Phenotype of peripheral blood lymphocytes in angina

Full Text

Проблемы инфекционной иммунологии на сегодняшний день не менее актуальны, чем в предшествующие периоды научных исследований. Новые данные о механизмах межклеточного взаимодействия, процессах активации и пролиферации иммунокомпетентных клеток, роли рецептор-лигандных взаимодействий лимфоцитов требуют нового подхода к оценке иммунных реакций при инфекционных заболеваниях. Развитие гибридомной технологии позволило получить широкую панель моноклональных антител к дифференцировочным антигенам лейкоцитов и изучить роль поверхностных структур иммунокомпетентных клеток в иммунном ответе [2, 9, 11, 12].

Вопросам активации лимфоцитов придается особое внимание в связи с тем, что активация иммунокомпетентных клеток (ИКК) является одним из начальных и важных этапов иммунного ответа, и ее блокада ведет к нарушению функционирования иммунной системы в целом [4, 6, 14]. Разработаны подходы к оценке активационных маркеров лимфоцитов с помощью моноклональных антител (мкАТ) в реакции иммунофлуоресценции, и изучены изменения их экспрессии при ряде заболеваний [3, 4, 7]. Совокупность поверностных маркеров составляет фенотип лимфоцита, и его исследование позволяет в определенной мере оценить функциональное состояние ИКК [8, 12, 14].

При ангине возникают различные изменения иммунной системы, которые многие авторы характеризуют как вторичную иммунологическую недостаточность [1, 5, 7]. Вместе с тем авторами определялись лишь количественные показатели основных популяций и субпопуляций лимфоцитов, не позволяющие судить о функциональном состоянии ИКК. В последние годы благодаря успехам биотехнологии появилась возможность изучения активационных процессов в лимфоцитах при помощи моноклональных антител, однако для оценки иммунного ответа при ангине эти возможности не использовались.

Целью нашего исследования было изучение фенотипа лимфоцитов с применением моноклональных антител к дифференцировочным антигенам лейкоцитов при ангине в остром периоде и в динамике заболевания.

Под наблюдением находились 87 больных с различными формами ангины в возрасте от 15 до 56 лет. В качестве контроля обследован 51 здоровый доброволец. Нами были выделены группы больных по выраженности местного патологического процесса (лакунарная форма — у 68, язвенно-пленчатая — у 19), леченных традиционными методами.

Для исследования фенотипа лимфоцитов у больных ангинами брали венозную кровь из локтевой вены утром (в одни и те же часы) натощак в первые сутки поступления до начала лечения. Повторное взятие крови осуществляли в периоды ранней (на 7—10-й день болезни) и поздней реконвалесценции (20— 25-й день).

В работе использовали гепаринизированную кровь (12 —15 ЕД гепарина на 1 мл крови). Мононуклеарные клетки выделяли из гепаринизированной крови по методу A.Bourn (1968) на одноступенчатом градиенте фиколл-верографина, а затем отмывали их раствором Хенкса и доводили концентрацию до 2х 10^б/мл.

Иммунофенотипирование лимфоцитов производили в непрямой реакции иммунофлуоресценции с моноклональными антителами серии ИКО НПЦ “Медбиоспектр” (Москва) [ 2]. Были использованы моноклональные антитела ИКО-90 (CD3), ИКО-86 (CD4), ИКО31 (CD8), ИКО-116 (CD16), ИКО-105 (CD25), ИКО-1 (HLA-DR), 3F3 (CD72), ИКО-166 (CD45RA), ИКО-20 (CD38),

ИКО-GMl (CDllb), ИКО-92 (CD71), ИКО-147 (CD26), IPO-4 (CD95). В качестве вторых антител применяли F(ab)2фрагменты кроличьей антисыворотки против иммуноглобулинов мыши, меченных флуоресцеин изотиоцианатом (F1TC).

