Factors of the immune microenvironment and the state of the extracellular matrix in vulvar ­cancer

Full Text

Актуальность

При рассмотрении причин развития и прогрессирования рака вульвы обычно обращают внимание на инфицирование больных вирусом папилломы человека (ВПЧ), способствующее трансформации предракового процесса вульварной интраэпителиальной неоплазии в рак. В литературе также придают значимость генетическим изменениям, например TP53-мутации, опухолевым стволовым клеткам, обеспечивающим резистентность к лечению [1].

Однако прогрессирование опухоли связано не только с изменением свойств самих опухолевых клеток, но и с состоянием микроокружения в виде внеклеточного матрикса (ВКМ) и клеток стромы (включая клетки иммунной системы), продуцирующих различные биологически активные вещества. Матриксные металлопротеиназы (ММР — от англ. matrix metalloproteinases) и их ингибиторы секретируются как опухолевыми, так и стромальными клетками и во многом определяют состояние ВКМ. ВПЧ, присутствие которого характерно не только для рака шейки матки, но и для рака вульвы, также вносит свой вклад в разрушение ВКМ и индукцию изменений уровня ММР и их ингибиторов [2].

Другой важный фактор, влияющий на рост и распространение опухоли, — состояние локального иммунитета или иммунного микроокружения опухоли (TIME — от англ. tumor immune microenvironment). Большое количество активированных Т-хелперов ассоциируется с благоприятным клиническим исходом при ранних стадиях рака вульвы вне зависимости от ВПЧ-статуса больных [3].

Благоприятный прогноз безрецидивной выживаемости у больных раком вульвы связывают также с высоким содержанием CD8+-лимфоцитов в опухолевой ткани [4], а слабую инфильтрацию CD8+TIM3+ при большом количестве T-regs — с рецидивированием вульварной интраэпителиальной неоплазии и низким ответом на вакцинацию против ВПЧ [5].

Изучение взаимосвязей между состоянием ВКМ и показателями локального иммунитета способствует уточнению механизмов прогрессирования рака вульвы и выявлению возможных мишеней для его предотвращения.

Цель

Цель исследования — оценить экспрессию факторов ВКМ и локального иммунитета, а также их взаимосвязи при раке вульвы с различной распространённостью процесса.

Материал и методы исследования

Ретроспективное исследование проводили на операционном материале 56 больных первичным раком вульвы I–II стадий (n=20 и n=26 соответственно), а также с рецидивами заболевания (n=10), находившихся на лечении в ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» МЗ РФ. Все больные при поступлении в стационар давали письменное информированное согласие на проведение патоморфологических и иммуногистохимических исследований их операционного материала. Возраст больных составлял от 29 до 84 лет, в среднем 52±3,7 года.

Пациентки были разделены по глубине инвазии опухоли: 0–4 мм (n=20), 4,1–8 мм (n=20), >8 мм (n=16). Группы больных были сопоставимы по возрасту: для вульвы I стадии он составлял 29–79 лет, в среднем 50±3,0 года; для II стадии — 32–84 года, в среднем 53±2,7 года, для рецидивных опухолей — 30–82 года, в среднем 51±5,7 года.

Иммуногистохимическое исследование проводили на срезах с парафиновых блоков первичной опухоли, предназначенных для стандартного морфологического исследования. Материал фиксировали раствором 10% нейтрального забуференного формалина с последующей стандартной проводкой. Депарафинирование и регидратацию парафиновых срезов выполняли в ксилоле и спиртах разной концентрации по стандартной методике.

«Демаскировку» антигенов осуществляли в PT-LinkThermo. Протокол включал предварительный нагрев до 65 °C, восстановление антигена в течение 20 мин при температуре 97 °C и дальнейшее охлаждение до 65 °C. Затем стекла промывали в течение 1–3 мин TBS IHC Wash Buffer + Tween 20 (Cell Marque, Германия) и помещали в автостейнер Thermo Scientific 480S для окрашивания в автоматическом режиме.

Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали систему детекции UltraVision Quanto Detection System HRP (Thermo Fisher Scientific, Великобритания). Срезы докрашивали гематоксилином Карацци, для заключения использовали бальзам Витрогель. Оценку результатов иммуногистохимической реакции осуществляли с применением светового микроскопа AxioLab.A1 (Германия) под увеличением ×100, ×200, ×400.

В работе использовали первичные моноклональные (TIMP-2 в разведении 1:130, Spring Bioscience, США; CD68 клон Kp-1 в разведении 1:500, Cell Marque, Германия; CD206 в разведении 1:300, Biorbyt Ltd., Великобритания; FOXP3 клон SP97 в разведении 1:100, Spring Bioscience, США) и поликлональные (MMP-2 в разведении 1:250, Spring Bioscience, США; MMP-9 в разведении 1:200, Diagnostic BioSystems, США) ­антитела.

Для оценки результатов иммуногистохимического анализа применяли следующие критерии оценки.

1. Экспрессию маркёров — MMP-2, MMP-9, TIMP-2 (от англ. tissue inhibitor of metallopro­teinases-2 — тканевой ингибитор металлопротеиназы-2) — оценивали полуколичественно в соответствии с процентным соотношением клеток и интенсивностью окрашивания: 0, 1+ — слабая, 2+ — умеренная, 3+ — сильная. Экспрессию определяли как положительную, когда окрашивание было выявлено в более 10% (cut-off) опухолевых клеток с интенсивностью 2+ и 3+.
2. Экспрессию CD68, CD206, FOXP3 оценивали подсчётом количества окрашенных опухолевых клеток, которые определяли в каждом поле зрения препарата при использовании увеличения ×200. Подсчёт вели в 10 случайных полях зрения, затем вычисляли среднее ко­личество.

Полученные данные обрабатывали с помощью пакета прикладных программ Statistica 13.0 (StatSoftInc., США). Изучаемые данные проверяли на соответствие нормальному распределению по критерию Шапиро–Уилка. В связи с тем, что первичные данные не подчинялись закону нормального распределения, сравнение групп проводили с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни (U-критерий). Статистически значимыми считали различия при уровне статистической значимости р <0,05.

Корреляционный анализ между показателями, характеризующими состояние ВКМ (ММР-2, ММР-9, TIMP-2) и ТIМЕ (CD68+, CD206+, T-regs), проводили методом множественного корреляционного анализа. Поскольку, кроме парных корреляций, на связь между исследованными иммуногистохимическими ­характеристиками могут влиять такие факторы, как наличие первичной опухоли или рецидива, стадия, глубина инвазии, то их учитывали как ковариаты. Взаимосвязи между показателями выражали в виде частных и парных коэффициентов корреляции (R). Если при учёте ковариат частные корреляции по сравнению с парными утрачивали статистическую значимость или значение R снижалось, считали, что связи между показателями не имели самостоятельности. И напротив, если отмечали сохранение статистически значимой взаимосвязи либо увеличение частного коэффициента по сравнению с парным, то корреляции имели независимый от ковариат характер.

Результаты и обсуждение

Результаты оценки уровня экспрессии ММР-9 и ММР-2 и TIMP-2 представлены на рис. 1. Экспрессия ММР-9 не различалась в зависимости от стадии и глубины инвазии опухоли (см. рис. 1, А, Б).

 

Рис. 1. Экспрессия компонентов внеклеточного матрикса в опухолях вульвы с различной стадией (А, В, Д) и глубиной инвазии (Б, Г, Е); MMP — металлопротеиназа; TIMP — тканевой ингибитор MMP

 

Экспрессия ММР-2 также не демонстрирует различий при градации по стадии опухоли (см. рис. 1, В), однако выявлены статистически значимые различия с высокой достоверностью при разделении по глубине инвазии (см. рис. 1, Г), нарастание которой характеризуется увеличением экспрессии ММР-2 как между опухолями с глубиной инвазии 0–4 мм (Ме=30 [20–40]) и 4–8 мм (Me=42,5 [37–47]), так и с глубиной >8 мм (Me=60 [55–65]); p=0,004 и 0,01 соответственно.

Уровень экспрессии ингибитора ММР-2 TIMP-2 не различается ни при исследованных стадиях, ни при рецидивах карцином по сравнению с первичными опухолями (см. рис. 1, Д): её уровень составлял при I стадии Ме=16,5 [11, 5–20], при II стадии Ме=10 [7, 5–19], при рецидивной опухоли Ме=16 [5–20]; р=0,54, 0,555 и 1,0 соответственно. При этом данный показатель статистически значимо снижается в опухолях с большей глубиной инвазии: Ме=18 [15–23] при 0–4 мм, Ме=16 [1–35] при 4–8 мм, Ме=7,5 [5–10] при инвазии >8 мм (p=0,00083 и 0,009 соответственно) (см. рис. 1, Е).

Результаты оценки макрофагальной инфильтрации в исследованных опухолях, представлены на рис. 2.

 

Рис. 2. Экспрессия макрофагальных маркёров CD68 и CD206 в опухолях больных с различной стадией (А, В) и глубиной инвазии (Б, Г)

 

Как видно из рис. 2, А, общее количество макрофагов увеличивается при повышении стадии от I к II (Ме=15 [10–25] и Ме=25 [5–60] соответственно; р=0,03). В рецидивных опухолях показатель имеет высокую вариабельность и в целом не демонстрирует статистически значимых отличий от первичных опухолей I и II стадий (Ме=23 [10–55]; р=0,44 и 0,24 соответственно). Максимальный разброс индивидуальных показателей характерен для опухолей II стадии и рецидивных опухолей.

При стратификации по глубине инвазии отмечено статистически значимое нарастание инфильтрации СD68+-клетками при инвазии выше 8 мм по сравнению с 0–4 мм (Ме=37,5 [25–60] против Ме=15 [5–20]; р=0,008) (см. рис. 2, Б).

Как видно на рис. 2, В, доля М2 (СD206+) возрастает в опухолях II стадии по сравнению с I стадией (Ме=13 [1–35] против Ме=5 [1–12]; р=0,03), но в рецидивных карциномах не отличается ни от I, ни от II стадий (р=0,23 и 0,07 соответственно). Разброс индивидуальных значений оказался максимальным при II стадии.

При оценке показателя в зависимости от глубины инвазии статистически значимых различий не выявлено, хотя область высоких значений выражена преимущественно при инвазии выше 8 мм (см. рис. 2, Г).

Результаты оценки экспрессии маркёра Т-регуляторных клеток (FoxP3+) в исследованных опухолях, представлены на рис. 3. Данный показатель статистически значимо возрастает при повышении стадии от I к II (Ме=2 [1–4] и Ме=5,5 [2–14] соответственно; р=0,038), а в рецидивных опухолях имеет высокую вариабельность (Ме=2 [1–10]) и не демонстрирует отличий от первичных опухолей I стадии (р=0,723), будучи при этом статистически значимо ниже, чем в опухолях II стадии (р=0,039) (см. рис. 3, А).

 

Рис. 3. Экспрессия FOXP3 в опухолях больных с различной стадией (А) и глубиной инвазии (Б)

 

Индивидуальная вариабельность данных была минимальна в опухолях I стадии, нарастая во II стадии. Статистически значимых различий в зависимости от глубины инвазии по уровню экспрессии FOXP3 в паренхиме не было выявлено: при глубине инвазии 0–4 мм Ме=1,5 [1–5], при глубине 4–8 мм Ме=4 [1–13], при глубине инвазии >8 мм Ме=5,5 [2–18, 5]; р=0,225, 0,89 и 0,475 соответственно (см. рис. 3, Б).

Как видно из табл. 1, преимущественной локализацией макрофагов и T-regs была строма опухолей. В паренхиме опухолей макрофаги типа М2 (CD206) представляют от 33 до 50% их общего количества (CD68), тогда как в строме, особенно при II стадии и рецидивных карциномах, подавляющую часть макрофагов составляют CD206+. Сходные различия отмечены и по локальным уровням T-regs, которые 4-кратно преобладают в строме вне зависимости от стадии и рецидива, хотя в случае последнего статистической значимости не выявлено. В строме опухоли обнаружено статистически значимое возрастание количества T-regs при глубине инвазии >8 мм по сравнению с инвазией 0–4 мм (Ме=25 [7, 5–30] против Ме=8 [5–13]; p=0,0359).

 

Таблица 1. Экспрессия маркёров клеток TIME в паренхиме и строме опухолей различных стадий

Стадии	Маркёры TIME
	CD68+		CD206+		FoxP3
	Ме [Q1–Q3]		Ме [Q1–Q3]		Ме [Q1–Q3]
	Паренхима	Строма	Паренхима	Строма	Паренхима	Строма
I	15 [10–25]	40 [25–40]	5 [1–12]	30 [40–56, 5]	2 [1–4]	8 [5–14]
р	0,0268		0,00067		0,00756
II	25 [5–60]	40 [40–60]	13 [1–35]	40 [40–43]	5,5 [2–14]	23 [12–32]
р	0,0274		0,000782		0,0225
Рецидив	23 [10–55]	30 [20–60]	9 [5–13]	43 [43–45]	2 [1–10]	8 [4–9]
р	0,098		0,0081		0,2278

Примечание: TIME (от англ. tumor immune microenvironment) — иммунное микроокружение опухоли; жирным шрифтом выделены статистически значимые различия.

 

Полученные результаты предполагают, что инфильтрация опухолей вульвы макрофагами и Т-regs имеет ряд различий, характеризующих в большей мере стадию первичной опухоли, чем рецидив с вовлечённостью стромы опухоли в большей степени, чем паренхимы.

Результаты множественного корреляционного анализа между показателями ВКМ и иммунного микроокружения опухоли показали, что при нарастании распространённости опухоли корреляция экспрессии ММР-2 с FOXP3+ становится статистически незначимой, связь между ММР-2 и CD206 сохраняется, а между ММР-2 и CD68 ослабевает (табл. 2).

 

Таблица 2. Корреляционная зависимость между показателями внеклеточного матрикса и TIME у больных раком вульвы

Иммуногистохимические показатели		Статистические показатели
		R парный	p	Ковариата, стадия		Ковариата глубина инвазии
ВКМ	TIME			R частный	p	R частный	p
MMP-2	FOXP3	0,55	0,040	0,24	0,106	0,26	0,217
MMP-2	CD206	0,66	0,010	0,31	0,040	0,63	0,003
MMP-2	CD68	0,58	0,030	0,48	0,003	0,38	0,077
MMP-9	FOXP3	0,17	0,562	0,03	0,816	0,11	0,590
MMP-9	CD206	0,19	0,517	0,07	0,587	0,11	0,577
MMP-9	CD68	0,34	0,237	0,13	0,371	0,19	0,376
TIMP-2	FOXP3	–0,09	0,760	0,03	0,837	0,03	0,890
TIMP-2	CD206	–0,06	0,832	–0,09	0,540	–0,12	0,572
TIMP-2	CD68	0,25	0,381	–0,13	0,374	–0,16	0,445

Примечание: TIME (от англ. tumor immune microenvironment) — иммунное микроокружение опухоли; ВКМ — внеклеточный матрикс; ММР (от англ. matrix metalloproteinases) — матриксная металлопротеиназа; TIMP-2 (от англ. tissue inhibitor of metalloproteinases-2) — тканевой ингибитор ММР-2; жирным шрифтом выделены статистически значимые различия.

 

Внутри кластера показателей TIME выявлены статистически значимые корреляции, зависимые от распространённости опухоли (табл. 3).

 

Таблица 3. Корреляционная зависимость между показателями TIME в паренхиме и строме опухоли больных ­раком вульвы

Показатели TIME		Статистические показатели
В паренхиме опухоли	В строме опухоли	R парный	p	Ковариата, стадия		Ковариата, ­глубина ­инвазии
				R ­частный	p	R ­частный	p
FOXP3	FOXP3	0,57	0,034	0,52	0,000	0,65	0,000
FOXP3	CD206	0,24	0,415	0,28	0,037	0,37	0,054
FOXP3	CD68	–0,10	0,727	0,15	0,295	0,22	0,286
CD206	FOXP3	0,24	0,415	0,41	0,003	0,55	0,003
CD206	CD206	0,61	0,022	0,45	0,001	0,58	0,001
CD206	CD68	0,49	0,075	0,32	0,027	0,41	0,043
CD68	FOXP3	0,04	0,886	0,39	0,007	0,49	0,014
CD68	CD206	0,46	0,099	0,39	0,008	0,49	0,014

Примечание: TIME (от англ. tumor immune microenvironment) — иммунное микроокружение опухоли; жирным шрифтом выделены статистически значимые различия (p <0,05).

 

Так, повышение стадии с учётом рецидива заболевания и глубины инвазии сопровождается формированием статистически значимой умеренной прямой корреляции с участием макрофагов: между CD206 паренхимы и FOXP3 стромы, CD68 паренхимы и CD206 стромы, а также CD68 паренхимы и FOXP3 стромы. Увеличение количества статистически значимых корреляционных взаимосвязей между показателями локального иммунитета паренхимы и стромы с 2 до 7 при нарастании стадии и до 6 при увеличении глубины инвазии, по-видимому, свидетельствует о вовлечении в прогрессирование опухоли иммунных клеток макрофагального и лимфоцитарного рядов, содержащихся в строме. Что касается экспрессии FOXP3 в паренхиме и строме, прямая корреляция средней силы сохраняется при любой из исследованных стадий и глубине инвазии, это же относится и к CD206.

Итак, анализ состояния ВКМ и иммунного микроокружения при раке вульвы с различной распространённостью опухолевого процесса позволил выявить ряд факторов, зависящих и не зависящих от неё. В частности, экспрессия ММР-2 и её ингибитора связана с глубиной инвазии опухоли, экспрессия FOXP3 и CD206 нарастает при увеличении стадии заболевания, CD68 — при нарастании как стадии, так и глубины инвазии, но ни один из исследованных факторов не меняется при рецидивировании опухолевого процесса.

При проведении множественного корреляционного анализа с включением рецидива в качестве ковариаты всё же отмечено, что он характеризуется увеличением количества корреляционных связей между показателями локального иммунитета паренхимы и стромы, что может указывать на её вовлечение в процесс рецидивирования путём активации макрофагов типа М2 и Т-регуляторных лимфоцитов, обладающих иммуносупрессивным и ростостимулирующим действием.

Обнаруженные взаимосвязи в основном являются прямыми слабыми и средней силы и, по-видимому, характеризуют взаимообусловленность процессов локальной иммуносупрессии и разрушения ВКМ, возможно, при участии опухолевых стволовых клеток, нарастание количества которых при увеличении глубины инвазии, стадии и при рецидивировании описано нами ранее [6].

В литературе показано повышение экспрессии ММР-2 и ММР-9, а также их ингибиторов при трансформации интраэпителиальной неоплазии VIN I–III в рак вульвы [7]. Если по уровням экспрессии ММР наши данные соответствуют приведённым этими авторами, то значения ингибитора TIMP-2 в нашем исследовании оказались существенно ниже, и, кроме того, нами выявлено выраженное снижение данного показателя при наибольшей глубине инвазии опухоли на фоне возрастания уровня ММР-2, что укладывается в картину усиления лизиса ВКМ.

С учётом того, что ММР-2 в отличие от ММР-9 обладает способностью разрушать фибриллярный коллаген, способствующий угнетению пролиферации клеток [8], полученные нами данные характеризуют дисбаланс между ферментом и его ингибитором как один из механизмов прогрессирования рака вульвы. Уровень ММР-9 не менялся при нарастании глубины инвазии опухоли, хотя в литературе нередко обе эти ММР упоминают в сходном контексте как желатиназы, вызывающие разрушение коллагена IV типа, имеющие общие субстраты и проявляющие сходные виды активности [9]. Тем не менее, на моделях клеточных линий ретинобластомы описаны различные виды активности ММР-2 и ММР-9, причём ММР-2 была связана с синтезом трансформирующего фактора роста-β1 опухолевыми клетками, а ММР-9 — преимущественно с продукцией фактора роста эндотелия сосудов [10].

ММР продуцируются не только опухолевыми клетками, но и макрофагами. Однако описана и обратная корреляция экспрессии ММР-2 и ММР-9 с присутствием опухоль-ассоциированных макрофагов при исследовании уровня в первичных и метастатических опухолях полости рта [11, 12].

Опубликовано исследование о взаимодействии факторов ВКМ с М2 и FOXP3+ Т-regs при уротелиальном раке, в котором авторы выделяют ведущую роль стромальных Т-regs и М2 [13], что отмечено и нами при раке вульвы. Так, в строме опухоли при увеличении стадии и глубины инвазии зарегистрировано повышение количества макрофагов, экспрессирующих СD206 в отличие от СD68, уровень которых не менялся. В паренхиме опухоли М2 (СD206+) составляют только часть общего количества макрофагов (СD68+), тогда как в строме практически все макрофаги представляют собой М2.

Судя по данным литературы, присутствие макрофагов именно в строме опосредует иммуносупрессию, реализуемую через привлечение FOXP3+ Т-regs, а также секрецию цитокинов, в частности трансформирующего фактора роста-β, который, в свою очередь, стимулирует синтез ММР, миграцию клеток и эпителиально-мезенхимальный переход. Интересно, что содержание Т-regs в паренхиме рецидивных опухолей оказалось меньше, чем в первичных опухолях II стадии, а при анализе с учётом различной глубины инвазии их максимальное содержание выявлено в строме (при инвазии >8 мм), но не в паренхиме. В недавно опубликованной работе в качестве нового прогностического маркёра при раке вульвы предложен высокий уровень клеток T-regs, инфильтрирующих строму опухоли и экспрессирующих COX-2 [14].

Выводы

1. Показатели внеклеточного матрикса MMP-2, TIMP-2 и иммунного микроокружения CD68+, CD206+ макрофагов, FOXP3+ T-regs играют роль в прогрессировании рака вульвы и могут быть использованы для прогнозирования течения заболевания
2. Рецидивирование опухолей вульвы связано с иммунным микроокружением в меньшей степени, чем нарастание стадии заболевания.

 

Участие авторов. Е.Ю.З. — написание статьи; Е.П.У. — проведение иммуногистохимического анализа и обработка результатов; Е.М.Н. — руководство работой; Н.М.А. и Е.В.В. — сбор и анализ клинических данных.
Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке государственного задания «Разработка прогностических и предиктивных алгоритмов на основе выявления новых иммунологических и молекулярно-генетических характеристик злокачественных опухолей и их микроокружения», номер регистрации №121031100251-9 от 2021 г.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной ­статье.
Благодарность. Выражаем благодарность Александре Александровне Демидовой — доктору медицинских наук, доценту, заведующей кафедрой медицинской и биологической физики Ростовского ГМУ за помощь в статистической обработке ­данных.

About the authors

Elena Yu. Zlatnik

National Medical Research Center of Oncology

Author for correspondence.
Email: elena-zlatnik@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1410-122X

M.D., D. Sci. (Med.), Prof., Chief Researcher, Laboratory of Immunophenotyping of Tumors

Russian Federation, Rostov-on-Don, Russia

Elena P. Ulyanova

National Medical Research Center of Oncology

Email: uljanova_elena@lenta.ru
ORCID iD: 0000-0001-5226-0152

Researcher, Laboratory of Tumor Immunophenotyping

Russian Federation, Rostov-on-Don, Russia

Eugenia M. Nepomnyashchaya

National Medical Research Center of Oncology

Email: evgeniyamarkovna@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0521-8837

M.D., D. Sci. (Med.), Prof.

Russian Federation, Rostov-on-Don, Russia

Nina M. Abdullaeva

National Medical Research Center of Oncology

Email: kurbanovanina416@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7364-1963

Junior Researcher, Depart. of Tumors of the Reproductive System

Russian Federation, Rostov-on-Don, Russia

Ekaterina V. Verenikina

National Medical Research Center of Oncology

Email: iftrnioi@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1084-5176
SPIN-code: 6610-7824

M.D., D. Sci. (Med.), Head of Depart., Depart. of Tumors of the Reproductive System

Russian Federation, Rostov-on-Don, Russia

References

Supplementary files