Markers of tumor cell proliferation in cancerous tumors of the larynx

Full Text

Одним из ключевых клинико-мор­фологических параметров раковой опу­холи, наряду с инвазивностью, степе­нью анаплазии, васкуляризацией, апоптозом, считается интенсивность пролиферации в клетках новообразова­ния [12, 21]. Рост пролиферативной ак­тивности раковых клеток в конечном счете ведет к появлению мультиклональных субпопуляций и к увеличению шан­сов того, что некоторые из них приоб­ретут способность к метастазированию [27]. Имеются различные подходы в оценке интенсивности клеточного цик­ла в опухолях. Традиционными методами являются подсчет митотического индек­са, индекса включения тимидина [22] и проточная цитометрия, выявляющие клетки, находящиеся в фазе синтеза клеточного цикла. Достаточно новый подход к исследованию кинетики клет­ки — это простое серебрение белка, ассоциированного с ядрышковым орга­низатором (AgNOR) [20].

В последние годы для изучения про­лиферативных процессов в опухоли ис­пользуется иммуногистохимический анализ молекул, играющих важную роль в клеточном цикле [5]. К ним относятся белки Кі-67, МРМ-2, PCNA, ряд циклинов и др. Гибридомные технологии позволили получить моноклональные антитела, выяляющие эти молекулы в парафиновых и криостатных срезах раз­личных опухолей человека. PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen — антиген ядер пролиферирующих кле­ток), ядерный белок с молекулярной массой 36 кДа, является вспомогатель­ным полипептидом дельта ДНК-поли­меразы [9]. PCNA был впервые выделен Miyachi [17] из сыворотки пациентов с I системной красной волчанкой. Содержа­ние PCNA в ядрах повышается в S-G2 -фазах клеточного цикла и отсутствует в фазе Go.

Другой ядерный антиген Кі-67 экс­прессируется во всех активных фазах цикла [7] и быстро разрушается по его окончании [8]. Как и PCNA, этот анти­ген выявляется при иммуногистохими­ческом исследовании в ядрах пролифе­рирующих клеток и отсутствует в покоящихся клеточных элементах нор­мальных тканей. Антитела к другому маркеру — белку МРМ-2 — окрашива­ют цитоплазму клеток, находящихся в фазе митоза. МРМ-2 антиген синтези­руется в течение интерфазы и фосфо­рилируется в М-фазе.

В ряде опухолей человека найдена корреляция между количеством клеток, окрашенных PCNA, Кі-67 (индекс Кі-67 или PCNA ) и степенью гистопатоло­гической дифференцировки. Увеличение индекса PCNA прямо коррелирует с частотой метастазирования опухоли в регионарные лимфатические узлы [26].

Индекс мечения PCNA использует­ся для прогноза ответа на лучевую и химиотерапию. Лучший ответ на облу­чение отмечен у больных с высоким индексом PCNA в раковых опухолях шейки матки [19] и гортани [18]. Tsuji Т. и соавт. [24] обнаружили снижение экс­прессии PCNA после химиотерапии ро­тоглоточного рака, что позволило им оценивать ответ раковых клеток на антибластомные препараты последователь­ным измерением индекса PCNA. В то же время работ, касающихся пролифера­тивной активности клеток рака горта­ни, в литературе недостаточно, и их результаты противоречивы [4]. Корреля­ция между индексом PCNA и гистопа­тологической дифференцировкой опу­холи показана рядом авторов [12, 14], хотя в исследованиях других подобная закономерность не обнаружена [18, 21].

Целью нашего исследования являлось изучение закономерностей пролиферативных процессов, происходящих в клетках рака гортани.

Материалом для иммуногистохими­ческого исследования служили криостатные и парафиновые срезы 66 плос­коклеточных раков и нормальный эпителий гортани, не пораженный опу­холью (см. табл.). Использовались следу­ющие моноклональные антитела: 1) клона PC 10 (DAKO) к антигену ядер пролиферирующих клеток (PCNA); 2) МКАТ клона Кі-67 (DAKO); 3) кло­на МРМ-2 (DAKO). Индекс пролифе­рации подсчитывали с использованием морфометрической окулярной сетки в 20 полях зрения, при этом учитывали 500 клеток [1|. Мы считали ядра пози­тивно окрашенными при реакции лю­бой интенсивности. Статистическую об­работку производили с помощью критерия Вилкоксона— Манна—Уитни. В качестве системы визуализации применяли стрептавидин-биотиновый ме­тод в наборе LSAB+ (DAKO); перокси­дазу проявляли раствором диаминобен­зидина или аминоэтилкарбазола.

 

Распределение больных по полу, возрасту и локализации новообразований

	Число пациентов
	абс.	%
Пол мужчины	65	98,5
женщины	1	1,5
Возраст  < 40	3	4,6
< 60	37	56
> 60	26	39,4
Клиническая стадия II стадия	23	34,5
III стадия	28	42,5
IV стадия	15	23
Гистопатологическая дифферен­цировка G1	27	41
G2	17	25,8
G3	22	33,2
Локализация в полости гортани над связками	14	21
голосовые связки	8	12
подсвязочное пространство	3	5
трансларингеально*	41	62

Примечание. * Опухоль занимает два и более отдела в полости гортани.

 

Гистологическую дифференцировку оценивали по стандартным критериям [2], а также с помощью иммуногисто­химического окрашивания на маркеры степени зрелости многослойного плос­кого эпителия [3]. Использовали анти­тела к цитокератинам № 1,2, 5, 8, 9, 10, 11, 14, 18,19, антигену G36-19 корнеодесмосом эпидермиса, антигену D40-10 кератогиалиновых гранул, F-711 и F-105 к филлагрину и профиллагрину (любезно предоставлены проф. G. Serre; Тулузский университет, Франция).

Метастазы в регионарные лимфати­ческие узлы были выявлены в 16 (24,2%) случаях, в то время как гемато­генные метастазы не обнаружились. Ком­бинированное лечение (облучение + операция) перенесли 34 (51,5%) паци­ента.

В нормальной слизистой оболочке гортани на PCNA и Кі-67 окрашивались ядра базальных клеток как многослой­ного, так и многорядного эпителиев. В целом, индексы мечения PCNA и Кі-67 оказались идентичными. Антиген МРМ-2 в нормальном эпителии не был обна­ружен. Средний индекс PCNA для ис­следуемых раковых опухолей составил 62,5±2,8%, а индекс Кі-67 -45,7±3,7%. В высокодифференцированных опухолях (степень дифференцировки Gl) PCNA-и Ki-67-позитивные ядра опухолевых клеток определялись по периферии опу­холевых гнезд и вокруг “раковых жем­чужин” (см. рис.). Белок МРМ-2 выяв­лен в цитоплазме опухолевых клеток, находившихся по периферии раковых гнезд.

В низкодифференцированных рако­вых опухолях (степень дифференциров­ки G3) PCNA и Ki-67-позитивные ядра имели место как по периферии, так и в центре раковых гнезд. Маркер М-фазы клеточного цикла МРМ-2 был обнару­жен в цитоплазме большинства опухо­левых клеток в 8 из 15 наблюдений.

В высокодифференцированных рако­вых опухолях индекс PCNA составил в среднем 60,9±4,0%, в низкодифферен­цированных — 65,4±1,9% (Р>0,05), индекс Кі-67 -50,5±4,5% и 56±10,2% соответственно (Р<0,05).

В ряде низкодифференцированных раковых опухолей нами были выявлены цитокератины №№ 1,10, характерные для ороговевающего многослойного плоского эпителия. В этой группе опу­холей индекс пролиферации составил 66,2± 1,33% и соответствовал таковому во всей серии G3 опухолей.

При анализе пролиферации клеток умеренно дифференцированных раковый опухолей обнаружена позитивная ядерная реакция на PCNA и Кі-67 не только по периферии, но и ближе к центру опухолевых гнезд (61,2+1,4% и 62,9+1,3% соответственно). Клетки, ре­агирующие на белок МРМ-2, лежали беспорядочно по всем опухолевым плас­там, причем в каждом четвертом случае окрашивалось до 60% клеток.

 

Окрашивание ядер клеток высокодифферен­ цированного рака с помощью антител к PCNA выявляет участки опухоли с активной клеточной пролиферацией. Центральная часть ракового гнез­да не окрашена. Антитела PC 10, LSAB-метод, хромоген-диаминобензидин. х 400.

 

Для второй клинической стадии плоскоклеточного рака индекс PCNA составлял 59,3+3,3%, для третьей — 63,7+2,5% и четвертой — 64,6+2,7%. Достоверные различия были отмечены при сравнении II и IV стадий (Р<0,01), II и III стадий (Р<0,05). Индекс Кі-67 у больных во II клинической стадии был равен 64,4+0,5%, в III -43,4±4,7% и в IV — 62,7+3,7%. Наименьший индекс обнаружен в III стадии, и при его срав­нении с индексами II и IV стадий об­наружены достоверные различия (Р<0,05 и Р<0,001 соответственно).

Несмотря на то что у леченных боль­ных индекс PCNA был выше (65,6+9,1%), чем у больных, не полу­чавших радиотерапию (63,8%±1,9), раз­личий между ними не обнаружено (Р>0,05). Напротив, индекс Кі-67 раз­личался (Р<0,02), среднее его значение I у леченных больных составляло 35,0+ ±6,7%, а у нелеченных — 56,8+3,7%.

У больных с метастазами в шейные лимфатические узлы индекс PCNA в первичной опухоли был равен 65,7+0,8%, без метастазов — 63,3+2,8% (Р>0,05). Индекс Кі-67 в надсвязочных опухолях составлял 54,6+6,6%, в опу­холях связочного пространства — 58,8+8,9% (Р>0,05).

В результате анализа 66 случаев плос­коклеточного рака гортани нами пока­зано, что позитивная реакция на PQNA и Кі-67 определялась во всех изученных опухолях в виде диффузной и/или зер­нистой окраски ядер. В плоскоклеточных раковых опухолях некоторыми автора­ми описана неспецифическая цитоплаз­матическая окраска на Кі-67 [14, 28], которую мы не учитывали.

Нами показано, что в центре гнезд высокодифференцированного рака ядра клеток обычно негативны. Подобные находки ранее были обнаружены в ороговевающих раковых опухолях головы и шеи и раке шейки матки [12, 25]. В низ­кодифференцированных раковых опухо­лях число позитивных клеток, как пра­вило, увеличивалось, причем оба маркера имели тенденцию к окрашива­нию клеток по периферии опухолевых гнезд. Подобный феномен был описан Kearsley и соавт. [12], которые считали, что периферические клетки являются пролиферирующими менее зрелыми клеточными элементами, предшествен­никами более дифференцированных клеток центральной части опухолевого пласта. В наших случаях PCNA-позитивных клеток было существенно больше, нежели клеток, окрашенных на Кі-67. Это соответствует биохимическим дан­ным о более длинном по сравнению с Кі-67 периоде полужизни белка PCNA [11]. К тому же PCNA ассоциирован с процессами репарации ДНК и может экспрессироваться тогда, когда синтеза ДНК не происходит [15]. Уровень PCNA зависит не только от синтеза ДНК, но и от активности ряда факторов роста [6] и некоторых онкогенов [16]. Несмотря на эти данные, большинство авторов считают PCNA вполне надежным мар­кером клеточной пролиферации в ра­ковых опухолях.

Что касается связи индекса PCNA с клинической стадией заболевания, то нами обнаружено их различие между 11 и III (Р<0,05) и II и IV (Р<0,01) стади­ями. Для индекса Кі-67 эти различия были выше (Р<0,05 и Р<0,001 соответ­ственно), что согласуется с результата­ми одних авторов [5, 9, 10] и противо­речит сообщениям других [13, 21, 23]. Известно, что рост опухоли зависит не только от пролиферации клеток, но и от степени апоптоза, васкуляризации [28], поэтому возникшие противоречия можно частично объяснить сочетанным действием этих факторов. В части низко­дифференцированных (G3) раковых опухолей, даже при наличии в их клет­ках биохимических признаков орогове­ния, сохраняется высокий уровень пролиферации, характерный для всей этой группы.

Наши данные подтверждают имею­щиеся в литературе сведения о подав­ляющем действии облучения на проли­феративную активность клеток плоскоклеточного рака гортани, причем этот эффект улавливается только при анализе индекса Кі-67, но не PCNA. Мы согласны с мнением Gunzl и соавт. 110], что высокие значения индекса проли­ферации в плоскоклеточных раках гор­тани позволяют предсказать хороший ответ на облучение этих больных. Из-за нестабильности результатов мечения опухолевых клеток с помощью антител к МРМ-2 экспрессия этого антигена в плоскоклеточных раках требует дальней­шего исследования.

Выводы

1. В отличие от классического мито­тического индекса, индексы мечения Кі-67 и PCNA являются надежными и вос­производимыми на рутинном клиничес­ком материале показателями пролифе­ративной активности клеток раковых опухолей гортани. Исследование анти­гена Кі-67 предпочтительнее, нежели PCNA, так как более точно отражает уровень пролиферации раковых клеток.
2. Имеется обратная связь индекса пролиферации в клетках плоскоклеточ­ного рака гортани и степени дифферен­цировки опухоли.
3. Обнаружена прямая корреляция индекса пролиферации клеток плоско­клеточного рака гортани с клинической стадией болезни.
4. Предоперационная лучевая терапия вызывает значительное снижение тем­пов пролиферации клеток плоскокле­точного рака гортани.

About the authors

S. V. Petrov

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

R. N. Kulagin

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

D. E. Tsyplakov

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

O. V. Nefedov

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

V. V. Saveliev

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

A. R. Utkuzov

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

N. T. Raikhlin

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

References

Supplementary files