Detection of hemocoagulative activity of leukemia cells in acute myeloid leukemia and chronic myeloid leukemia

Full Text

Коагулопатия у больных миелобластным лейкозом, в частности острым промиелоцитарным лейкозом, часто является комплексной и состоит из классического синдрома ДВС [2, 4], системного фибринолиза и гемостатических сосудистых нарушений, вызванных протеолитическими ферментами, например лейкоцитарной эластазой.

Злокачественные програнулоциты у больных острым промиелоцитарным лейкозом содержат тканевой фактор [5], который инициирует образование тромбина по внешнему пути. Кроме того, предположено, что злокачественные клетки могут продуцировать большое количество цитокинов, интерлейкина 1, который стимулирует синтез тканевого фактора эндотелием кровеносных сосудов и моноцитами. ДВС часто драматически усугубляется во время циторедуктивной химиотерапии. Процесс, наиболее вероятно, обусловлен активацией Fas-рецепторов (система CD95) с последующей активацией протеаз, эндонуклеаз, деградацией ДНК, апоптозом [6, 7] и освобождением после этого преформированного тканевого фактора или других прокоагулянтов в циркуляцию (рис. 1).

Протеазы, кроме тромбина и плазмина, продуцируются миелоидными клетками у пациентов с острым лейкозом. Один из протеолитических ферментов — эластаза — была идентифицирована в культуре лейкозных клеток. Эластаза обладает широким спектром протеолитической активности и деградирует фибриноген на большие и меньшие продукты деградации (рис. 1). Еще не выяснено, насколько протеазы ответственны за кровоточивость у больных острым лейкозом. Наконец, кроме тромбоцитопении, химиотерапевтические агенты, антибиотики или циркулирующие продукты деградации фибриногена вызывают дисфункцию тромбоцитов и нарушение образования гемостатической пробки.

 

Рис. 1. Механизм нарушения гемостаза у больных острым промиелоцитарным лейкозом.

 

Одной из причин, препятствующих успешному лечению больных миелобластными лейкозами, является развитие синдрома ДВС [1], поэтому мы поставили задачу оценить эффективность предложенного ранее одним из нас [3] метода определения тканевого тромбопластина в клетках для обнаружения экспрессии тканевого фактора лейкозными клетками в периферической крови и в клетках пунктата костного мозга, так как именно под его влиянием развивается внутрисосудистое свертывание крови.

Под нашим наблюдением находились 13 первичных больных, у 6 из них был острый миелобластный лейкоз и у 7 — хронический миелолейкоз. Диагноз устанавливали на основании данных клиники, гемограмм, миелограмм, цитохимии и иммунофенотипирования клеток костного мозга методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител к антигенам HLA-DR, CD10, CD34, CD38, CD71, CD95, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD24, CD72, slgM, slgG, _к-цепей, _^-цепей, CDllb и лазерного проточного цитофлюориметра «EPICS-XL-MCZ, Coulter». Для контроля была исследована периферическая кровь 3 здоровых добровольцев.

Клетки периферической крови (гранулоциты, мононуклеары) здоровых добровольцев, больных острым миелобластным лейкозом и хроническим миелолейкозом (бластные и созревающие формы), а также клетки костного мозга больных изолировали, используя градиенты раствора Перколла в забуференном 0,9% растворе NaCl (pH 7,4). Выделение бластных клеток происходило на плотности 1,047—1,05, миелоцитов и метамиелоцитов — 1,057, гранулоцитов — 1,07, мононуклеаров — 1,077. Клетки были ресуспендированы в растворе Хенкса (pH 7,4). Идентификация клеток производилась морфологически в мазках, окрашенных по Романовскому —Гимзе.

При определении коагуляционной активности лейкозных клеток использовали следующие реактивы:

• Субстратную плазму, дефицитную по факторам XI и XII, получали из крови доноров [3], которую сохраняли при -20° С. Время ее свертывания при ре186

кальцификации составляло 119,05±5,22 с, а при активации внутренного пути гемокоагуляции каолином оно увеличивалось, а не уменьшалась, как в обычной плазме.

• Суспензия фосфолипидов из бобов сои АПТВ-реактив (НИИГиПК С.-Петербург) с активностью 43,8±0,8 с.
• 0,25 М раствор СаС1₂.
• Для исследования использовали суспензии лейкоцитов, содержащие от 0,5 до 75 х Ю⁹/л клеток, так как это количество находилось в пределах чувствительности метода.

