Ultrasound and molecular genetic diagnostic methods for Rh-isoimmunized pregnancy

Full Text

Гемолитическая болезнь новорожденных (ГБН) в России диагностируется прибли­зительно у 0,6% из них [6]. Известны 19 ос­новных эритроцитарных групповых систем, объединяющих более 100 антигенов, а так­же многочисленные частные и общие с дру­гими тканями эритроцитарные антигены [9]. Как правило, эритроциты ребенка имеют не­которые отцовские антигены, отсутствую­щие у матери. Вместе с тем ГБН обычно раз­вивается вследствие несовместимости плода и матери по резус или АВО-антигенам, ред­ко — по другим антигенным системам (вви­ду их меньшей иммуногенности).

Bowman J. [10] пишет о том, что резус-изоиммунизация (Rh-ИИ) обычно возни­кает вследствие кровотечения, которое встречается в 75% беременностей. Если свое­временно не определяется резус-иммуниза­ция, гемолитическая болезнь плода (ГБП) может привести к ядерной желтухе или отеч­ной форме ГБП соответственно в 25% слу­чаев. Заменное переливание крови (ЗПК) но­ворожденным решило проблему ядерной желтухи. В настоящее время для прогнозиро­вания тяжелой ГБП есть следующие методы исследования: анамнез (предшествующее рождение детей с ГБП, гемотрансфузии не­совместимой крови), серологические иссле­дования — титр резус-антител в крови ма­тери, спектрофотометрия (СФМ) амниоти­ческой жидкости (АЖ), ультразвуковая (УЗ) оценка плода и плаценты, кордоцентез для определения фетального состояния плода. Rh и Kell состояние антигена может быть определено путем проведения молекулярно­генетической (ДНК) диагностики амниоти­ческих вод.

Н.Б. Горюшина [2], исследуя биофизи­ческий профиль плода у беременных с Rh-изосенсибилизацией, определила прогнос­тически неблагоприятными ареактивный нестрессовый тест, угнетение дыхательной и двигательной активности, снижение мы­шечного тонуса плода. Выраженность мно­говодия и утолщения плаценты коррелиро­вала с тяжестью ГБП и ГБН. Характерными морфологическими признаками плаценты при ГБП являются ее замедленное созрева­ние, отек и дистрофия структурных элемен­тов хориона. Надежным критерием наличия ГБП служит УЗ плацентометрия. В то же вре­мя нарушение структуры плаценты и, осо­бенно, ее преждевременная степень созре­вания считаются нехарактерными призна­ками при резус-конфликте.

J.G. Ouzouian, НА Monteriro, О.М. Alsulyman [20] ретроспективно проанализировали отчеты УЗИ беременных с Rh-ИИ. Были из­мерены BVOD (наружный межвентрикуляр­ный размер в диастоле) и значения процен­тили. У 63 плодов, у которых были определены данные критерии, Rh (анти D)-конфликт встретился в 66% случаев изоиммунизации: 20 (32%) новорожденным потребовалось ЗПК, 43 (68%)-нет. У 17 (27%) плодов BVOD был выше, чем 95-я процентиль (нор­мативные показатели), и 10 (59%) новорож­денным выполнено ЗПК. Новорожденные этой группы имели также значительно мень­шие гематокриты при рождении (37,7± 13,0% против 46±9%), и у них была проведена бо­лее продолжительная интенсивная терапия (10,7± 10,0 против 4,7±3,6 дня), чем у па­циентов, у которых BVOD был ниже, чем 95-я процентиль. BVOD, соответствующий 95-й процентили, имел чувствительность, равную 50%, специфичность — 84% и про­гностическое значение — 59%, в предсказа­нии необходимости новорожденному ЗПК. По заключению этих авторов, у беременных с изоиммунизацией BVOD, равный или выше 95-й процентили, связан с относи­тельно большей вероятностью анемии у но­ворожденного и ЗПК. Хотя данное измере­ние недостаточно чувствительно для использования в качестве единственного параметра в прогнозе ГБН, тем не менее оно может быть полезным как атравматичное дополнение при исследовании Rh-ИИ.

По данным Михайлова А.В. [3] и других авторов, анамнестические данные Rh-ИИ женщины и величины титра Rh-антител в ее крови не позволяют с достаточной веро­ятностью прогнозировать возможность раз­вития тяжелых форм ГБП при наступлении беременности. Однократное УЗ исследование дает возможность однозначно установить ди­агноз только при развитии отека у плода, хотя динамическое наблюдение за его со­стоянием с начала беременности имеет су­щественно большее значение. Возможность оценки косвенных (не всегда высокоспеци­фичных и чувствительных) УЗ признаков ГБП, нередко не соответствующих степени гемолитической анемии (ГА), не удовлетво­ряют современным клиническим требовани­ям. Исследования кровотока в фетоплацентарной системе при помощи допплеро­метрии не позволили выявить диагностичес­кие критерии оценки тяжести ГБП. По-ви­димому, изменения артериальной, венозной и внутрисердечной гемодинамики проявля­ются только при развитии отека плода, что свидетельствует о вторичности природы сер­дечно-сосудистой недостаточности при ГА.

Благодаря внедрению в клиническую практику в начале 60-х годов инвазивных методов получения околоплодных вод, по­явились новые диагностические возможно­сти, позволившие разработать тактику веде­ния изоиммунизированных беременных, применяемую в течение более 20 лет. Опре­деление оптической плотности АЖ при дли­не волны 450 нм (присутствие билирубина) существенно улучшило раннюю диагности­ку ГБП и соответственно снизило перина­тальную заболеваемость и смертность. Одна­ко последующие исследования показали высокий уровень ложноположительных и ложноотрицательных результатов этого ме­тода диагностики. Поданным Б.Г. Садыкова и др. [5], диагностическая ценность СФМ составила 81,8%. Прогресс был достигнут в результате широкого применения кордоцентеза под УЗ контролем в целях извлечения крови из вены пуповины и определения ге­матологических показателей плода. Исполь­зование кордоцентеза позволило непосред­ственно лечить плод путем внутриматочных переливаний донорской крови в сочетании с альбумином, что на сегодняшний день практически может решить проблему лече­ния тяжелых форм ГБП.

Depkes, R. Meerman, F. Vandenbussche [14] изучали взаимоотношение уровня гемо­глобина и размеров селезенки по УЗИ. У 28 изоиммунизированных беременных было произведено 85 последовательных кордоцентезов. Результаты показали взаимосвязь меж­ду периметром селезенки и недостатком фетального гемоглобина. УЗ обнаружение спленомегалии позволяет прогнозировать внутриутробную анемию плода при Нb ниже 5'SD от нормального значения в 44 (94%) из 47 случаев. Следовательно, изменение пе­риметра селезенки может быть вспомогатель­ным средством при УЗ эхоскопии у беремен­ных, изоиммунизированных по эритроци­тарным антигенам.

Mari, F. Rahman, P. Olofsson [17] опре­деляли фетальный гематокрит и пик систо­лической скорости в средней мозговой ар­терии при допплерометрии до и после внутриутробного переливания крови плоду с Rh-ИИ. Срок гестации составлял 27 не­дель. До ЗПК фетальный гематокрит варьи­ровал от 5,9 до 30%, во время процедуры кордоцентеза — от 24,8 до 53%. До процеду­ры систолическая скорость была равна 46,2± 10,7 см/с, во время нее — 31,7±9,5 сМ/с (Р<0,01). Таким образом, увеличение феталь­ного гематокрита значительно уменьшает пик систолической скорости в средней моз­говой артерии. Авторы считают, что доппле­рометрия может применяться для определе­ния фетальной анемии плода при Rh-ИИ.

Диагностический и терапевтический кордоцентез привел к небольшому уменьшению периферического сопротивления [7]. Значи­тельные разногласия наблюдались только в случаях с уровнем гематокрита меньше 20%, сравниваемых со значениями более 40%, или при гематокрите после переливания крови менее 30%. Авторы приходят к выводу, что уменьшение периферического сопротивле­ния может быть следствием увеличения в объеме крови и ее достаточной оксигенации, улучшающих фетальную перфузию. Они счи­тают, что эхография и допплерометрия не­информативны в клинических наблюдениях при Rh-ИИ.

Вторая проблема при Rh-ИИ, которую необходимо обсудить, — это определение при данной беременности резус-отрицательной — Rh (-) принадлежности плода при на­личии резус-антител от предшествующих беременностей или гемотрансфузий. И, на­конец, третья проблема — это недоношен­ность новорожденного в результате прежде­временного родоразрешения при Rh-ИИ беременности.

Е. Быкова, С. Гнедой, Л. Иванова [1], ис­ходя из своего опыта, пишут о том, что у 30% беременных с Rh (-) принадлежностью крови, имеющих антитела к Rh(D)-aHTHre-ну (изосенсибилизации, развившейся после предыдущих беременностей или несовмес­тимых гемотрансфузий), при последующей беременности рождаются дети с Rh(-) при­надлежностью крови. Всем таким беремен­ным проводят от 3 до 5 курсов неспецифи­ческой десенсибилизирующей терапии. При наличии изосенсибилизации наряду с кон­сервативной терапией осуществляют имму­нокоррекцию и неоднократно диагностические амниоцентезы, что может спровоцировать преждевременное прерывание бере­менности и усугубить иммуноконфликт. Кро­ме того, эти беременные, как правило, родоразрешаются на сроке 36—38 нед. Все это неблагоприятно отражается на течении беременности, а преждевременное ее пре­рывание — и на плоде.

Согласно результатам исследований Д.К. Нажмутдиновой [4], иммунологический конфликт при беременности встречается достаточно часто и считать, что данная проб­лема решена, — преждевременно. Это каса­ется прежде всего СДР, частота которого уве­личивается по мере утяжеления иммунного конфликта и ГБН. При беременности с Rh-ИИ в фетоплацентарном комплексе проис­ходят такие изменения, которые создают благоприятный фон для нарушения синтеза сурфактанта в альвеолоцитах II типа и ведут к недоразвитию респираторной системы пло­да в целом. Нарушение структуры плацен­ты, сопряжения окисления и фосфорили­рования в митохондриях клеток плаценты, снижение функции печени матери и плода, нарушение функционального состояния мо­нооксидазной системы печени плода, гипо­ксия плода при Rh-ИИ — все это усугубляет тяжесть ГБН и нарушает синтез легочного сурфактанта.

Как известно, 56% резус-положительных лиц гетерозиготны по Rh (D)-гену [23]. Ге­терозиготные отцы по Rh (D)-гену имеют шанс рождения Rh(-) ребенка у Rh(-) ма­тери в 50% случаев. Высокая вероятность рождения Rh(-) ребенка в подобных случа­ях делает необходимой пренатальную диагностику резус-принадлежности плода. Одним из наиболее часто используемых методов оп­ределения резус-статуса плода является из­мерение уровня билирубина в АЖ. Однако для исследования динамики изменения кон­центрации билирубина необходимы неод­нократные инвазивные процедуры.

Определение резус-принадлежности пло­да методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет снизить количество инва­зивных процедур. Для этого метода можно использовать практически любой биологи­ческий материал плода (ворсины хориона или плаценты, амниоциты, кровь из пуповины плода) на любых сроках беременнос­ти [22]. Группа генов, определяющих резусстатус, локализуется в хромосоме 1 (р34—р36) [12, 18]. Наиболее важный из них — Rh (D): он кодирует мембраноассоциированный D-антиген, который и определяет в основном резус-статус. Продукты другого гена, RhC/c/E — С/с и Е/е-белки, образующиеся в резуль­тате альтернативного слайсинга первичного транскрипта, оказывают значительно меньшее влияние на резус-статус [16]. Rh (D) ген отсутствует в хромосомах у Rh(-) субъек­тов [11].

О высокой чувствительности и специфич­ности методов ПЦР по определению Rh (D)-гена при использовании различных прайме­ров пишут}. Aubin J, С. Le Kim, I. Mouro [8], особенно экзона 10 (первый метод), экзона 7 (второй), экзона 4 (третий) и интрона 4 (чет­вертый). Обнаружение сигнала с D-положительными и D-отрицательными смесями возможно при содержании 0,001% D-поло­жительных клеток первым-третьим методами.

Crombach, F. Picard, М. Beckmann [13] установили надежность определения феталь­ного резус D-генотипа на амниоцитах с ис­пользованием сдвоенной ПЦР. Был изучен 41 образец амниотических вод у Rh-ИИ беременных. Генотип был правильно пред­сказан и подтвержден серологически. Авто­ры пришли к выводу, что определение фе­тального Rh D-генотипа по амниоцитам — безопасный метод, который улучшает прогноз в отношении ведения беремен­ных с Rh-ИИ.

Опыт работы по определению ДНК (эк­зона 10, интрона между экзонами 4 и 5) из 0,3—2,0 мл амниотических вод, полученных при амниоцентезе у Rh(-) женщин, был проанализирован Т.Н. Muller, I. Lammers, S. Gran [20]. Пренатальный генотип был успешно установлен приблизительно в 90% случаев (в 229 из 256) и подтвержден ре­зультатами серологического анализа у но­ворожденных.

Al. Mufti, С. Howard, Т. Overton [19] сооб­щают об обнаружении фетальной РНК в материнской крови при Rh-ИИ для опреде­ления Rh (D) плода. Они считают, что об­ратная транскриптазная полимеразная реак­ция (ТЦР) для определения фетальной РНК является более чувствительной и точной (Р=0,03), чем ПЦР из геномной ДНК в пре­натальном определении Rh (D) типа крови. Так, прогноз фетального Rh (D) типа крови при использовании ТЦР оказался точным в 28 из 35 случаев, а ПЦР — в 22 из 35. Rh(+) определен в первом случае в 12 из 19 на­блюдений, во втором — в 6 из 19.

Целью работы J. Yankowith, S. Li, С. Werner [24] была оценка точности метода опреде­ления фетального Rh С/с/Е состояния пу­тем постановки ПЦР на образцах, получен­ных от пациентов, у которых RhC/c/E состояние было установлено с помощью стандартных серологических методов. По за­ключению авторов, использование ПЦР по­могает для оценки Rh С/с/Е сенсибилиза­ции, но встречается несколько образцов антиген-положительных личностей, имею­щих отрицательный антиген. Дальнейшее изучение должно определить, отражает ли это полиморфизм, мутацию, ошибки кода или их комбинацию. Молекулярно-генети­ческие методы помогают в определении сен­сибилизации в 96% случаях.

Van-den-Veyver, К. Moise [25] рассмотре­ли все статьи, в которых было описано ис­пользование ПЦР для изучения Rh(D), опуб­ликованные в мире с 1991 по 1996 г. Полученные результаты сравнивали с дан­ными серологических исследований для определения чувствительности, специфич­ности, положительных и отрицательных про­гностических значений, основанных на ана­лизе ДНК. Всего было проанализировано 500 случаев, в которых были использованы че­тыре различных набора олигонуклеотидовпраймеров. Чувствительность и специфич­ность ПЦР достигала 98,7% и 100% соответственно, положительные и отрица­тельные прогностические значения — 100% и 96,9%. В пяти случаях Кb(D)-положительные плоды были неправильно диагностиро­ваны: два плода погибли, одному потребо­валось ЗПК, четвертому — фототерапия, о пятом плоде данных нет. Теоретическая мо­дель показала, что амниоцентез с ПЦР как основной метод для оценки фетального со­стояния плода приведет к четырехкратному сокращению числа перинатальных потерь по сравнению с таковыми при пункции пупо­вины (кордоцентезом) и серологических ис­следованиях.

Представленные данные литературы по­зволяют рассматривать определение резусстатуса плода путем молекулярно генетичес­кой диагностики (ДНК, РНК) как по крови матери, так и по околоплодным водам, по­лученным при амниоцентезе под контролем УЗИ, возможно, допплерометрии эффектив­ными прогностическими критериями Rh-ИИ. Они вполне сопоставимы с такими клас­сическими методами, как анамнез, серо­логические исследования, определение би­лирубина в околоплодных водах СФМ мето­дом. В зависимости от использования тех или иных методов диагностики может быть выб­рана соответствующая тактика лечения и определен срок родоразрешения.

About the authors

L. R. Abdrakhmanova

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

B. G. Sadykov

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

A. A. Zainullin

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

References

Supplementary files