Двухцветное маркирование лимфоцитов проводили в цельной крови в прямой реакции иммунофлуоресценции с мкАТ ИКО-86 (CD4), ИКО-31 (CD8), меченными FITC и ИКО-160 (CD95), меченными фикоэритрином (РЕ). Лизирование эритроцитов осуществляли раствором “FACS Lysing Solution” (Becton Dickinson, USA) после окрашивания клеток мкАТ.

Экспрессию CD38 антигена на CD4+ лимфоцитах определяли методом трехэтапного маркирования клеток, включающего на первом и втором этапах окраску в непрямой реакции иммунофлуоресценции с мкАТ к CD38 и F(ab)2фрагментами-FITC с последующим маркированием клеток прямо меченными мкАТ анти-СО4(ИКО-86)-РЕ.

Учет реакции иммунофлуоресценции проводили на проточном цитофлуориметре “FACScan” (Becton Dickinson, USA) в программе LYSYS II. В каждой пробе анализировали 10.000 клеток. При анализе лизированной цельной крови по боковому и малоугловому светорассеиванию выделяли гейты “лимфоцитов”, “гранулоцитов” и “моноцитов”. В гейте “лимфоцитов” регистрировали сигналы по FL1 и FL2, соответствующие флуоресценции FITC и РЕ. Для получения раздельного сигнала по флуоресценции FITC и РЕ устанавливали режим компенсации по FL1 и FL2 с помощью частиц “CalyBRITE” “Becton Dickinson, USA” в программе AutoCOMP.

Статистическую обработку полученных результатов производили с использованием программы Microsoft Exell 97 на персональном IBM-совместимом компьютере.

Анализ полученных данных (см. табл.) показал, что в остром периоде заболевания на фоне умеренного лейкоцитоза и лимфопении имела место достоверная разница между отдельными популяциями лимфоцитов по их функциональным маркерам в зависимости от выраженности и глубины местного воспалительного процесса. Так, при язвенно-пленчатой ангине наблюдалось достоверное повышение абсолютного и относительного числа СО16+лимфоцитов соответственно на 33,3% и 32,1%, HLADR+клеток — на 73,9% и 60,4%, относительного содержания СО38+лимфоцитов (включающих в себя N К-клетки, часть В-лимфоцитов, активированные Т-лимфоциты) — на 11%, CDllb+лимфоцитов (_а-цепь молекулы адгезии) — на 37,2% по сравнению с показателями здоровых лиц. При этом отмечалось снижение абсолютного и относительного количества СО26+лимфоцитов на 14,1% и 21,2% соответственно.

Содержание CD3+, СЕИ+лимфоцитов у больных данной группы имело тенденцию к уменьшению, а CDS+лимфоцитов — к повышению, что отразилось в виде достоверного снижения иммунорегуляторного индекса — ПРИ (Р<0,05).

В периоде ранней реконвалесценции на фоне нормализации содержания основных популяций и субпопуляций лимфоцитов сохранялись повышенные уровни относительного числа СО16+клеток, абсолютного и относительного числа HLA-DR+лимфоцитов; относительное содержание CD45RA+ и С095+лимфоцитов снизилось соответственно на 14,4% и 22,9%.

В периоде поздней реконвалесценции у больных язвенно-пленчатой ангиной на фоне уменьшения общего количества лимфоцитов на 18,2% (Р<0,01) наблюдались существенные изменения фенотипа лимфоцитов: достоверное снижение уровня CDS+лимфоцитов на 12% и СО4+клеток на 13,4%, а также увеличение числа CDS+лимфоцитов на 16,2%, что отразилось на снижении ИРИ на 31%. Абсолютное и относительное содержание активированных лимфоцитов с маркерами HLA-DR+ увеличивалось в 2 и 2,4 раза, CDllb+ — соответственно на 60,1% и 33%. Абсолютное и относительное число СО72+лимфоцитов уменьшилось на 44,8% и 40%, CD71 + лимфоцитов — соответственно на 40,2% и 33,3%, относительное число CD45RA+ лимфоцитов — на 16,6%, СО95+лимфоцитов — на 26,8%.