В пробирке с внутренним диаметром 12 мм при температуре 37° С смешивали 0,1 мл суспензии фосфолипидов, 0,1 мл суспензии лейкоцитов, 0,2 мл 0,25 М СаС1₂. Приготовленную смесь инкубировали в течение одной минуты. Затем из автоматической пипетки добавляли 0,1 мл свежеразмороженной субстратной плазмы и одновременно включали секундомер. Регистрировали время появления сгустка. Экспрессию тканевого фактора клетками выражали количественно в единицах активности, используя калибровочную кривую разведений мозгового тканевого тромбопластина Кировского НИИГиПК (рис. 2).

 

Рис. 2. Калибровочный график. По оси ординат — активность тканевого фактора в единицах в логарифмической шкале. По оси абсцисс — время свертывания в секундах.

 

Всем обследованным больным далее была назначена программная полихимисф терапия «7+3», «5+2» в сочетании цитостатиков — рубомицина, цитозара, вепезида.

У здоровых добровольцев активность тканевого фактора в клетках периферической крови практически не проявлялась ( 0 — < 0,2 ед). У больных же хроническим миелолейкозом бластные клетки периферической крови характеризовались отчетливо выраженной способностью активировать внешний путь свертывания крови, которая составляла в среднем 0,65±0,08 ед. Значительно большей активностью обладали клетки । периферической крови у больных ост¹ рым миелобластным лейкозом: бластные клетки низкой плотности — 10,5 ед/10⁶ клеток, фракция высокоплотностных бластов — 0,67—2,19 ед/10⁶ клеток, фракция лимфоцитов — 2,14 ед/10⁶ клеток. Высокой гемокоагуляционной активностью (от 7,93 ед/10⁶ до 233,33 ед/10⁶ клеток) отличались у них и клетки пунктатов костного мозга.

В лекции на XVII конгрессе по тромбозам и гемостазу, посвященной памяти Ш.Джонсон, Y.Nemerson (1999) на основании иммунохимической идентификации сообщил, что около 2% моноцитов и гранулоцитов периферической крови человека несут тканевой фактор на своей поверхности. С этих клеток тканевой фактор может передаваться на тромбоциты и в тромб. Таким образом, ® ставится под сомнение господствовавший долгие годы взгляд, что тканевой фактор не экспрессируется в клетках, которые находятся в прямом контакте с циркулирующей кровью.

Наши данные, во-первых, подтверждают ранее описанную экспрессию тканевого фактора миелобластами у больных острым миелолейкозом, причем как в периферичесой крови, так и в пунктатах костного мозга. Во-вторых, наши данные показывают, что у больных хроническим миелолейкозом экспрессия ? активности тканевого фактора в незашифрованном виде, хотя и в значительно меньшем количестве (в 4—30 раз), осуществляется миелобластами как в периферической крови, так и в пунктатах костного мозга. На основании проведенных исследований нельзя сделать заключение о характере экспрессии тканевого фактора отдельными клетками — равномерна она или избирательна. Изучая суспензии клеточных фракций, мы получили усредненные данные об их гемокоагуляционной активности. Для решения этого вопроса необходимы иммуногистохимические исследования.

В целом, результаты свидетельствуют о несостоятельности концепции, утверждающей принципиальную невозможность образования тканевого фактора клетками крови. Таким образом, можно полагать, что развитие синдрома ДВС и кровоточивости под влиянием тканевого фактора, содержащегося в лейкоцитах, вероятно не только при остром миелобластном лейкозе, но и при хроническом миелолейкозе.

Поддержано грантами АНТ 03-5.5.1/99(ФП) и НИОКР 05-03/99(Ф)

About the authors

D. M. Zubairov

Казанский государственный медицинский университет; Республиканская клиническая больница М3 РТ

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

I. A. Andrushko

Казанский государственный медицинский университет; Республиканская клиническая больница М3 РТ

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

L. D. Zubairova

Казанский государственный медицинский университет; Республиканская клиническая больница М3 РТ

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

G. Yu. Svintenok

Казанский государственный медицинский университет; Республиканская клиническая больница М3 РТ

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

A. R. Akhmadeev

Казанский государственный медицинский университет; Республиканская клиническая больница М3 РТ

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

V. N. Grigoriev

Казанский государственный медицинский университет; Республиканская клиническая больница М3 РТ

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

Z. M. Nekhoroshkova

Казанский государственный медицинский университет; Республиканская клиническая больница М3 РТ

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

References

Supplementary files