Effect of dimephosphone on the dynamics of intracellular calcium

Full Text

Внутриклеточный ионизированный кальций ([Ca²⁺]i) — ВКИК — является универсальным вторичным посредником. Физиологическим сигналом, приводящим к повышению его уровня, может быть действие гормонов, медиаторов, трофических агентов и других факторов. Изменение его уровня может лежать в основе механизма действия ряда лекарственных средств. Однако до настоящего времени известность получили лишь антагонисты кальция, ингибирующие поступление в клетку внеклеточного ВКИК. В конце 80-х годов были предложены современные методы регистрации ВКИК с помощью высокочувствительных нетоксичных внутриклеточных красителей, меняющих флюоресцентный сигнал при повышении концентрации ионизированного кальция в клетке. Это открыло новые возможности для углубленного изучения механизма влияния лекарственных средств на динамику внутриклеточного кальция.

При изучении механизма действия димефосфона — препарата с широким спектром показаний к применению в медицинской практике - установлено, что некоторые его эффекты связаны с подавлением кальцийзависимых процессов клеточной активации. Показана антиагрегационная активность димефосфона на фоне действия тромбоцитарных индукторов, в том числе ионофора А23187, который увеличивает внутриклеточную концентрацию кальция. Отмечен и противоположный по своему физиологическому значению эффект димефосфона: подавление выработки факторов с антиагрегационной активностью клетками эндотелия. Кроме того, угнетается влияние его на продукцию HCL париетальными клетками желудка вследствие торможения кальцийзависимого выделения эндогенного гистамина из энтерохромаффиноподобных клеток.

Целью настоящего исследования было изучение влияния димефосфона на уровень ВКИК в хромафинных клетках надпочечников крысы.

Оценены эффекты двух концентраций димефосфона — 0,25 и 250 мМ. Расчеты показали, что содержание препарата в организме, сопоставимое с указанными концентрациями, возможно при применении его в дозе 50 мг/кг (0,25 мМ) и местно в виде 5% раствора (250 мМ). Эксперименты были проведены на установке, оснащенной конфокальным лазерным микроскопом (Molecular Dynamics, США). Клетки надпочечников выделяли у взрослых крыс, помещали в стерильную питательную среду в чашки Петри, покрытые полилизином, и выдерживали в течение суток в инкубаторе (95%О₂ и 5% СО₂). В качестве индикатора В КИК использовали вещество Fluo-З в концентрации 4 мкМ. Регистрацию ВКИК- сигнала вели в конфигурации “целая клетка” с частотой опроса 3с^-1. Анализ видеоизображения проводили с помощью специализированного пакета компьютерных программ. Исследуемые вещества апплицировали на хромаффинные клетки из микропипетки с расстояния 15 мкМ путем резкого повышения давления. Флюоресцентный сигнал количественно выражали в виде параметра _ΔF/F₀ (разница показателей сигнала до и после воздействия, деленная на величину базовой флюоресценции).

Результаты исследований показали, что под влиянием димефосфона в концентрации 0,25 мМ в течение 10 с происходило незначительное повышение концентрации ВКИК в хромаффинных клетках (n=6). Эффект резко усиливался при использовании вещества в концентрации 250 мМ, причем выявлялись две фазы повышения: ранняя, быстро спадавшая, и поздняя, более устойчивая. Такой двухфазный эффект наблюдался во всех исследованных клетках (n=8). На фоне медленной фазы действия димефосфона хромаффинные клетки переставали реагировать на аппликацию АТФ (100 микроМ), вызывающей в контроле ВКИК-сигнал.

Увеличение концентрации ВКИК под влиянием димефосфона могло быть связано как с повышением проницаемости клеточной мембраны к этим ионам, так и с мобилизацией их из внутриклеточных депо. Для решения этого вопроса проводили эксперименты с устранением кальция в среде инкубации хромаффинных клеток. Эта процедура полностью предупреждает повышение концентрации ВКИК в исследуемых клетках, вызванное КСI (200 мМ), но не влияет на параметры ВКИК-сигналов, индуцированных кофеином. Димефосфон (0,25 и 250 мМ) в бескальциевой среде так же, как и кофеин, повышал уровень кальция в клетке, что свидетельствовало о способности димефосфона освобождать ВКИК из внутриклеточных депо.

Таким образом, с использованием прямого метода регистрации динамики свободного Са²⁺ во  внутриклеточной среде нами обнаружен новый механизм действия димефосфона на ключевые физиологические процессы, происходящие в клетке. Димефосфон в секундном диапазоне времени способен мобилизовать ВКИК из внутриклеточных депо, аналогично кофеину, активирующему рианодиновые рецепторы. Особенностью действия димефосфона является наличие медленной фазы освобождения ВКИК, которая отчетливо обнаруживается при действии более высокой концентрации препарата.

На основании наших экспериментов можно предположить, что быстрое высвобождение ВКИК должно сопровождаться кратковременным усилением активности клеток, тогда как медленная фаза может вызвать известный феномен Са²⁺- зависимой инактивации мембранных рецепторов и каналов. Такая ингибирующая роль внутриклеточного Са²⁺ была описана ранее в отношении рецепторов ацетилхолина. Именно внутриклеточным ингибирующим действием ВКИК объясняется, по-видимому, устранение чувствительности клеток к внеклеточной АТФ и другим индукторам клеточной активности.

About the authors

R. A. Giniatullin

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan

R. R. Giniatullina

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan

E. M. Sokolova

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan

R. S. Garaev

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan

A. O. Vizel

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan

References

Supplementary files