Role of C807T polymorphism of ITGA2 gene of collagen receptor and platelet aggregation activity in patients with arterial hypertension

Abstract


Aim. To study the prevalence of various C807T polymorphism variants of the ITGA2 gene and to analyze the association of this polymorphism with platelet aggregation activity in hypertensive patients.

Methods. 47 patients with arterial hypertension treated at the Clinical Cardiology Dispensary (Perm) were included in the study. Genotyping of C807T polymorphism (rs 1126643) was carried out by the method of polymerase chain reaction with the subsequent identification of the single nucleotide polymorphic variant of ITGA2 gene by the method of allele-specific polymerase chain reaction. Platelet aggregation activity was investigated by the impedance method using TRAP-6 reagent as an inducer of aggregation.

Results. The prevalence of C/C, C/T, T/T genotypes of ITGA2 gene among hypertensive patients was 18 (38.3%), 23 (48.9%) and 6 (12.8%), respectively. A comparative analysis of platelet aggregation activity with TRAP-6 reagent revealed statistically significant differences between the groups of patients carrying different genotypes [103.5 (67.0; 121.0) AU in homozygotes –807CC versus 52.5 (48; 83) AU in homozygotes –807TT, p=0.045]. In the group of patients with reduced platelet aggregation activity (TRAP-test less than 94 AU), the carriage of the unfavorable T allele prevailed in comparison with the group of patients with its normal level (OR=3.81, 95% CI 1.38–10.54; p=0.008). In patients of this group, there was a significant increase in the frequency of occurrence of heterozygotes –807CT (OR=4.75, 95% CI 1.24–18.19; p=0.009), as well as an increase in the frequency of occurrence of homozygotes for the variant allele -807TT (OR=2.88, 95% CI 0.31–27.07; p=0.009) compared with the group of patients with a normal level of aggregation.

Conclusion. The prevalence of C/C, C/T, T/T genotypes of ITGA2 gene among patients with arterial hypertension is comparable to the data of European researchers: carriers of T allele of ITGA2 gene may have a higher risk of developing cardiovascular events; the molecular mechanism of the relationship of reduced platelet aggregation activity and carriage of the unfavorable T allele of ITGA2 gene requires further studies.


На сегодняшний день артериальная гипертензия (АГ), безусловно, остаётся одним из актуальных и социально-значимых сердечно-сосудистых заболеваний. Несмотря на открытие новых классов антигипертензивных препаратов, количество пациентов, страдающих АГ и погибающих от её осложнений, продолжает неуклонно расти [1].

Согласно результатам скрининговых исследований, повышенный уровень артериального давления выявляют у 39–40% населения Российской Федерации [2]. Актуальность проблемы обусловлена не только широким распространением данного заболевания, но и тем вкладом, который вносит АГ в развитие инфаркта миокарда и мозгового инсульта [3].

Как и большинство сердечно-сосудистых заболеваний, АГ представляет собой классическое мультифакториальное заболевание и является проявлением эффекта множества генов, каждый их которых по отдельности обладает относительно слабым действием, однако в комбинации друг с другом и под влиянием факторов внешней среды способен привести к развитию патологии [4]. Использование современных молекулярно-биологических методов генетической кардиологии позволяет изучать генетические компоненты сердечно-сосудистых заболеваний. Тестирование полиморфизмов (аллельных вариантов) генов предрасположенности составляет методическую основу предиктивной медицины [5].

Изучение генетических аспектов тромбообразования позволило установить, что у носителей неблагоприятных аллелей генов белков-участников гемостатического каскада чаще случаются тромботические события, которые зачастую могут оказаться фатальными [6]. Так, например, установлено, что аллель T полиморфного маркёра C807T гена ITGA2 (rs 1126643) ассоциирован с повышенной экспрессией GPIa-рецепторов тромбоцитов и повышенной адгезией тромбоцитов к коллагену. Наличие аллеля Т ассоциируется с увеличением скорости адгезии тромбоцитов, а следовательно, и с повышением риска развития инфаркта миокарда, ишемического инсульта, тромбоэмболии [7, 8].

В современной литературе встречается информация о том, что полиморфизм С807Т гена ITGA2 (rs 1126643) ассоциирован с развитием тромбоэмболических событий у людей с высоким сердечно-сосудистым риском, в том числе у пациентов с АГ, сахарным диабетом и дислипидемией [9]. Исследование генетического полиморфизма С807Т гена ITGA2 (rs 1126643) могло бы стать важным шагом на пути ­составления персонализированного алгоритма обследования данной категории больных. Именно поэтому изучение полиморфизма С807Т гена ITGA2 (rs 1126643) и его ассоциации с функциональным состоянием тромбоцитов у пациентов с АГ приобретает особую значимость.

Цель исследования: изучить распространённость различных вариантов полиморфизма С807Т гена ITGA2 и провести анализ ассоциации данного полиморфизма с агрегационной активностью тромбоцитов (ААТ) в выборке пациентов с АГ.

В исследование были включены 47 пациентов (15 женщин и 32 мужчины, 68,08 и 31,92% соответственно), находившихся на лечении в отделении кардиологии и профилактики ГБУЗ ПК «Клинический кардиологический диспансер» (г. Пермь) с установленным диагнозом АГ в период с 2017 по 2018 гг. Выборка не была репрезентативной из-за малого количества участников и была сформирована согласно критериям включения и исключения.

В период нахождения в стационаре всем пациентам проведены стандартные лабораторные и инструментальные обследования согласно стандарту оказания медико-санитарной помощи при первичной АГ Минздрава России (приложение к приказу Минздрава России №708н от 09.11.2012). Лабораторное обследование включало исследование общего анализа крови, общего анализа мочи, определение липидного спектра, показателей углеводного обмена, уровня креатинина, мочевой кислоты, показателей функций печени.

Медиана возраста пациентов составила 55 лет с интерквартильным размахом от 48 до 60 лет. Верификацию диагноза АГ проводили в соответствии с рекомендациями Российского общества по артериальной гипертонии и Всероссийского научного общества кардиологов по диагностике и лечению АГ (4-й пересмотр) [10]. Критериями диагноза считали офисное артериальное давление ≥140/90 мм рт.ст., при суточном мониторировании — ≥130/80 мм рт.ст. (BPLab, Россия).

Для включения в группу наблюдения все пациенты подписывали письменное информированное согласие на участие в исследовании. Проведение исследования было одобрено локальным этическим комитетом при ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет им. Е.А. Вагнера» Мин­здрава России (протокол №8 от 02.10.2018).

В выборку не включали пациентов при наличии следующих факторов:
– инфаркт миокарда менее 6 мес до начала исследования или острый коронарный синдром на момент наблюдения в стационаре;
– хроническая сердечная недостаточность IV функционального класса по классификации Нью-Йоркской ассоциации кардиологов;
– тяжёлые сопутствующие заболевания и ассоциированные клинические состояния (декомпенсированный сахарный диабет, острое нарушение мозгового кровообращения давностью <1 года, тяжёлая форма печёночной недостаточности, хроническая болезнь почек выше стадии С2, злокачественные новообразования, признаки развития острого или обострения хронического инфекционного заболевания, уровень гемоглобина <100 г/л, содержание тромбоцитов <100×109/л или >450×109/л).

Забор крови производили утром натощак путём пункции кубитальной вены по стандартизированной методике. Для исследования активности агрегации тромбоцитов и оценки их функции проводили импедансную агрегометрию на полуавтоматическом мультиканальном анализаторе Multiplate (Verum Diagnostica, Германия) [11]. Метод основан на регистрации изменений сопротивления электрода, помещённого в цельную кровь, при налипании на него тромбоцитов или агрегатов.

Для оценки ААТ проводили TRAP-тест с использованием в качестве индуктора агрегации реагента TRAP-6 (от англ. thrombin receptor-activating peptide). Он представляет собой пептид, имитирующий активацию тромбоцитов под действием тромбина, который в свою очередь известен как наиболее сильный активатор действия тромбоцитов. Для повышения точности исследования каждый тест в образце дублировали. Агрегационную кривую и её параметры рассчитывали автоматически [12]. Изменение сопротивления выражали в условных единицах, названных агрегационными, — AU. Референтный интервал для значений AU был обозначен на основании данных клинических исследований [13]. Значение AU <94 расценивали как снижение способности тромбоцитов к агрегации.

У всех обследуемых с помощью сухого стерильного зонда с ватными тампонами вращательными движениями без травматизации проводили забор материала со слизистой оболочки щеки с последующим выявлением однонуклеотидного полиморфного варианта гена ITGA2 методом аллель-специфической полимеразной цепной реакции на амплификаторе CFХ-96 (BioRad Laboratories, Inc., США) с использованием наборов производства ООО «Синтол» (г. Москва) и детекцией ­продуктов в режиме реального времени. Результаты интерпретировали в зависимости от характера кривых амплификации, отображаемых в программном обеспечении CFX Manager v. 3.0 для амплификатора CFX-96 с использованием метода аллельной дискриминации [14].

Статистический анализ материала проведён с применением пакета программ Statistica 6.0 (StatSoft). Для анализа количественных данных использовали тест Манна–Уитни. Статистический анализ распределения частот аллелей и генотипов проводили с использованием таблиц сопряжённости и критерия χ2. Различия считали статистически значимыми при p <0,05. Для вычислений использовали программу «Калькулятор для расчёта статистики в исследованиях случай-контроль» (http:/gen-exp.ru/calculator_or.php). Для оценки ассоциации аллелей и генотипов с риском развития гипоагрегации использовали критерий χ2 и отношение шансов с 95% доверительным интервалом.

Это было простое открытое сравнительное исследование. На первом этапе в сформированной выборке пациентов с АГ было проведено изучение частоты генотипов и аллелей полиморфизма С807Т гена ITGA2.

Распространённость генотипов С/С, С/Т, Т/Т среди пациентов с АГ составила соответственно 18 (38,3%), 23 (48,9%) и 6 (12,8%) (рис. 1), а их распределение не противоречило закону Харди–Вайнберга для равновесных популяций (p=0,47). Данные результаты согласуются с распределением частот генотипов С/С, С/Т, Т/Т в работах некоторых европейских исследователей (С/С 37,4%, СТ 47,7%, ТТ 14,9%) [15]. Носители Т-аллеля достоверно не отличались от людей с генотипом СС по основным сердечно-сосудистым факторам риска, степени повышения артериального давления, полу и возрасту (p >0,05).

 

Рис. 1. Полимофизм С807T гена ITGA2 у пациентов с артериальной гипертензией

 

В последующем между группами пациентов, являющихся носителями разных генотипов, был проведён сравнительный анализ показателей ААТ с реактивом TRAP-6. Результаты полученных данных представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Значение агрегационной активности тромбоцитов у пациентов с артериальной гипертензией
в зависимости от полиморфизма С807Т (rs 1126643) гена ITGA2

Агрегационная активность тромбоцитов

Генотипы ITGA2

p

C/C (1)

C/T (2)

T/T (3)

TRAP-тест, AU;

Me (Q1; Q3)

103,5 (67,0; 121,0),

n=18

75 (55; 91),

n=23

52,5 (48; 83),

n=6

p2–3=0,027

p1–3=0,045

Примечание: Me — медиана, Q1 и Q3 — 25-й и 75-й перцентили; p — уровень значимости при сравнении групп генотипов С/С, С/Т, Т/Т.

 

Из табл. 1 видно, что наибольшая ААТ была характерна для носителей генотипа С/С. И напротив, наименьшая степень агрегации тромбоцитов зарегистрирована у носителей генотипа T/T. При попарном сравнении групп статистически значимые различия по агрегации тромбоцитов обнаружены между пациентами с генотипами T/T и С/Т (p=0,027), а также между гомозиготами С/С и T/Т (p=0,045).

В ходе дальнейшего исследования больные были разделены на две группы в зависимости от значений ААТ с реактивом TRAP-6: в первую группу был включён 31 пациент с уровнем агрегации менее 94 AU, во вторую группу вошли 16 пациентов с уровнем агрегации более 94 AU. Группы были сопоставимы по обсуждаемым параметрам. Различия по количеству тромбоцитов по данным общего анализа крови между группами пациентов не имели статистической значимости (p >0,05). Результаты оценки распространённости генотипов и аллелей полиморфизма С807Т гена ITGA2 в группе пациентов с АГ в зависимости от ААТ и значений TRAP-теста представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Распределение аллелей и генотипов полиморфизма С807T (rs 1126643) гена ITGA2 у пациентов с ­артериальной гипертензией в зависимости от результатов TRAP-теста (мультипликативная и общая модели наследования)

Аллели, генотипы

Частота аллелей и генотипов

χ2 (p)

ОШ (95% ДИ)

Первая группа

(n=31),

TRAP-тест <94 AU

Вторая группа

(n=16),

TRAP-тест >94 AU

C

0,532

0,812

7,09 (0,008)*

0,26

(0,09–0,73)

T

0,468

0,188

3,81

(1,38–10,54)

C/C

0,226

0,688

9,52 (0,009)*

0,13

(0,03–0,51)

C/T

0,613

0,250

4,75

(1,24–18,19)

T/T

0,161

0,062

2,88

(0,31–27,07)

Примечание: *статистически значимые различия показателей в группах; ОШ — отношение шансов; ДИ — доверительный интервал.

 

Таким образом, в группе пациентов со сниженной ААТ (TRAP-тест менее 94 AU) преобладало носительство неблагоприятного аллеля T в сравнении с группой пациентов с нормальным уровнем ААТ (отношение шансов 3,81; 95% доверительный интервал 1,38–10,54; p=0,008). Среди пациентов данной группы распространённость гетерозигот С/Т и ­гомозигот Т/Т, ­носителей аллеля Т, была достоверно выше по сравнению с группой пациентов с нормальным уровнем ААТ (отношение шансов 4,75 и 2,88; 95% доверительный интервал 1,24–18,19 и ­0,31–27,07 соответственно; p=0,009).

Ген ITGA2 расположен на длинном плече хромосомы 5q11.2 и кодирует α2-субъединицу (GPIa) интегрина α2β1 (GPIa/IIa). Участок последовательности ДНК гена ITGA2, в которой происходит замена азотистого основания цитозина (С) на тимин (Т) в позиции 807, обозначают как генетический маркёр C807T. Изменение первичной структуры субъединицы у носителей генотипов ITGA2 C/T и Т/Т вызывает изменение свойств рецептора, что приводит к увеличению скорости адгезии тромбоцитов.

В научной литературе представлено достаточно материала, демонстрирующего связь полиморфизма С807Т гена ITGA2 с риском развития сердечно-сосудистых заболеваний. Так, риск инфаркта миокарда у носителей мутантного аллеля возрастает в 2,8 раза. Также носители неблагоприятного аллеля Т имеют более высокий риск развития ишемического инсульта и тромбоэмболических заболеваний, особенно в более молодом возрасте [7, 8]. Показано, что носители аллеля 807T гена ITGA2 среди пациентов моложе 65 лет, перенёсших острый коронарный синдром, имеют значительно больший риск повторных коронарных событий в течение последующих 5 лет [15].

В настоящей работе впервые исследована ассоциация полиморфизма С807Т гена ITGA2 с ААТ, определённой методом импедансной агрегометрии у пациентов с АГ. Результаты работы показали, что носительство неблагоприятного аллеля T гена ITGA2 связано с уменьшением ААТ с индуктором агрегации TRAP-6, действие которого аналогично тромбину. Молекулярный механизм такой взаимо­связи требует дальнейшего изучения.

Известно, что пептид TRAP-6 активирует тромбоциты благодаря рецепторам PAR1. Вопрос о том, почему генетические вариации количества и активности коллагенового рецептора α2β1 связаны с функцией тромбинового рецептора PAR1, представляется нам крайне интересным. В существующих на сегодняшний день публикациях не найдено убедительных данных, позволяющих подтвердить отсутствие перекрёстной активации тромбиновых и коллагеновых рецепторов в многоступенчатой модели адгезии тромбоцитов. Напротив, в работе R.J. Marjoram и соавт. было показано, что субоптимальная стимуляция PAR-рецепторов может запускать механизм активации α2β1-субъединицы интегрина, который усиливает адгезию тромбоцитов к коллагену [16].

Полученные нами данные сходны с результатами вышеуказанного исследования. Наличие генетической мутации С807Т приводит к повышенной экспрессии рецепторов α2β1-субъединицы интегрина на поверхности тромбоцитов [7, 8]. Вследствие этого адгезия тромбоцитов к коллагену усиливается. Можно предположить, что снижение агрегации тромбоцитов с реактивом TRAP-6, полученное в нашем исследовании у носителей мутантного аллеля Т, может быть обусловлено снижением перекрёстной активности PAR-рецепторов.

Полученные результаты создают предпосылки для продолжения данного исследования в плане увеличения объёма выборки, поскольку для достоверной оценки клинического значения полученных данных необходимы более обширные исследования.

Выводы

1. Согласно результатам нашего исследования, распространённость гетерозигот С/Т и гомозигот Т/Т, носителей аллеля Т гена ITGA2, среди пациентов с артериальной гипертензией составила 61,7%. Носителей данного аллеля потенциально можно рассматривать как пациентов с артериальной гипертензией, имеющих более высокий риск тромбофилических состояний, а наблюдение за ними врачом-клиницистом требует составления индивидуальной программы профилактики ранних сердечно-сосудистых событий.

2. Существует необходимость дальнейшего изучения молекулярного механизма взаимо­связи сниженной функциональной активности тромбоцитов, определяемой методом импедансной агрегометрии, и носительства неблагоприятного аллеля T гена ITGA2. Полученные результаты позволяют предположить, что пациенты с артериальной гипертензией и изменённой агрегационной активностью тромбоцитов нуждаются в проведении дальнейшего поиска генетических маркёров тромбофилий.

3. Весьма актуальным представляется поиск ассоциаций генетического полиморфизма С807Т гена ITGA2 с данными рутинного клинического обследования и других доступных лабораторных методов обследования пациентов с артериальной гипертензией. Обнаружение таких ассоциаций позволит значительно повысить возможности профилактики сердечно-сосудистых событий у пациентов с артериальной гипертензией.

 

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

E A Shishkina

Perm State Medical University named after Academician E.A. Wagner

Author for correspondence.
Email: doctor.shishkina@yandex.ru

Russian Federation, Perm. Russia

O V Khlynova

Perm State Medical University named after Academician E.A. Wagner

Email: doctor.shishkina@yandex.ru

Russian Federation, Perm. Russia

L M Vasilets

Perm State Medical University named after Academician E.A. Wagner

Email: doctor.shishkina@yandex.ru

Russian Federation, Perm. Russia

V Sakhena

Perm State Medical University named after Academician E.A. Wagner

Email: doctor.shishkina@yandex.ru

Russian Federation, Perm. Russia

A V Krivtsov

Federal Scientific Center for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies

Email: doctor.shishkina@yandex.ru

Russian Federation, Perm. Russia

  1. Forouzanfar M.H., Liu P., Roth G.A. et al. Global Burden of Hypertension and Systolic Blood Pressure of at Least 110 to 115 mm Hg, 1990–2015. JAMA. 2017; 317 (2): 165–182. doi: 10.1001/jama.2016.19043.
  2. Boytsov S.A., Balanova Y.A., Shal’nova S.A. et al. Arterial hypertension among individuals aged 25–64 years: prevalence, awareness, treatment and control. By the data from ECCD. Kardiovaskulyarnaya terapiya i profilaktika. 2014; 13 (4): 414. (In Russ.)
  3. Ettehad D., Connor A.E., Kiran A. et al. Blood pressure lowering for prevention of cardiovascular disease and death: a systematic review and metaanalysis. Lancet. 2016; 387 (10022): 95767. doi: 10.1016/S0140-6736(15)01225-8.
  4. Glotov O.S., Baranov V.S Genetic polymorphism, multifactorial diseases and longevity. Meditsinskaya genetika. 2007; (4): 17–29. (In Russ.)
  5. Sidonets I.V., Meshkov A.N. Genetics for diagnostics in preventive medicine. Kardiovaskulyarnaya terapiya i profilaktika. 2011; 10 (1): 9–13. (In Russ.)
  6. Feng D., Lindpaintner K., Larson M.G. et al. Platelet glycoprotein IIIa Pl(a) polymorphism, fibrinogen, and platelet aggregability: The Framingham Heart Study. Circulation. 2001; 104 (2): 140–144. doi: 10.1161/01.CIR.104.2.140.
  7. Von Beckerath N., Koch W., Mehilli J. et al. Glycoprotein Ia gene C807T polymorphism and risk for major adverse cardiac events within the first 30 days after coronary artery stenting. Blood. 2000; 95 (11): 3297–3301. PMID: 10828008.
  8. Liu H., Wang Y., Zheng J. et al. Platelet glycoprotein gene Ia C807T, HPA-3, and Ibα VNTR polymorphisms are associated with increased ischemic stroke risk: Evidence from a comprehensive meta-analysis. Int. J. Stroke. 2017; 12 (1): 46–70. doi: 10.1177/1747493016672085.
  9. Rath D., Schaeffeler E., Winter S. et al. GPIa Polymorphisms are associated with outcomes in patients at high cardiovascular risk. Front. Cardiovasc. Med. 2017; 4: 52. DOI: 10/3389/fcvm.2017.00052.
  10. Chazova I.E., Ratova L.G., Boycov S.A., Nebieridze D.V. Recommendations for the management of arterial hypertension Russian Medical Society of Arterial Hypertension and Society of Cardiology of the Russian Fe­deration. Sistemnye gipertenzii. 2010; (3): 5–26. (In Russ.)
  11. Schimmer C., Hamouda K., Sommer S.P. et al. The predictive value of multiple electrode platelet aggregometry (multiplate) in adult cardiac surgery. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2013; 61 (8): 733–743. doi: 10.1055/s-0033-1333659.
  12. Paniccia R., Antonucci E., Maggini N. et al. Assessment of platelet function on whole blood by multiple electrode aggregometry in high-risk patients with coronary artery di­sease receiving antiplatelet therapy. Am. J. Clin. Pathol. 2009; 131 (6): 83442. doi: 10.1309/AJCPTE3K1SGAPOIZ.
  13. Villadsen K., Hvas A.-M. Reference intervals for platelet aggregation assessed by multiple electrode platelet aggregometry. Thromb. Res. 2012; 130 (3): 420–423. doi: 10.1016/j.thromres.2012.06.017.
  14. Grinshteyn Yu.I., Kosinova А.А., Grinshteyn I.Yu. et al. Possible genetic predictors of cardiovascular complications after co­ronary bypass. Kardiologiya. 2018; 58 (7): 77–84. (In Russ.)
  15. Leone А., Stefano V., Burzotta F. et al. Glycoprotein Ia C807T gene polymorphism and increased risk of recurrent acute coronary syndromes: a five year follow up. Heart. 2004; 90: 567–569. doi: 10.1136/hrt.2003.017624.
  16. Marjoram R.J., Voss B., Pan Y. et al. Suboptimal activation of protease-activated receptors enhances α2β1 integrin-mediated platelet adhesion to collagen. J. Biol. Chem. 2009; 284: 34640. doi: 10.1074/jbc.M109.020990.

Supplementary files

There are no supplementary files to display.

Views

Abstract - 71

PDF (Russian) - 105

Cited-By


PlumX


© 2019 Shishkina E.A., Khlynova O.V., Vasilets L.M., Sakhena V., Krivtsov A.V.

Creative Commons License

This work is licensed
under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.


Свидетельство о регистрации СМИ ЭЛ № ФС 77-75008 от 1 февраля 2019 года выдано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор)