Distribution of 5'-nucleotidase and thromboplastic activity in human tissues

Abstract

The distribution of 5-nucleotidase activity and thromboplastic activity in human tissues was studied. The greatest activity of 5-nucleotidase and tissue thromboplastin was found in the microsomal fraction. During homogenization, the activity of 5-nucleotidase and tissue thromboplastin was not separated. The membrane structures of the aortic endothelium have the highest 5-nucleotidase and thromboplastic activity compared to the membrane fraction of the middle layer of the aorta.

Full Text

Изучено распределение активности 5-нуклеотидазы и тромбопластической активности в тканях человека. Наибольшая активность 5-нуклеотидазы и тканевого тромбопластина установлена в микросомальной фракции. При гомогенизации активность 5-нуклеотидазы и тканевого тромбопластина не разделялась. Мембранные структуры эндотелия аорты обладают наибольшей 5-нуклеотидазной и тромбопластической активностью по сравнению с мембранной фракцией среднего слоя аорты.

Одним из основных применений диагностической энзимологии в настоящее время является измерение концентраций ферментов в сыворотке крови с целью обнаружения острого или хронического повреждения клеток. Определение активности сывороточной 5-нуклеотидазы широко используется для диагностики гепатобилиарных заболеваний [9, 10]. Экспериментально, и в клинических наблюдениях обнаружено значительное повышение активности 5-нуклеотидазы в плазме крови при остром инфаркте миокарда. При изучении динамики активности 5-нуклеотидазы в плазме крови было предположено, что фермент является индикатором поступления в кровоток из пораженного миокарда фрагментов клеточных мембран, обладающих тромбопластической активностью и вызывающих внутрисосудистое свертывание крови 12, 3, 

Для более полной клинической интерпретации этого ферментного теста необходимо учитывать количественное распределение фермента 5'-нуклеотидазы и тканевого тромбопластина в тканях организма и их локализацию в субклеточных структурах. В связи с этим в настоящем исследовании была поставлена задача изучить тканевое и внутриклеточное распределение 5'-нуклеотидазы и тканевого тромбопластина в организме человека.

Исследованы ткани 18 трупов внезапно умерших людей в возрасте от 17 до 40 лет. Время от момента смерти до взятия материала составляло от 10 до 24_ч. Ткани гомогенизировали на холоде в 10 объемах 0,25 М раствора сахарозы pH 7,4 в стеклянном гомогенизаторе Поттера—Эльвегейма с тефлоновым пестиком в течение 3 мин при 2000 об/мин. Ткани скелетной мышцы, миокарда, миометрия и печени предварительно пропускали через тканевой пресс [1].

В среду для размельчения ткани печени добавляли 0,001 М ЭДТА и гомогенизировали движениями тефлонового пестика рукой вверх—вниз 15 — 20 раз. Фракцию микросом получали ультрацентрифугированием постмитохондриальной надосадочной жидкости при 100 000g 10 мин в угловом роторе центрифуги ѴАК-60. Фракцию плазматических мембран клеток печени выделяли ультрацентрифугированием пост- ядерного супернатанта в ступенчатом градиенте плотности сахарозы в бакет-роторе центрифуги VАК-60 [12].

Активность 5'-нуклеотидазы определяли по Кемпбеллу (1962). О тромбопластической активности гомогената и субклеточных фракций судили по ускорению времени свертывания лиофилизированной бестромбоцитарной цитратной бычьей плазмы 14]. За единицу тромбопластической активности принимали активность тромбопластина Каунасского предприятия бакпрепаратов (серия 220381, 111, 1982 г.). Белок определяли методом Лоури с использованием бычьего альбумина в качестве -стандарта [11]. Удельную тромбопластическую активность выражали в единицах в расчете на 1 г белка. Результаты исследований статистически анализировали по Фишеру (1958).

5'-нуклеотидазная и тромбопластическая активность в тканях человека

		Удельная активность на г белка
Ткань	Фракция	тромбопластин	5'-нуклеотидаза, нкат ед.
1	2	3	4
Головной	1	86,7±10,4	91,3±9,0
мозг (белое вещество) .	2	106,0±9,8	379,6±32,8
	3	185,3±16,6	96,3±13,9
Предстательная железа	1	75,6±23,3	917,7±203,3
	2	125.9±19,2	1839,3±236,9
	3	16,7±2,9	1136,7±221,4
Легкое	1	34,9±6,2	100,4± 16,7
	2	77,7±9,4	467,7±67,2
	3	5,6±0,9	38,7±6,2
Щитовидная	1	24,7±6,4	120,6±12,5
железа	2	72,8±1 1.7	573,6±60,0
	3	3,8±0,8	75,7±9,3
Сердце	1	44,0±4,0	51,7±4,4
(миокард)	2	60,3±12,5	174,1 ±22,0
	3	9,8±1,5	33,6±3,8
Надпочечник	1	22,2±2,2	104,0±7,2
(мозговое вещество)	2	37,7±4,1	268,4±35,3
Аорта (интима)	3	10,0±1,3	98,5±15,9
	1	11,7±1,3	238,0±26,1
	2	37,1 ±6,0	796,0±90,5
	3	2,1 ±0,9	158,0±20,3

1	2	3	4
Почка (корковое вещество)	1	15,4±0,9	46,5±5,1
	2	26,5±3,2	167,4±12,3
	3	3,2±0,7	12,8±4,1
Селезенка	1	12,5±0,5	88,7±13,8
	2	20,1 ±0,9	477,4±68,0
	3	7,6± 1,5	42,6±5,8
Печень	1	0,56±0,04	103,5±11,2
	4	2,8±0,07	119,6±10,6
	5	3,8±0,2	182,5±13,5
	6	12,2±0,9	451,9±9,9
Матка (миометрий)	1	11.4±2,2	309,0±47,1
	2	35,6-1-2,0	550,2±52,6
	3	5,7±1,6	294,0± 15,0
Мышца (скелетная)	1	7,2±1,4	26,6±3,3
	2	10,2±0,9	71,0±11,3
	3	5,3±0,7	7,8±3,3
Поджелудочная железа	1	0,97±0,23	117,3±9,6
	2	0,54±0,3	232,6±22,7
	3	7,7±1,5	217,0±14,7

Примечание. 1 — цельный гомогенат, 2 — фракция микросом, 3 — супернатант, 4 — фракция митохондрий, 5 — фракция лизосом, 6 — фракция плазматических мембран.

В таблице представлено распределение удельной активности 5'-нуклеотидазы и удельной тромбопластической активности в субклеточных фракциях органов человека. Как видно из полученных данных, во всех тканях наибольшая активность 5'-нуклеотидазы и тканевого тромбопластина обнаружена в микросомальной фракции, -содержащей плазматические и эндоплазматические мембраны. По удельной активности 5'-нуклеотидазы в микросомальной фракции ткани можно расположить следующим образом: скелетная мышца < почка < сердце < поджелудочная железа < надпочечник < головной мозг < печень < легкие < селезенка < матка < щитовидная железа < эндотелий аорты < предстательная железа. Порядок возрастания удельной тромбопластической активности следующий: поджелудочная железа < скелетная мышца < печень < селезенка < почка < эндотелий аорты < надпочечник < матка < сердце < щитовидная железа < легкие Уголовной мозг < предстательная железа.

Как известно, фермент может служить маркером, если он прочно связан с определенными субклеточными структурами [6]. Для оценки прочности связи 5'-нуклеотидазы с мембранами эндотелиальных клеток аорты человека были проведены механическая дезинтеграция ткани, фракционирование и фильтрация гомогената через мембранный фильтр Синпор-8 (ЧССР) с размером пор 0,25 мкм. Обнаружено, что 5'-нуклеотидазная и тромбопластическая активность задерживаются фильтром. Ультрафильтрат был полностью лишен активности 5⁷-нуклеотидазы и тромбопластической активности.

Активность 5'-нуклеотидазы и тромбопластическая активность в тканях аорты человека локализованы главным образом в мембранной фракции эндотелиальных клеток интимы. Осадок на фильтре, состоящий из фрагментов мембран эндотелия размером более 0,25 мкм, не осевших после 30-минутного центрифугирования при 100 000 g, обладал наибольшей удельной активностью 5'-нуклеотидазы (851±45 нкат/г белка) и удельной тромбопластической активностью (61,0 ± 4,5 ед./г белка).

Удельная активность 5'-нуклеотидазы и удельная тромбопластическая активность подобного осадка, полученного при ультрафильтрации супернатанта среднего слоя аорты, составили соответственно 68,7% и 54% активности осадка мембран эндотелия.

Предстательная железа резко отличается от других органов высокой активностью 5'-нуклеотидазы как в гомогенате (917 нкат/г белка), так и в микросомной фракции (1839 нкат/г белка). Активность б'-нуклеотидазы в супернатанте предстательной железы остается высокой (1136,7 нкат/г белка), тогда как в других органах активность фермента в супернатанте не превышает 300 нкат/г белка.

Наибольшая тромбопластическая активность тканей отмечена в гомогенате головного мозга (86 ед./г белка), пос ереди микросомных фракций наиболее активная получена из ткани предстательной железы. Увеличение 5'-нуклеотидазной активности фракции микросом по сравнению с гомогенатом наблюдалось во всех органах, как и увеличение тромбопластической активности.

Осколки мембран, обладающие тромбопластической активностью, образуются при разрушении не только плазматической, но и любой другой клеточной мембраны. Фермент 5'-нуклеотидаза, вмонтированный в плазматическую мембрану клетки, невозможно отделить от тромбопластической активности даже при жесткой гомогенизации. Этот факт говорит о том, что осколки плазматической мембраны, попадающие в кровоток при повреждении клетки, могут проявлять тромбопластическую активность. Исключение составляет лишь ткань предстательной железы, где, кроме мембраносвязанной 5'-нуклеотидазы, имеется и растворимая форма фермента.

Таким образом, повышение активности 5'-нуклеотидазы в плазме крови является надежным признаком поступления в кровоток тромбопластически активных плазматических мембран

Выводы

1.   Активность 5'-нуклеотидазы и тромбопластическая активность локализованы в мембранных структурах клеток тканей человека.

2.   Активность 5'-нуклеотидазы и тромбопластическая активность не разделяются даже при жесткой гомогенизации.

3.   Фермент 5'-нуклеотидаза может служить маркером тромбопластической активности при определении в плазме крови.

4.   В тканях аорты человека наибольшая активность 5'-нуклеотидазы и тромбопластическая активность локализованы в мембранных  структурах эндотелиальных клеток.