижается относительно показателей интактных крыс, что логично объясняется неселективным ингибирующим действием индометацина на ЦОГ-1 и ЦОГ-2. Важно, что в этих условиях происходило существенное снижение уровня ЦОГ-2 в желудках крыс подопытной группы, получавших лечение, относительно контроля. Это указывает на ослабление воспалительных процессов в СОЖ крыс, которым вводили изучаемый трипептид. Не исключено, что в основе такого эффекта лежало антиоксидантное действие трипептида Leu-Ile-Lys, выявленное в настоящем исследовании.

Вывод

Применение трипептида Leu-Ile-Lys в условиях экспериментальной индометациновой язвы желудка сопровождается существенным ослаблением оксидативного повреждения слизистой оболочки желудка, о чём свидетельствуют нормализация концентрации тиобарбитурат-реактивных продуктов окисления жирных кислот, рост общей антиоксидантной активности и ослабление активности антиоксидантных ферментов. Кроме того, происходит ослабление воспалительных процессов в слизистой оболочке желудка, на что указывает существенное снижение уровня экспрессии провоспалительного фермента циклооксигеназы-2.

 

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

Об авторах

Самира Эльшадовна Лоренц

Алтайский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: pharm_s@mail.ru
Россия, г. Барнаул, Россия

Олеся Николаевна Мазко

Алтайский государственный медицинский университет

Email: pharm_s@mail.ru
г. Барнаул, Россия

Олеся Геннадьевна Макарова

Алтайский государственный медицинский университет

Email: pharm_s@mail.ru
Россия, г. Барнаул, Россия

Александр Юрьевич Жариков

Алтайский государственный медицинский университет

Email: pharm_s@mail.ru
Россия, г. Барнаул, Россия

Юрий Владимирович Кореновский

Алтайский государственный медицинский университет

Email: pharm_s@mail.ru
Россия, г. Барнаул, Россия

Ольга Васильевна Азарова

Алтайский государственный медицинский университет

Email: pharm_s@mail.ru
Россия, г. Барнаул, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы