Влияние на процесс гликирования сывороточного альбумина синтетических противодиабетических средств

Аннотация

При диагностике сахарного диабета наиболее часто определяют гликемию натощак и глюкозу в моче. Но эти исследования дают информацию о гликемии, имевшей место в момент исследования или в последние 5 — 6 часов (глюкоза в моче). Для назначения же пролонгированных форм инсулина требуется информация о периоде гликемии, равном дням и неделям. Для этого важное диагностическое значение имеет определение содержания фруктозамина.

Полный текст

Термином “фруктозамин” в клинике обозначают сумму гликированных белков сыворотки крови. Гликирование происходит обычно в результате неферментативной реации, хотя нельзя исключить и ферментативное гликозилирование. Гликирование идет не только в крови, но и в тканях. В начале скорость гликирования и синтеза новых продуктов равна скорости их диссоциации (образуются основания Шиффа), на второй стадии образуются стабильные продукты гликирования (продукты Амадори). Для гликирования важны не только длительность гипергликемии, но и доступность аминогруппы белка. Формирование конечных продуктов гликирования изменяет структуру белка и является процессом, нарушающим структуру белков тканей, клеточные мембраны, структуру и функции клеток. По-видимому, эти изменения лежат в основе развития микроангиопатий, дисфункции почек, нервной системы.

Целью нашей работы являлась разработка способа скрининговой оценки средств, препятстствующих гликированию и применение для этого ряда веществ, которые показали себя активными препаратами в опытах in vitro. В последующем эти препараты были исследованы в опытах на животных с экспериментальным аллоксановым диабетом.

Реакция неферментативного гликирования проводилась в опытах in vitro при температуре +37°С. Для гликирования был выбран 5% раствор сывороточного альбумина человека, в который добавляли глюкозу в концентрации 40 мМ и азид натрия (0,02%) для предотвращения развития микроорганизмов в среде. Уровень фруктозамина определяли в среде до начала инкубации, на 4 и 7-й дни. Результаты этих опытов были контрольными и сравнивались с таковыми при исследовании ряда фармакологических средств, добавленных в среду в концентрации 10‘³М. Такая стандартная концентрация была выбрана потому, что в организме она вполне вероятна и в то же время достаточно велика, чтобы не пропустить вещество, обладающее реальным эффектом.

Уровень фруктозамина определяли фотометрическим методом с тетразолием нитросиним при pH 10,3. Контролем служил полностью гликированный сывороточный альбумин человека, в микромолях которого и оценивалось образование фруктозамина в испытуемой пробе.

Было изучено действие средств, которые in vitro оказывали эффект, на способность понижать уровень гликированности белков при аллоксановом диабете у крыс. Для этого у белых крыс массой 180—210 г вызывали диабет I типа путем внутрибрюшинного введения тетрагидрата аллоксана в дозе 80 мг/кг. После месячного перерыва из подъязычной вены крыс брали кровь и анализировали ее на содержание глюкозы и фруктозамина. Предполагалось, что уровни глюкозы и фруктозамина за это время стабилизируются. После этого крыс наблюдали еще в течение месяца, по окогф чании которого у них вторично забирали кровь и анализировали ее на содержание глюкозы и фруктозамина.

Таблица 1

Влияние синтетических противодиабетических средств на процессы гликирования сывороточного  альбумина человека при 37° С (в мкМ/л)

Дни инкубации	Альбумин, глюкоза	Глиформин (метформин), глюкоза, альбумин	Гликлазид (диабетон), глюкоза, альбумин	Гликвидон (глюренорм) глюкоза, альбумин	Глибенкламид (манинил), глюкоза, альбумин
Перед инкубацией	12,37±0,87	12,37±0,87	12,37±0,87	12,37±0,87	12,37±0,87
4-й день	45,5±12,51	32,7± 1,18	31,2±3,34	6,2±0,93	24,7± 1,41
Р		< 0,02	< 0,01	< 0,001	< 0,001
7-й день	80,1±3,4	70,8±4,07	66,9±5,06	13,6±1,18	71,4±3,48
Р		> 0,05	>0,05	< 0,001	> 0,05
21-й день	206,5±28,1	—	—	220,6±6,6	—
Р				> 0,05

Другие группы крыс в течение второго месяца получали перорально фармакологические препараты, результаты применения которых оценивали по уровню глюкозы и фруктозамина также в конце второго месяца.

В табл. 1 показано увеличение уровня фруктозамина в среде инкубации при 37°С и концентрации глюкозы 40 мМ, а также влияние на этот процесс добавления в инкубационную среду метформина, диабетона, глюренорма, манинила.

Из табл. 1 следует, что инкубация глюкозы с белком вызывает высоко достоверное увеличение содержания фруктозамина в среде. До инкубации в среде также определяли небольшой уровень j вещества, напоминающего фруктозамин, — формазана. Этот факт хорошо известен как результат реакции тетразолия нитросинего с белком. Контрольное гликирование свидетельствует о постоянном нарастании концентрации фруктозамина в среде. В конечном итоге его концентрация на 21-й день превышала исходный уровень в 16,7 раза. Различие было высокодостоверным как по сравнению с негликированным белком, так и между каждой из исследованных проб.

В этой же таблице показано влияние на процесс гликирования ряда синтетических противодиабетических средств по сравнению с соответствующим уровнем контрольной пробы. Метформин, диабетон, глюренорм и манинил на 4-й день инкубации статистически достоверно снижали образование фруктозамина, особенно глюренорм: 6,2±0,93 — в опы$ ® по сравнению с 45,5± 12,5 — в контроле (Р<0,001). На 7-й день различие было замечено только для глюренорма, который продолжал уменьшать образование фруктозамина в отличие от остальных веществ. На 21-й день инкубации глюренорм не выявлял способности снижать образование фруктозамина. На рис. 1 показана интенсивность гликирования сывороточного альбумина человека глюкозой в контроле, при инкубации с глюренормом и метформином.

Таким образом, синтетические противодиабетические средства заметно снижали образование фруктозамина только в ранние сроки инкубации, большинство веществ — на 4-й день, глю- ренорм — до 7-го дня в условиях “жесткого” гликирования.

Интенсивность гликированного сывороточного альбумина человека в мкМ/л с глюкозой в контроле (1), при инкубации с глюренормом (2), при инкубации с метформином (3), снижали образование фруктозамина только в ранние сроки инкубации, большинство веществ — на 4-й день, глюренорм — до 7-го дня в условиях “жесткого” гликирования.

Нами была изучена реакция гликирования при + 1—2°С. Заметное увеличение уровня фруктозамина отмечалось лишь на 16 и 30-й дни инкубации при этой низкой температуре. При этой температуре синтетические противодиабетические средства снижали на 40—50% уровень фруктозамина в среде независимо от срока инкубации. Иными словами, при более мягких условиях гликирования эффект препаратов становился более длительным и выраженным.

В серии опытов на крысах с аллоксановым диабетом мы изучали влияние синтетических противодиабетических средств при их длительном (в течение месяца) применении. Дело в том, что эти опыты могли иметь значение при стабильно повышенном в течение длительного времени уровне глюкозы в крови, так как его снижение в течение месяца само по себе могло уменьшить уровень гликированности белков.

Нами были проведены опыты на здоровых крысах. Уровень глюкозы в группе 9 интактных крыс был равен 3,37± ±0,19 мМ/л, а уровень фруктозамина — 3,98±1,05 мкМ полностью гликированного сывороточного альбумина человека.

Таблица 2

Влияние синтетических противодиабетических средств на уровень фруктозамина у крыс с экспериментальным аллоксановым диабетом (М±ш)

Вещества, вводимые крысам с аллоксановым диабетом в течение месяца, доза	Углеводы в крови	До начала введения препарата	Через месяц после введения препарата
Глибенкламид (манинил), 0,35 мг/кг/сут	глюкоза (мМ/л) фруктозамин (мкМ/л)	7,56±0,28 15,25±0,79	7,87±0,95 Р>0,05 ' 10,99±1,74 Р<0,01
Глиформин (метформин) 30 мг/кг/сут	глюкоза (мМ/л) фруктозамин (мкМ/л)	6,93±0,31 20,29±2,5	7,49±0,51 Р>0,05 12,63±1,36 Р<0,02
Гликвидон (глюренорм) 2 мг/кг/сут	глюкоза (мМ/л) фруктозамин (мкМ/л)	8,69±1,09 16,08±2,01	8,10±1,14 Р>0,05 . 10,02±1,37 Р<0,02

В табл. 2 приведены результаты опытов на крысах с аллоксановым диабетом. Во всех группах мы наблюдали повышение среднего уровня глюкозы в крови в 2,0—2,5 раза, а также фруктозамина в 3—5 раз через месяц после введения аллоксана. После месячного введения манин ил а, метформина, глюренорма отмечено, что уровень глюкозы в крови ни в одной из групп не изменился статистически достоверно, и средние его величины были близки друг ‘ к другу, что и понятно, так как у крыс нами был воспроизведен I тип диабета. Однако уровень фруктозамина был везде ниже на 25—30% по сравнению с контролем. Эти данные подтверждают возможность непосредственного влияния синтетических противодиабетических средств на процесс гликирования независимо от уровня глюкозы в крови. Наши результаты соответствуют данным [2], полученным в аналогичных опытах для одного из синтетических противодиабетических средств — букарбана.

Механизм описанного эффекта синтетических противодиабетических средств заслуживает внимания прежде всего потому, что показывает возможность уменьшать гликирование белков в крови. Длительное и значительное по-¹ вышение концентрации глюкозы в крови сопровождается гликированием белков не только крови, но и тканей и ведет к конформационным изменениям белковых молекул. Нами, по данным флуоресцентного анализа [1], было показано, что гликирование вызывает изменение конформации белковых молекул. Известно также, что при гликировании между молекулами белка образуются дополнительные связи, которые еще более изменяют функции белковой молекулы [7, 10]. Поэтому при уменьшении гликирования наблюдается менее быстрое развитие осложнений диабета (микроангиопатии, нейропатии, нефропатии). Одним из первых исследованных с этой целью соединений был аминогуанидин [3, 4, 9]. Весьма вероятно, что синтетические противодиабетические средства могут составить второй класс таких соединений. Их аминогруппы конкурируют аминогруппой лизина за соединение с молекулой глюкозы или фруктозы, что уменьшает гликирование белка.

Однако возможен и второй вариант их действия — изменение конформации белковой молекулы, которая делает аминогруппу лизина менее доступной для альдегидной группы сахара, что препятствует гликированию. Результаты данной работы, во-первых, показывают еще один эффект синтетических противодиабетических средств и тем самым расширяют понимание механизма их действия. Во-вторых, они показывают перспективность поиска в данной группе средств, обладающих более сильным эффектом на процесс гликирования белков.

ВЫВОДЫ

1. Синтетические противодиабетические средства (глиформин, гликлазид, гликвидон, глибенкламид) обладают способностью в опытах in vitro уменьшать процесс гликирования при инкубации высоких концентраций глюкозы с сывороточным альбумином человека.
2. При более мягком режиме гликирования эффект препаратов становится более длительным и выраженным.
3. При инкубации в жестком режиме, когда гликирование происходит в >4—6 раз более интенсивно, эффект угнетения гликирования для большинства препаратов, кроме гликвидона, не отмечается.
4. При введении в течение месяца крысам с аллоксановым диабетом глиформина, гликвидона и глибенкламида наблюдается снижение уровня гликированности белков при неизменной концентрации глюкозы.