Effect of Leu-Ile-Lys tripeptide on the activity of free radical oxidation and expression of сyclooxygenase-1 and -2 in gastric mucosa in experimental indomethacin-induced ulcer in rats

Abstract


Aim. To determine the effect of Leu-Ile-Lys tripeptide on indicators of oxidative stress and expression of cyclooxygenase-1 and -2 in the gastric mucosa on the background of experimental indomethacin-induced ulcer.

Methods. Experiments were performed on 35 male Wistar rats with a body mass of 200-250 g aged 2-3 months that were divided into 3 groups: the control group (intact rats, 8 animals), control group (simulation of indomethacin-induced gastropathy, 12 animals) experimental group (simulation of indomethacin-induced gastropathy + administration of Leu-Ile-Lys tripeptide, 15 animals). The tripeptide Leu-Ile-Lys obtained by chemical synthesis (sample purity at least 98%) was administered intragastrically daily for 7 days before the simulation of indomethacin-induced damage of the gastric mucosa in a dose of 11.5 mg/kg. The model of indomethacin-induced damage to the rodent gastric mucosa was reproduced by a single intragastric administration of indomethacin in a dose of 60 mg/kg in 1 ml of saline. In the stomach homogenate the activity of free radical oxidation was determined by conventional methods. For quantitative determination of cyclooxygenase-1, -2 in gastric homogenate the method of enzyme immunoassay was used. The concentration was determined spectrometrically by the color intensity of the samples.

Results. With a prophylactic administration of tripeptide Leu-Ile-Lys, concentration of tiobarbiturate-reactive products was normalized, total antioxidant activity increased and the activity of antioxidant enzymes decreased compared to the control group. The concentration of cyclooxygenase-2 in gastric homogenate from the experimental animals was 2.3 times lower than that of the control rats.

Conclusion. Use of Leu-Ile-Lys tripeptide in experimental indomethacin-induced gastric ulcer showed a significant decrease of oxidative damage and inflammation in the gastric mucosa.


В процессе разработки нового противоязвенного средства пептидной природы нами было установлено, что пептидный комплекс из тканей свиных почек в условиях экспериментальной индометациновой язвы оказывает выраженное гастропротективное действие, которое сопровождается существенным ослаблением активности процесса свободнорадикального окисления в слизистой оболочке желудка и снижением уровня экспрессии циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2) [1, 2].

В дальнейшем на основе данных об аминокислотном составе пептидного комплекса из тканей свиных почек посредством драг-дизайна нами были смоделированы 7 химических структур индивидуальных пептидов с потенциальной гастропротективной активностью, экспериментальная апробация которой позволила установить, что трипептид Leu-Ile-Lys (лейцин-изолейцин-лизин) обладает выраженным терапевтическим действием при индометациновой гастропатии, сопоставимым по силе с лекарственным препаратом омепразолом [3].

Учитывая большое значение оксидативного повреждения слизистой оболочки желудка и роль ферментов ЦОГ-1 и ЦОГ-2 в развитии гастропатии [4, 5], а также полученные ранее результаты, нас заинтересовало изучение влияния трипептида Leu-Ile-Lys на активность свободнорадикального окисления и уровень экспрессии ЦОГ-1 и ЦОГ-2 в желудке крыс при экспериментальной гастропатии.

Цель исследования: определить характер влияния трипептида Leu-Ile-Lys на показатели оксидативного стресса и уровень экспрессии ферментов ЦОГ-1 и ЦОГ-2 в слизистой оболочке желудка на фоне экспериментальной индометациновой язвы.

Эксперименты проведены на 35 самцах крыс линии Wistar с массой тела 200–250 г в возрасте 2–3 мес. Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище. Исследования на крысах проводили согласно «Правилам надлежащей лабораторной практики» (GLP), утверждённым приказом Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 23.08.2010 №708, и требованиям Федерального закона «О защите животных от жестокого обращения» от 01.09.1997.

Экспериментальные животные были разделены на три группы:
– группа сравнения (интактные крысы, 8 особей);
– контрольная группа (моделирование индометациновой гастропатии, 12 особей);
– подопытная группа (моделирование индометациновой гастропатии + введение трипептида Leu-Ile-Lys, 15 особей).

Трипептид Leu-Ile-Lys получали методом химического синтеза на предприятии SHANGHAI APEPTIDE CO., LTD (г. Шанхай, Китайская народная республика) при посредничестве ЗАО «Эвалар» (г. Бийск, Россия). Чистота образца составляла не менее 98%.

Трипептид Leu-Ile-Lys вводили животным подопытной группы внутрижелудочно через зонд ежесуточно в течение 7 дней до моделирования индометацинового повреждения ­слизистой оболочки желудка (СОЖ) в дозе 11,5 мг/кг. Последнее введение осуществляли за 1 ч до начала действия язвообразующего фактора. Животные группы сравнения получали эквиобъёмное количество изотонического раствора натрия хлорида в соответствующих режимах введения. Модель индометацинового повреждения СОЖ крыс воспроизводили путём однократного внутрижелудочного введения индометацина в дозе 60 мг/кг в 1 мл изотонического раствора натрия хлорида [6, 7].

Через 4 ч после введения индометацина животных подвергали эвтаназии под эфирным наркозом, желудки извлекали, вскрывали по малой кривизне, промывали изотоническим раствором натрия хлорида, измельчали, гомогенизировали 3-кратным циклом замораживания-размораживания.

В гомогенате желудка крыс определяли показатели активности свободнорадикального окисления по общепринятым методикам [8]. Для оценки прооксидантного статуса определяли концентрацию тиобарбитурат-реактивных продуктов окисления жирных кислот (ТБРП), основной представитель которых — малоновый диальдегид, колориметрическим методом, оценивая интенсивность окраски раствора в ходе химической реакции ТБРП с тиобарбитуровой кислотой. Суммарный показатель концентрации всех прооксидантов и свободнорадикальных метаболитов — общую прооксидантную активность — определяли по интенсивности окраски флюоресцентного комплекса, образующегося при взаимодействии продуктов перекисного окисления ТВИН-80 с тиобарбитуровой кислотой.

Для оценки антиоксидантного статуса клеток определяли общую антиоксидантную активность (ОАА) и активность антиоксидантных ферментов: глутатионпероксидазы, каталазы и супероксиддисмутазы.

ОАА оценивали как интегративный показатель активности всех ферментных и неферментных факторов нейтрализации свободных радикалов по степени угнетения Fe2+/аскорбат-зависимого окисления ТВИН-80 гомогенатом ткани.

Активность каталазы определяли по подавлению ферментом окисления молибдата натрия перекисью водорода.

Активность супероксиддисмутазы оценивали по содержанию в пробе нитроформазана, окрашенного продукта восстановления нитротетразолия супероксидными радикалами.

Маркёром активности глутатионпероксидазы служило определение неокисленного глутатиона по цветной реакции с реактивом Эллмана.

Для количественного определения ­ЦОГ-1 и ЦОГ-2 в гомогенате желудка методом иммуноферментного анализа использовали набор для определения простагландин-эндопероксид-синтетазы 1,2 (PTGS 1,2) фирмы Cloud-Clone Corp. Микропланшет, входящий в данный набор, был предварительно покрыт антителами, характерными для PTGS 1,2. Затем стандарты и образцы добавляли в соответствующие лунки микропланшета с биотинилированными антителами, характерными для PTGS 1,2. Далее в каждую лунку микропланшета добавляли авидин, конъюгированный с пероксидазой хрена, и помещали в инкубатор. После этого добавлялся раствор субстрата тетраметилбензидина. Только в тех лунках, которые содержат PTGS 1,2, биотинилированные антитела и конъюгированный авидин, происходило изменение цвета.

Фермент-субстратная реакция прекращалась при добавлении раствора серной кислоты, и изменение цвета оценивали спектрометрически при длине волны 450±10 нм. Концентрацию PTGS 1,2 в образцах определяли при помощи сравнения оптической плотности образцов со стандартной кривой.

Статистическая обработка проведена с помощью программы Statistica for Windows 12.0. Результаты при наличии нормальности распределения представлены в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего (M±m), при отсутствии нормальности распределения представлены в виде медианы и интерквартильного размаха Me (25%; 75%). Нормальность распределения определяли по критерию Колмогорова–Смирнова в модификации Лиллиефорса. Для выявления статистической значимости межгрупповых различий при наличии нормальности распределения использовали параметрический t-критерий Стьюдента, при отсутствии нормальности распределения применяли непараметрический критерий Манна–Уитни. Разницу считали достоверной при значении p <0,05 [9].

Результаты определения показателей прооксидантного и антиоксидантного статусов в СОЖ крыс представлены в табл. 1 (показатели нормальности распределения полученных данных: K-S d <0,2; Lilleofors <0,2).

 

Таблица 1. Показатели прооксидантного и антиоксидантного статусов в слизистой оболочке желудка экспериментальных животных

Группы

Показатели
прооксидантного статуса

Показатели антиоксидантного статуса

ТБРП

ОПА

ОАА

ГПО

КАТ

СОД

Группа сравнения

5,2

89,2

72,4

48,4

30,9

28,7

Контрольная группа

10,2

pинт=0,024

+96%

64,7

pинт=0,000004

–27%

26,8

pинт=0,000003

–63%

66,4

pинт=0,00002

+37%

35,8

pинт=0,005

+16%

38,2

Подопытная группа

7,1

pконтр=0,0001

–30%

74,5

pинт=0,026

–20%

pконтр=0,0006

+15%

40,6

pинт=0,0002

–45%

pконтр=0,00002

+51%

26,7

pинт=0,0004

–45%

pконтр=0,00002

–60%

11,9

pинт=0,0001

–61%

pконтр=0,00002

–67%

8,1

pинт=0,001

–72%

pконтр=0,00005

–79%

Примечание: ТБРП — концентрация тиобарбитурат-реактивных продуктов (мкмоль); ОПА — общая прооксидантная активность (%); ОАА — общая антиоксидантная активность (%); ГПО — активность глутатионпероксидазы (%); КАТ — активность каталазы (%); СОД — активность супероксиддисмутазы (%); pинт — показатель статистической значимости различий относительно группы сравнения; pконтр — показатель статистической значимости относительно контрольной группы. Данные приведены в виде среднего значения показателя.

 

Оказалось, что концентрация ТБРП в контрольной группе при моделировании гастропатии увеличилась на 96% по сравнению с уровнем у интактных крыс. При этом в подопытной группе, где животным вводили ­трипептид ­Leu-Ile-Lys, величина описываемого показателя была на 30% меньше, чем в контрольной группе, и практически не отличалась от уровня группы сравнения.

На этом фоне ОАА у крыс контрольной группы уменьшалась на 63% относительно уровня интактных животных. В подопытной группе при применении трипептида Leu-Ile-Lys ОАА была на 51% больше, чем в контроле.

Активность глутатионпероксидазы в контрольной группе относительно группы сравнения возросла на 37%. В то же время величина данного показателя в подопытной группе существенно снижалась как относительно контроля, так и в сравнении с интактными животными: на 60 и 45% соответственно.

Активность каталазы в контрольной группе также увеличилась относительно группы сравнения — на 16%. В подопытной группе произошло уменьшение активности каталазы относительно контрольной группы на 67%, а в сравнении с интактными животными — на 61%.

Активность супероксиддисмутазы в СОЖ крыс контрольной группы приобретала тенденцию к росту относительно интактных крыс, однако это изменение не носило статистически значимого характера. В условиях коррекции экспериментальной гастропатии изучаемым трипептидом Leu-Ile-Lys зарегистрировано существенное снижение активности супероксиддисмутазы: на 79% относительно контроля заболевания и на 72% относительно группы сравнения.

Результаты определения показателей уровня экспрессии ЦОГ-1 и ЦОГ-2 в СОЖ крыс представлены на рис. 1 (показатели нормальности распределения полученных данных: K-S d >0,2; Lilleofors >0,2).

 

Рис. 1. Показатели уровня экспрессии циклооксигеназы-1 и -2 в слизистой оболочке желудка экспериментальных крыс. По вертикальной оси — значения концентрации циклооксигеназы-1 и -2 в гомогенате слизистой оболочки желудка крыс (нг/мл), по горизонтальной оси — экспериментальные группы. Статистическая значимость различий: *относительно группы сравнения; #относительно контрольной группы. ЦОГ — циклооксигеназа

 

Оказалось, что концентрация ЦОГ-1 в гомогенате желудков крыс не имела статистически значимых различий между контрольной и подопытной группами: 5,4±0,26 и 7,5±1,09 нг/мл соответственно.

На этом фоне концентрация ЦОГ-2, в группе сравнения составившая 3,1±0,18 нг/мл, у крыс контрольной группы (которым с целью моделирования гастропатии вводили индометацин) уменьшилась в 1,2 раза и составила 2,5±0,12 нг/мл (p=0,016). При этом в подопытной группе (где крысы получали трипептид Leu-Ile-Lys) концентрация ЦОГ-2 составила 1,1±0,05 нг/мл, что было ниже уровня крыс контрольной группы в 2,3 раза (p <0,00001), а также в 2,8 раза уступало уровню у интактных крыс (p <0,00001).

Таким образом, проведённые эксперименты показали, что применение трипептида Leu-Ile-Lys в условиях индометациновой гастропатии сопровождалось существенным ослаблением оксидативного повреждения СОЖ.

Во-первых, об этом свидетельствовала нормализация концентрации ТБРП, значительно повышенной в контроле заболевания. Как известно, основным представителем ТБРП служит малоновый диальдегид — главный продукт перекисного окисления мембранных фосфолипидов. По-видимому, на фоне применения трипептида Leu-Ile-Lys ослаблялось повреждение мембран клеток желудка активными формами кислорода.

Во-вторых, происходило существенное увеличение ОАА — интегративного показателя ферментной и неферментной антиоксидантной защиты клеток.

В-третьих, были зафиксированы весьма характерные изменения активности антиоксидантных ферментов: глутатионпероксидазы, каталазы и супероксиддисмутазы. В контроле заболевания их активность значительно возрастала, что указывает на компенсаторную реакцию ферментных систем клеток в ответ на развивающийся оксидативный стресс. На фоне же применения трипептида Leu-Ile-Lys активность всех трёх ферментов существенно уменьшалась. Вероятно, под влиянием трипептида Leu-Ile-Lys происходило снижение интенсивности образования свободных радикалов кислорода, вследствие чего не возникало субстратной стимуляции ферментной активности. В совокупности это может свидетельствовать о прямом антиоксидантном действии трипептида Leu-Ile-Lys.

Достаточно давно существует мнение, что оксидативное повреждение СОЖ при язвенной болезни тесно сопряжено развитием воспалительных процессов, маркёром которых служит уровень экспрессии провоспалительного фермента ЦОГ-2 [10, 11]. В наших экспериментах было установлено, что концентрация ­ЦОГ-2 в контроле снижается относительно показателей интактных крыс, что логично объясняется неселективным ингибирующим действием индометацина на ЦОГ-1 и ЦОГ-2. Важно, что в этих условиях происходило существенное снижение уровня ЦОГ-2 в желудках крыс подопытной группы, получавших лечение, относительно контроля. Это указывает на ослабление воспалительных процессов в СОЖ крыс, которым вводили изучаемый трипептид. Не исключено, что в основе такого эффекта лежало антиоксидантное действие трипептида Leu-Ile-Lys, выявленное в настоящем исследовании.

Вывод

Применение трипептида Leu-Ile-Lys в условиях экспериментальной индометациновой язвы желудка сопровождается существенным ослаблением оксидативного повреждения слизистой оболочки желудка, о чём свидетельствуют нормализация концентрации тиобарбитурат-реактивных продуктов окисления жирных кислот, рост общей антиоксидантной активности и ослабление активности антиоксидантных ферментов. Кроме того, происходит ослабление воспалительных процессов в слизистой оболочке желудка, на что указывает существенное снижение уровня экспрессии провоспалительного фермента циклооксигеназы-2.

 

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

S E Lorents

Altai State Medical University

Author for correspondence.
Email: pharm_s@mail.ru

Russian Federation, Barnaul, Russia

E N Mazko

Altai State Medical University

Email: pharm_s@mail.ru
Barnaul, Russia

O G Makarova

Altai State Medical University

Email: pharm_s@mail.ru

Russian Federation, Barnaul, Russia

A Yu Zharikov

Altai State Medical University

Email: pharm_s@mail.ru

Russian Federation, Barnaul, Russia

Yu V Korenovskiy

Altai State Medical University

Email: pharm_s@mail.ru

Russian Federation, Barnaul, Russia

O V Azarova

Altai State Medical University

Email: pharm_s@mail.ru

Russian Federation, Barnaul, Russia

  1. Lorents S.E., Zharikov A.Yu., Bobrov I.P. et al. Gastroprotective action of the peptide comlex from pig kidneys in experimental «indometacine» ulcer in rats. Sibirskiy nauchnyy meditsinskiy zhurnal. 2017; 37 (6): 5–9. (In Russ.)
  2. Lorents S.E., Zharikov A.Yu., Mazko O.N. et al. Influence of the peptide complex from pork kidneys tissues on indicators of free-radical oxidation and the expression of COX-1,2 in experimental gastropathy. Ehksperimentalʹnaya i klinicheskaya gastroehnterologiya. 2018; 154 (6): 81–85. (In Russ.)
  3. Zharikov A.Yu., Lorent S.E., Bobrov I.P. et al. Pharmacologically active tripeptide Leu-Ile-Lys in indome­thacin-induced gastric ulcer. Intern. J. Biomed. 2018; 8 (4): 351–354. doi: 10.21103/Article8(4)_OA17.
  4. Shcherbatykh A.V., Kulinskiy V.I., Bolʹshe­shapov A.A., Sokolova S.V. Lipid peroxydation and antioxydative system in peptic ulcer desease and postgastroresection syndrome. Sibirskiy nauchnyy meditsinskiy zhurnal. 2005; (3): 9–13. (In Russ.)
  5. Demir S., Yilmaz M., Köseoğlu M. et al. Role of free radicals in peptic ulcer and gastritis. Turk. J. Gastroen­erol. 2003; 14 (1): 39–43. PMID: 14593536.
  6. Krylova S.G., Turetskova V.F., Makarova O.G. et al. Comparative study of antiulcer activity of dry aspen bark extracts in different dosage forms. Tikhookeanskiy medi­tsinskiy zhurnal. 2015; 2 (60): 18–21. (In Russ.)
  7. Turetskova V.F., Makarova O.G., Talykova N.M. et al. A method for obtaining a medication with an anti-ulcer effect. Patent for ­invention RUS 2533228. Bulletin №32 issued on 20.11.2014. (In Russ.)
  8. Bryukhanov V.M., Zverev Ya.F., Lampatov V.V. et al. Metody doklinicheskogo (ehksperimentalʹnogo) issledovaniya vliyaniya lekarstvennykh sredstv na funktsiyu pochek. (Methods of preclinical (experimental) study of the effect of drugs on renal function.) Novosibirsk: Geo. 2013; 84 р. (In Russ.)
  9. Khafizʹyanova R.Kh., Burykin I.M., Ale­eva G.N. Mate­maticheskaya statistika v ehksperimentalʹnoy i klini­cheskoy farmakologii. (Mathematical statistics in expe­rimental and clinical pharmacology.) Kazanʹ: Meditsina. 2006; 374 р. (In Russ.)
  10. Gill R., Tsung A., Billiar T. Linking oxidative stress to inflammation: Toll-like receptors. Free Radical Biol. Med. 2010; 48 (9): 1121–1132. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2010.01.006.
  11. Uchida K. A lipid-derived endogenous inducer of COX-2: a bridge between inflammation and oxidative stress. Mol. Cells. 2008, 25 (3): 347–351. PMID: 18483467.

Supplementary files

There are no supplementary files to display.

Views

Abstract - 64

PDF (Russian) - 74

Cited-By


PlumX


© 2019 Lorents S.E., Mazko E.N., Makarova O.G., Zharikov A.Y., Korenovskiy Y.V., Azarova O.V.

Creative Commons License

This work is licensed
under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.


Свидетельство о регистрации СМИ ЭЛ № ФС 77-75008 от 1 февраля 2019 года выдано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор)