Experiments on the cultivation of the typhoid virus

Abstract

Starting experiments on cultivation of typhoid virus on nonpathogenic microorganisms, we settled on yeasts of Saccharomyces cerevisiae-race: M and II species (the yeasts used by Zilber, Vostroukhova and Dosser for cultivation of smallpox vaccine and typhoid virus were not yet known to us). H. Oettinger PH 7.6 broth and the same broth with 1% glucose added were used as nutrient media; otherwise, we adhered to the methodology proposed by Silber and Dosser.

Full Text

(Сообщение 1).

Вопрос о возможности выращивания фильтрующихся вирусов in vitro на непатогенных микроорганизмах в отношении вируса оспенной вакцины разрешен Зильбером и Востроуховойи вируса сыпного тифа—Зильбером и Доссер, Калиной и Данишевской.

При ознакомлении с предварительным сообщением Зильбера и Доссер в методе культивирования сыпнотифозного вируса на дрожжевых клетках, методе чрезвычайно простом, нам казались весьма заманчивыми те перспективы практического применения, которые открывались при возможности выращивания этого вируса in vitro в большом ряде генераций.

Приступая к опытам культивирования сыпнотифозного вируса на непатогенных микроорганизмах, мы остановились на дрожжах вида Saccharomyces cerevisiae—расы: М и II вид (дрожжей, примененных Зильбером, Востроуховой и Доссер для выращивания оспенной вакцины и сыпнотифозного вируса нам не был еще известен). В качестве питательной среды были взяты бульон по Г. Оттингеру PH 7,6 и такой же бульон с прибавлением 1% глюкозы; в остальном мы придерживались методики, предложенной Зильбером и Доссер. Кровь сыпнотифозного больного в количестве 0,2—0,3 к. с. добавлялась к молодой, обычно 3—4-часовой к-ре дрожжей и затем выращивание происходило при 36°— 37° в течение 8 суток В дальнейшем производились пересевы 0,5 к. с. взболтанной к-ры на свежий бульон (10,0 к. с.). Дрожжи развивались, образуя осадок на дне, бульон не мутился, при взбалтывании дрожжи равномерно распределялись в жидкости в виде мелких и нежных хлопьев, быстро оседавших на дно. В к-рах на бульоне с 1% глюкозы осадок, состоявший из дрожжей, во много раз превышал по своему объему осадок, получавшийся на простом бульоне, и при взбалтывании жидкость оказывалась совершенно мутной.

Первый посев крови от больного сыпным тифом (10-й день болезни) был произведен 23 мая 1933 г. на вышеуказанные питательные среды с дрожжами Saccharomyces cerevisiae раса М. Одновременно же для контроля был сделан посев 0,3 к. с. крови на бульон (10,0 к. с.) без предварительного засева дрожжей. 2 к. с. одной из 8-ми суточных к-р первой генерации этого штамма на среде с глюкозой была заражена подкожно мор. свинка и одновременно таким же количеством контрольного посева—другая мор. свинка. На 10-й день после заражения у первой м. свинки температура поднялась с 38,2° до 41,1°, на следующий день t° 40,9°, затем пала критически несколько ниже нормы (37°); у второй м. свинки (контр.) на 10 й день после введения бульона с добавленной кровью t° 39,4° (накануне t°—39), на следующ. день t°—39,2°. Таким образом большой подъем t°, правда только в течение двух дней, у м. свинки, зараженной к-рой и крайне незначительный подъем t°, в пределах обычных колебаний, у контрольной м. свинки, дали основание предположить, что, повидимому, вирус в к-ре дрожжей в противоположность вирусу на одном бульоне сохранился, хотя и претерпел какие-то изменения, так как продолжительность лихорадки была незначительной. Конечно, здесь играли роль новые условия среды для вируса и возможность не только сохранения, но и развития вируса на дрожжевых клетках должны были показать опыты на животных с к-рами дальнейшего ряда генераций.

Ободренные этими, хотя и незначительными успехами, мы предприняли в дальнейшем ряд новых посевов крови от различных больных сыпным тифом. Следующий посев крови (II штамм) от больного сыпным тифом (9-й день болезни) был произведен на такие же среды с молодыми к-рами дрожжей Saccharomyces cerevisiae, расы М и II. В последующих опытах в связи с тем, что нам стала известной подробная методика выращивания сыпнотифозного вируса на дрожжах, предложенная Зильбером и Доссер, нами были предприняты опыты выращивания этого вируса и на кефирных дрожжах, при чем для сравнительного изучения ценности различных питательных сред и различного рода дрожжей, нами были взяты кроме бульона по Готтингеру и мясопептонного бульона pH 7,2, мясопептонный бульон pH 7,6, бульон с 0,5% лактозы и дрожжи: кефирные и вышеупомянутые расы М и Н вида Saccharom. cerev. Всего было произведено еще 3 посева от больных: на 14 день бол. (шт. III), на 14-й же день бол. (шт. IV) и на 9-й день бол. (шт V). В настоящем сообщении мы коснемся лишь результатов наблюдений, полученных при изучении к-p 1и II штаммов, а данные наблюдений над культурами ПК IV и V штаммов будут изложены во 2-ом сообщении.

Для характеристики культур сыпнотифозного вируса на дрожжах были заражены этими культурами м. свинки с целью изучения колебаний t°, кролики для выявления р. Weil-Felix’a, a для подтверждения специфичности лихорадки у м. св., появляющейся под влиянием заражения культурами, были предприняты прививки крови и мозга таких м. св. свежим м. свинкам и мозга кроликам для получения агглютининов в отношении бац. Proteus X₁₉.

Кроме того м. св., зараженные к рами, мозгом и кровью, в дальнейшем были испытаны на наличие активного иммунитета путем прививки пассажного вируса и, наконец, мозги зараженных м. св. были подвергнуты патолого-гистотогическому исследованию. Заражение морских свинок 8-суточными к-рами производилось подкожно в количестве 2 к. с., кролики заражались к-рами интравенозно, сначала в количестве 1 к. с_и а затем мы перешли на заражение 5 к. с. Мозг м. св. удалялся стерильно и готовилась взвесь в физиологическом растворе NaCl в отношении: на целый мозг 15 к. с. физиол. раств. NaCl. Взвесь мозга вводилась м. св. интраперитонеально в количестве 1 к. с., а кроликам в том же количестве интравенозно.

Заражение м. св. было произведено к-рами 1 штамма 16-й генерации и II шт. 15-й генерац. и одной культурой (на дрожжах р. М) в 24 й генерации. Повышение t° обычно отмечалось на 17-й день после заражения (в одном случае при зараж. к-рой II шт. 24 генерац. на 12-й день) в пределах от 0,8° до 2°; продолжительность лихорадки от 4 до 6 суток (чаще 6 суток). Во всех случаях заражения наблюдалось падение веса животных.

Температурные кривые мор. свин., зараженных к-рами.

Св. № 142. Зараж. к-рой 53 (I шт.) 16-ой генер.

Cв. № 200. Зараж. к-рой 52 (I шт.) 16-ой генер.

Cв. № 141. Зараж. к-рой 78 (II шт.) 15-ой генер.

Cв. № 113. Зараж. к-рой 79 (II шт.) 15-ой генер.

Cв. № 165. Зараж. к-рой 80 (II шт.) 15-ой генер.

Cв. № 204. Зараж. к-рой 81 (II шт.) 15-ой генер.

Cв. № 358. Зараж. к-рой 123 (II шт.) 24-ой генер.

Контрольные животные, зараженные подкожно 2 к.с. 8-суточной дрожжей или не вызывали вовсе изменений температурной кривой, или же в некоторых случаях давали подъем t°, доходящий до 39,6° с размахом колебаний t° в 1°—2% но в таких случаях это повышение t°, как реакция организма на введенные дрожжи, появлялось, как правило, на 2—3 день после введения к-ры и длилось обычно не более 1—3 дней.

При рассмотрении температурных кривых м. св., зараженных к-рами вируса, необходимо отметить некоторую атипичность этих кривых, несколько укороченную продолжительность лихорадки и длительный инкубационный период, за исключением одного случая, когда, вместо обычных 16 суток, мы имели 11 суток. Сопоставляя эти данные в отношении продолжительности лихорадки с данными, полученными в опыте заражения к-рой 1-й генер. можно сделать вывод, что вирус не только сохраняется, но, приспособившись к новым условиям существования, начинает развиваться и наблюдения над к-рой II шт. 24 генер. подтверждают это предположение, так как в этом случае инкубационный период оказался менее длительным, чем в опыте с к-рами 15 генерации.

Теперь мы перейдем к рассмотрению опытов заражения м. св. кровью и мозгами м. св., зараженных к-рами вируса. Кровь добывалась при пункции сердца, дефибринировалась и вводилась интраперитонеально в количестве 1,0 —1,5 к. с.

У мор. свин., зараженных кровью или мозгом (2-й пассаж), повышение t° отмечалось на 11—18 день после заражения и только в одном случае на 24-й день (кровь взята на 2 й день повышения t°) в пределах от 0,8 до 1,5°, продолжительность лихорадки 7—15 суток (чаще 8 суток). Падение веса тела свинок отмечалось во всех случаях заражения.

Температурные кривые мор. свин., зараженных кровью и мозг.
(2-ой пассаж).

Cв. № 263. Зараж. кровью м. св. №142.

Cв. № 326. Зараж. мозгом м. св. №141.

Cв. № 347. Зараж. кровью м. св. №165.

Cв. № 318. Зараж. мозгом м. св. №204.

Cв. № 374. Зараж. мозгом м. св. №204.

Эти опыты показывают нам, что культуральный вирус возможно пассировать, при чем инкубационный период иногда несколько сокращается и продолжительность лихорадки увеличивается. Специфичность лихорадки находит себе подтверждение в нижеприводимых опытах заражения мозгом некоторых свинок кроликов, которые дали при этом положительную реакцию Weil-Felix’а с титром до 1: 50.

Опыты на кроликах.

Для доказательства наличия сыпнотифозного вируса в наших к-рах нами был заражен ряд кроликов, у которых, как известно, эта инфекция протекает в скрытом виде, но при этом появляется положительная реакция Weil-Felix’a обычно с титром 1:40 или 1:60 и лишь в редких случаях с более высоким титром.

Заражение производилось как культурами, так и мозгом мор. свинок, зараженных к-рами. Кроме того для контроля кроликам были введены интравенозно чистые 8-суточные к-ры дрожжей.

Первоначальные опыты заражения 1 к. с. к-p не дало положительных результатов: появление слабой положительной реакции (+) при разведении сыворотки 1:10 с „О" формой proteus Х₁₉ у кролика № 13 не убедительно, так как в такой же степени была получена реакция и у контрольного кролика, которому были введены одни дрожжи.

При заражении же к-рами в количестве 5 куб. см. мы получили на 15 день слабоположительную реакцию с формой OX₁₉ при разведении сыворотки 1:5 и 1:10, в дальнейшем отмечалось нарастание титра ина 35-й день можно было определить положительную реакцию Weil-Fe- lix’a, как с формами ОХ₁₉, так и НХ₁₉ при разведении сывороток 1:20 и 1:50, при чем более резко выраженной по своей интенсивности оказались реакции с формой ОХ₁₉.

У контрольного кролика появилась слабоположительная реакция (+), но при разведениях сыворотки, не превышающих 1:10.

При интравенозном заражении кроликов 1 к. с. взвеси мозга (1:15) морских свинок, зараженных к-рами вируса, можно было также отметить появление положительной реакции Weil-Felix’a и дальнейшее нарастание титра к 35 дню.

Результаты всех этих опытов приведены в таблице (см. стр. 1174-1175).

Кролик № 216 был заражен взвесью мозга морской свинки, зараженной пассажным вирусом (3-й пассаж), полученным нами при заражении м. св. кровью сыпнотифозного больного. В этом случае сыворотка кролика дала положительную реакцию Weil-Felix’a на 15 й день при разведении 1: 20 и дальнейшее нарастание титра, при чем на 35-й день р. оказалась положительной при разведении 1:100.

Таким образом, на основании полученных результатов опытов заражения кроликов, мы можем сказать, что в наших к-рах действительно содержится сыпнотифозный вирус и что повышение t° у морских свинок, зараженных этими к-рами, также вызвано сыпнотифозным вирусом, т. е. лихорадка является специфической.

Кроме всех приведенных доказательств в пользу специфичности вируса наших культур, нами были еще поставлены опыты, имевшие целью выяснить состояние активного иммунитета у мор. свинок, зараженных этими к-рами.

Появление иммунитета после первого заражения вирусом сыпного тифа, т. е. когда повторное заражение не вызывает инфекции, как известно, может служить доказательством в пользу специфичности инфекции, вызванной первым заражением, Weil и Breinl, Singer считают, что м. св., перенесшие сыпной тиф любой тяжести, в том числе в виде стертых и бессимптомных форм, приобретают иммунитет к повторному заражению их сыпнотифозным вирусом, при чем эта невосприимчивость может продолжаться до 1-го года. Однако ряд авторов: Nicolle, Conseil, Conor, Гамалея, В. Барыкин, Компанеец, Захаров и О. Барыкина указывают на то, что стойкий и длительный иммунитет приобретается у мор. свинок лишь в результате перенесения типичной формы инфекции, при заражении же вирусом в недостаточной дозе, животные или совсем не обнаруживают сопротивляемости к повторной инфекции или проявляют очень слабую сопротивляемость.

В наших опытах повторному заражению пассажным вирусом были подвергнуты м. св., зараженные культурами, мозгом м. св., зараженных к-рами (2-й пассаж) и зараженные кровью сыпнотифозных больных. Повторное заражение вирусом производилось па 5—6 й неделе после перенесения инфекции, при чем пассажный вирус применялся 4, 5 и 6-го пассажей, когда он при заражении 1 к.с. взвеси мозга (1:15), взятого на 3—1 день лихорадки, будучи введен интраперитонеально, вызывал всегда появление лихорадки на 6—7 день. Во всех этих опытах повторного заражения появлялась лихорадка, в том числе и у м. св., зараженных кровью сыпнотифозного больного. Необходимо отметить все же, что по сравнению с контрольным заражением м. св. ранее не инфецированных, иногда срок инкубации увеличивался на 2—3 дня, в течении лихорадки иногда наблюдались глубокие ремиссии, доходящие до нормальной, для данной свинки, температуры.

Таким образом, данные этих опытов не могут служить звеном в цепи доказательств специфичности вируса.

Может быть опыты повторного заражения дали бы иные результаты, если их провести с кровью сыпнотифозных больных, так как пассажный вирус, приспособившись к организму м. св., приобретает высокую степень вирулентности по мере пассирования и становится своего рода virus’oм fixe для мор. свинки, и в таком случае в ситу различия свойств исходного и пассажного вирусов, даже в значительной степени выраженная сопротивляемость после перенесения инфекции, вызванной культуральным вирусом или кровяным вирусом человека, будет сломлена при применении такого пассажного вируса.

Патолого-гистологическое исследование мозгов ряда морских свинок, зараженных к-рами сыпнотифозного вируса, кровью больных сыпным тифом и пассажным вирусом, еще не закончено. Из имеющихся 4-х протоколов ¹) приводим следующие.

М. св. № 204 (заражена подкожно 2 к. с. к-ры II шт. 15 генер., инкубация 16 дней, уб. на 2-й день лихорадки).

1) Набухание и местами небольшое размножение эндотелия кровеносных сосудов.

2) Кровоизлияние вокруг мелких сосудов и местами в паренхиме.

3) Отдельные гранулемы, выраженные в средней степени.

4) Нейронофагия.

5) Инфильтрация Клеточн. элементами мягкой мозговой оболочки.

М. св. № 215 (заражена интраперитонеально 4 к.с. дефибринир. крови б-го сыпным тифом, инкубация 6 дней, уб. на 3-й день лихорадки).

1) Пассивная гиперемия сосудов мозга.

2) Местные кровоизлияния вокруг сосудов.

3) Выражена нейронофагия.

4) Набухание и разрастание эндотелия сосудов очень слабое.

Таким образом и данные патолого-гистологического исследования мозга м. св., зараженной к-рой сыпнотифозного вируса, подтверждают специфичность лихорадки и убеждают нас в том, что в к-рах с дрожжами выращивается, несомненно, вирус сыпного тифа.

Интересным является сопоставление изменений в мозгу м. св. № 204, вызванных к-рой, и в мозгу мор. свинки № 215, зараженной кровью б-го сыпным тифом. Специфические изменения, вызванные при заражении к-рой, выражены даже гораздо резче, нежели те же изменения у м. св., зараженной кровью б го, несмотря на то, что в последнем случае кровь была введена в количестве в 2 раза превышающем количество к-ры и при том интраперитонеально.

Таким образом, на основании всех вышеприведенных опытов, возможность выращивания сыпнотифозного вируса на дрожжевых клетках, доказанная Зильбером, Доссер, Калиной и Данишевской, подтверждают и наши исследования.

Выводы.

1. Выращивание сыпнотифозного вируса из крови больного сыпным тифом человека в к-рах с дрожжами Saccharomyces cerevisiae в большом ряде генераций возможно.
2. К ры этого вируса при заражении м. св- вызывают появление лихорадки, сопровождающейся падением веса; мозг таких морских свинок, будучи введен интравенозно кроликам, обусловливает образование агглютининов в отношении О и Н форм proteus Х₁₉; перевивкой мозга и крови таких м. св. возможно пассировать этот вирус.
3. Заражение кроликов к-рами приводит к образованию агглютининов в отношении О и Н форм proteus Х₁₉.
4. Патолого-гистологическое исследование мозга м. св., зараженной; к-рой сыпнотифозного вируса, соответствуют тем изменениям, которые наблюдаются при заражении м. св. кровью сыпнотифозного б-го или пассажным вирусом.
5. Укороченный период лихорадки, атипичность ее, сравнительно медленное нарастание титра сывороток в отношении р. WeilFelix’a, повидимому, указывают на некоторое ослабление вируса при выращивании его на примененных нами дрожжах.

Дальнейшие наблюдения по выращиванию сыпнотифозного вируса, опыты вакцинации и применения полученной нами сыворотки послужат предметом следующего сообщения.