Стандартизация диагностикумов и условий проведения теста АПТВ

Полный текст

Для распознавания многих коагуляционных дефектов необходима постановка двух основополагающих тестов: определения активности противотром-бинового комплекса (по Квику с полным тромбопластином) и активированного парциального (частичного) тромбопластинового времени (АПТВ, АЧТВ). При наличии отклонений в результатах, полученных этими методами, можно воспользоваться дополнительной схемой обследования, которая при сопоставлении с клиническими проявлениями заболевания и анамнезом помогает выбрать необходимые тесты и уточнить диагноз [15].

Основанный на измерении времени свертывания стабилизированной плазмыпосле ее рекальцификации тест АПТВ имеет неоспоримые преимущества: стандартизацию по фосфолипидному составу и контактной активации. В таких условиях образование сгустка в тест-системе зависит лишь от активности протромбина, факторов, принимающих участие во “внутреннем” пути свертывания, и концентрации фибриногена. Тест широко используется как скрининговый при оценке нарушений коагуляции в первой фазе, то есть при диагностике гемофилий и болезни Виллебранда. На его основе разработаны одностадийные методы определения активности факторов VIII (VIII:K) и IX (IХ:К) [7]. Поскольку тест чувствителен к гепарину, с его помощью проводят контроль гепаринотерапии. Во многих странах он широко применяется как обязательный при госпитализации больных и перед хирургическими вмешательствами наряду с определением активности протромбинового комплекса, времени свертывания крови и количества тромбоцитов [18, 25, 33].

Необходимость осуществления внешнего контроля качества диагности-кумов для исследования гемостаза, в том числе теста АПТВ, не нуждается в обсуждении. Несмотря на длительное и широкое использование его за рубежом, вопросы стандартизации до сих пор не решены, что связано с разнообразием методов и реагентов. Основным биологическим диагностикумом, применяемым в методе АПТВ, является фосфолипидный экстракт (ФЭ), иначе называемый парциальным (частичным) тромбопластином, кефалин — заменитель фактора 3 тромбоцитов. Существующее разнообразие фосфолипидных компонентов, изготовленных из разных источников сырья, обладающих различной активностью, стабильностью, а также чувствительностью к нарушениям коагуляционного гемостаза, затрудняет стандартизацию методов АПТВ и получение сравнимых результатов [10, 11, 22]. Коммерческие или лабораторные ФЭ, применяемые в тесте АПТВ, отличаются по способности выявлять коагуляционные дефекты или присутствие ингибиторов свертывания [29]. Совершенно очевидно, что реагенты, дающие в тест-системе АПТВ объективные результаты при выявлении нарушений “внутреннего” механизма коагуляции (у больных гемофилией), могут быть неприемлемы при контроле гепаринотерапии [21].

Различие их чувствительности объясняется рядом причин, наиболее важной из которых является источник фосфолипидов: кадаверное сырье, материал животного или растительного происхождения [8]. В практике клинических лабораторий широко применяются реагенты, изготовленные из серого вещества кадаверного мозга [11, 34]. Как сырье используются также головной мозг животных (фирма “Organon teknika”), ткань плаценты [20], эритроциты крови доноров [1, 2], продукты растительного происхождения, в частности бобы сои [8, 9].

Чувствительность ФЭ к определен-ним нарушениям в системе коагуляции зависит не только от источника получения, но и от их физико-химических свойств [31]. Однако этот аспект проблемы разработан недостаточно; мало известно об оценке физико-химических свойств фосфолипидов, обладающих высокой прокоагулянтной активностью [9]. Важным требованием к ФЭ является также стабильность. Поэтому необходим не только подбор сырья [8], но и лиофилизация продукта [11].

Наиболее чувствительными к нарушениям “внутреннего” механизма коагуляции считают фосфолипидные компоненты из серого вещества кадаверного мозга [34] и бобов сои [8]. Сравнение отечественного ФЭ, полученного из бобов сои Н.Н. Старицыной [11], с реагентом фирмы “Реанал” (Венгрия) из кадаверного мозга в тесте АПТВ показало более высокую чувствительность первого к выявлению нарушений в первой фазе коагуляции, что важно при распознавании гемофилии, особенно ее скрытых форм.

На чувствительность метода АПТВ оказывает влияние также активатор, входящий в тест-систему (его качество и количество), и концентрация хлорида кальция [26]. В качестве активатора наиболее часто используют каолин [6, 12]. Он должен быть очищенным от механических примесей и иметь мелкодисперсную структуру, оптимально обеспечивающую стандартность контактной активации. Некоторые исследователи и фирмы предлагают эллаговую кислоту [13], кремнезем [27].

В стандартизации результатов АПТВ немаловажная роль принадлежит условиям проведения метода — последовательности добавления реагентов, продолжительности инкубации смеси, контактной активации, а также преанали-тическим условиям выполнения исследований — взятию крови, продолжительности при этом венозного стаза, условиям и длительности хранения образца [14]. Требованиям стандартизации, по мнению Dieter [28], отвечает проведение теста в кюветах из плотного пропилена.

Существуют значительные различия в показателях чувствительности теста АПТВ к гепарину. До сих пор терапевтический уровень при проведении гепари-нотерапии устанавливают по результатам теста обычно без проверки чувствительности входящих в набор реагентов [21]. Чтобы использовать тест АПТВ для контроля гепаринотерапии, Haushofer и соавт. [21] рекомендуют использовать для калибровки лиофилизированную плазму с содержанием гепарина, наиболее часто применяемого в клинике; подобное предлагают исследователи США и Англии [5]. Без этого терапевтические уровни гепарина при использовании различных реагентов в тесте АПТВ в лабораториях не совпадали по чувствительности до такой степени, что исследование одного и того же образца плазмы показывало недостаточность дозы гепарина в одной системе и опасную передозировку — в другой. Верхние пределы терапевтических уровней одних реагентов для этого теста могут быть ниже, чем нижние — других [23]. Следует также учитывать, что выраженное удлинение АПТВ зависит от сочетанного применения с гепарином других лекарств [19]. Оценивая зависимость величины АПТВ от дозы введенного больным гирудина или гирулога, Lefkovits и Topol [24] установили, что результаты теста не являются адекватным показателем антитромботического действия этих препаратов.

В связи с многоплановостью применения метода в практике клинических лабораторий, значительным числом ФЭ, различием качества активаторов, а также вариациями воспроизведения возникают затруднения в оценке полученных результатов. Это побудило ряд стран провести исследования в большом числе лабораторий с использованием ряда контрольных плазм с нормальными и патологическими диапазонами коагуляции [32] и разработать собственные национальные программы стандартизации теста АПТВ и оценки биологических реактивов и активаторов, используемых в тест-системах. Такие мероприятия позволяют также ограничить или исключить применение ФЭ с низкой стабильностью или активностью [5].

Сравнительное изучение 4 коммерческих кефалинов, проведенное в большом числе лабораторий, показало наибольшую чувствительность к дефектам свертывания, характерную для набора “Цефотест”, и наименьшую — для “Актин ФС” [22]. Исследование 9 коммерческих кефалинов [17] выявило удовлетворительную стабильность и воспроизводимость всех реагентов. Haushofer А. и соавт. [21] изучили чувствительность к гепарину ряда наборов для выполнения метода АПТВ на разных автоматических коагулографах: Liquid Silica (SIL; Instrumentation Laboratory, Italy), Actin FSL and FS (FSL, FS; Dade, USA), Pathromtin (BEH; Behringwerke, Germany), Cephalin Kaolin APTT (BOE, Boehringer Mannheim, Germany) и аппараты ACL 300 (ACL), Sysmex CA 5000 (CA) и STA. Они рекомендуют гепариновые калибровки с использованием коммерческих плазм, имеющих определенную концентрацию гепарина (0,3, 0,5 и 0,7 ME в 1 мл). При этом обеспечивается тестирование чувствительности разных наборов.

Метод АПТВ, как и Квика, может быть осуществлен не только ручным, но и аппаратным способом, на полу- и автоматических коагулометрах [3, 4, 16]; предпочтительно пользоваться коммерческими тестированными ФЭ [30]. Исследования АПТВ, проведенные у здоровых лиц Craig и соавт. [16] с использованием двух реагентов парциального тромбопластина фирмы “Manchester low-opacity”, показало хорошую корреляцию результатов — у больных,получавших большие дозы гепарина, корреляция была слабой.

В нашей стране тест АПТВ, в отличие от метода Квика, внедрен в клинико-диагностические лаборатории недостаточно широко. Тем не менее количество ФЭ, предназначенных для его выполнения, значительно больше, нежели полных тромбопластинов для теста Квика.

В лаборатории биохимии крови Кировского НИИГПК созданы лиофилизированные диагностикумы из кадавер-ного тромбопластина — кефалины [11, 12] на основе разработок Ленинградского НИИГПК [6]. Отечественный аналог кефалина — эрилид, разработанный в лаборатории комплексной переработки крови ГНЦ РАМН, изготовлен из стромы эритроцитов крови человека [1, 2]. Он высокочувствителен к дефектам коагуляции; длительность АПТВ в тест-системе с эрилидом при легкой форме гемофилии составила 66 с, при средней — 75—97 с (норма — 35—45 с). На основе эрилида сформирован коммерческий набор для определения АПТВ, в качестве активатора включающий каолин. Из сырья растительного происхождения (бобов сои) в Ленинградском НИИГПК создан стабильный фосфолипидный экстракт, высоко чувствительный к нарушениям “внутреннего” механизма коагуляции и выявлению гемофилии, в том числе скрытой [8]; активатор в наборе — каолин.

Для изготовления стабильного ФЭ из кадаверного тромбопластина нами разработан способ лиофилизации эмульсии, полученной по методу Л.П. Папа-ян и П.В. Хроловой [6]. Лиофилизированный реагент, названный парциальным (частичным) тромбопластином, представляет собой порошок белого цвета, растворимый в дистиллированной воде и изотоническом растворе натрия хлорида (до 1 мин). Первоначальная форма диагностикума была представлена в пенициллиновых флаконах, более поздняя — в инсулиновых. Перед проведением исследований реагент разводили в 0,2 мл дистиллированной воды (“восстанавливали” исходный объем, из которого высушивали), затем в 100 раз — изотоническим раствором хлорида натрия. Активность контролировали в тесте АПТВ [6] по отношению к пулу свежей донорской плазмы. Исходные показатели активности реагента 6 серий составляли 48—53 с и сохранялись не менее одного года при 4—8°С. Изготовленный позднее диагностикум других серий имел более высокую активность, достигающую 30 с, что связано с качеством исходного сырья.

Отечественный реагент сравнивали в тесте АПТВ с парциальным тромбопластином фирмы “Reanal” (Венгрия), проводя исследования в соответствии с инструкцией “Reanal АРТТ”, прилагаемой к набору. Тестировали диагности-кумы по отношению к свежему донорскому пулу. Исследовали венгерский реагент двух поставок за 5—6 месяцев до истечения срока годности. Активность парциального тромбопластина отдельных флаконов первой поставки в разные дни исследования колебалась от 28,2 до 97,5 с (65,6±8,5 с), второй — 33,5— 51,0 с (42,2±1,1 с). Изученная параллельно активность отечественного кефалина 2 серий составила соответственно 49— 76 с (59,5±5,2 с) и 30,0-38,8 с (33,4±1,4 с). Низкая активность реагента фирмы “Reanal”, особенно первой поставки, и большой ее “разброс” могут быть связаны с нарушениями транспортирования и последующего хранения (границы для разных поставок, указанные фирмой, находятся в пределах 28—45 с).

Специфичность отечественного лиофилизированного ФЭ подтверждена результатами исследования АПТВ и анти-гемофильных факторов 36 больных гемофилией А и 6 — гемофилией В, а также лиц, получавших гепарин (более 30 человек).

Изготовленная форма парциального тромбопластина имела существенный недостаток: после разведения реагент необходимо было использовать в течение 2 суток (хранение при 4—8°С), проведя не менее 100 исследований. Такая потребность в обследовании больных возможна лишь в крупных специализированных отделениях сосудистой хирургии, где проводят гепаринотерпию. Следовательно, изготовленная форма была мало экономичной и не могла пользоваться широким спросом. Кроме того, активность, равная в основном 48—53 с, достаточно низка. С целью повышения активности и стабильности, а также для возможно более широкого внедрения метода АПТВ в практику отечественных клинических лабораторий мы создали другую форму парциального тромбопластина, также использовав кадаверное сырье. Изменение способа его обработки позволило сократить продолжительность изготовления нативной эмульсии примерно в 1,5 раза; эмульсия стала более гомогенной; модификации, внесенные в технологию, позволили повысить активность и стабильность реагента. Изменили также разведение лиофилизированного продукта перед проведением исследований. Его растворяли в 0,2 мл дистиллированной воды (исходный объем, из которого был высушен диагностикум), затем прибавляли 4,8 мл изотонического раствора хлорида натрия. Разведенный парциальный тромбопластин использовали в тесте АПТВ через 30 минут. Неиспользованный реагент оставляли в холодильнике при 4—8°С до следующего рабочего дня. Активность реагента разных серий колебалась от 35 до 48 с и сохранялась не менее одного года, то есть приближалась к международным требованиям.

Разработанный нами фосфолипидный экстракт явился основой набора для теста АПТВ. Помимо двух флаконов парциального тромбопластина набор включает мелкодисперсную суспензию каолина и 0,277% раствор хлорида кальция. Он рассчитан на 40—50 анализов с учетом того, что каждый образец плазмы должен проверяться не менее 2 раз.

Параллельные исследования активности реагента проводили пробирочным методом и на 2 аппаратах фирмы “Organon teknika” (полуавтоматическом “Coag-A-mate ХМ” и автоматическом “Coag-A-mate RA4”). В качестве контроля использовали диагностикум “Плазма донорская (реактив)” нашего производства и референт плазмы “Organon teknika”. При проведении исследований с отечественным реагентом время образования сгустка составило в среднем 45,2±0,3 с (пробирочный способ), 37,9±3,4 с (полуавтомат) и 32,1±1,4 с (автомат), со стандартом “Organon teknika” — соответственно 44,5 — 45,5 с, 36,6—42,7 с и 35,7—40,4 с, то есть время свертывания в тесте АПТВ, выполненном на аппаратах, было меньшим. Однако индекс АПТВ (отношение времени образования сгустка в исследуемом образце ко времени образования его в контроле) во всех исследованиях был сопоставим с достаточной точностью (Р> 0,05). Результаты представлены в таблице.

 

Индекс АПТВ (М±m)

Методы	Пул свежей донорской плазмы	Плазма донорская (реактив)	Референтная плазмы фирменная
Пробирочный	0,097±0,026	0,98±0,06	0,98±0,03
Полуавтомат	1,00±0,04	0,96±0,1	0,96±0,1
Автомат	1,10±0,15	1,09±0,094	1,01±0,09

 

Полученные данные свидетельствуюто том, что отечественный реагент парциального тромбопластина может быть использован в наборе, предназначенном для выполнения теста АПТВ, при его воспроизведении не только пробирочным, но и аппаратным способом, на полу- и автоматическом приборах. Набор может быть рекомендован для использования в специализированных и клинико-диагностических лабораториях страны.

Об авторах

Л. Н. Тарасова

Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови

Автор, ответственный за переписку.
Email: info@eco-vector.com
Россия, Киров

Е. Ю. Савиных

Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови

Email: info@eco-vector.com
Россия, Киров

Г. К. Платонова

Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови

Email: info@eco-vector.com
Россия, Киров

Л. Л.Н. Тонин

Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови

Email: info@eco-vector.com
Россия, Киров

О. И. Речкин

Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови

Email: info@eco-vector.com
Россия, Киров

Список литературы

Дополнительные файлы