Острый период лакунарной ангины характеризовался достоверным уменьшением абсолютного и относительного числа СОЗ+лимфоцитов соответственно на 19,1% и 5,7%, абсолютного числа СО4+лимфоцитов на 14,1%, разнонаправленным изменением уровня лимфоцитов с активационными маркерами — повышением числа HLA-DR+ лимфоцитов на 37,3%, СИ71+лимфоцитов — на 21,6%, абсолютного и относительного числа СО25+лимфоцитов — соответственно на 26,3% и 45,8%, CD1 lb+клеток — на 17,8% и 46,8%, снижением абсолютного числа CD38+ лимфоцитов на 21,2%, абсолютного и относительного числа CD45RA+ лимфоцитов — на 34,1% и 14,4%, CD26+ клеток — на 19% и 11%, СО95+клеток — на 37,2% и 12,1%.

 

Фенотип лимфоцитов при ангине в динамике заболевания (М±т)

Показатели	Здоровые (п=51)	Динамика заболевания						Р2-3	Р4-5	Р6—7
		острый период		ранняя реконвалесценция		поздняя реконвалесценция
		язвенно-пленчатая 61=19)	лакунарная (п=68)	язвенно-пленчатая (п=9)	лакунарная (п=30)	язвенно-пленчатая (ii=8)	лакунарная (п= 16)
	1	2	3	4	5	6	7
Лейкоциты, 109/л	4,88±0,18	8,88±0,77***	7,63+0,24***	5,79+0,64	5,38+0,25	5,52+0,83	5,37+0,31	> 0 05
Лимфоциты, 109/л %	1,84±0,09 38,70±1,38	1,91±0,17 23,20±2,30***	1,59+0,07* 23,70+0,80***	2,08+0,25 36,43+2,37	2,14+0,12 40,40+1,70	1,79+0,26 31,67+2,17**	2,08+0,15 39,81+2,97	> 0^05 > 0 05	у U,Uj > 0,05 / Л	> 0,03 > 0,05
CD3, 109/л%	1,36±0,05 73,07±1,23	1,33±0,12 69,30±1,76	1,10+0,06* 68,94+1,01*	1,44+0,15 70,71+4,59	1,65+0,12 76,57+1,74	1,21+0,22 64,33+2,45**	1,53+0,11 73,44+1,91	> 0,05 > 0 05	> 0,05 < п П]	0,03 > 0,05
CD4, -109/л %	0,78±0,04 43,09±0,99	0,78±0,08 40,95±2,00	0,67+0,05 42,09±0,87	0,81+0,12 39,86+4,15	0,99+0,08** 46,00+1,87	0,67+0,10 37,33+2,29*	0,80+0,04 39,06+2,05	> 0,05 > 0,05	> 0,05 > 0 05	и,из > 0,05 3> 0 05
CD8, 109/л %	0,56±0,02 29,84±1,06	0,62±0,07 32,75±1,39	0,51±0,03 31,71+0,74	0,52+0,08 24,86+3,71	0,64+0,05 30,40+1,74	0,61+0,08 34,67+2,31*	0,67+0,09 31,06+2,41	> 0,05 > 0,05	> 0,05 > 0 05	> 0,05 > 0 05
Tx/Ts	1,54±0,08	1,30±0,10*	1,47+0,06	1,86+0,58	1,64+0,09	1,07+0,01***	1,39+0,12	> 0,05	< 0 05
CD16, 109/л%	0,27±0,02 14,42±1,04	0,36±0,04* 19,05±2,12*	0,27±0,01 16,99±0,84**	0,21+0,04 10,29+1,78*	0,25+0,03 12,10±1,56	0,30+0,07 17,33+4,62	0,30+0,04 14,13+1,98	< 0,05 > 0,05	> 0,05 > 0 05	> 0,05 > о 05
HLA-DR, 109/л%	0,23±0,02 12,74±0,81	0,40+0,04*** 20,44+1,24***	0,24+0,02 17,12+0,92**	0,48+0,11* 23,57+5,34*	0,55+0,08*** 30,74+3,01***	0,64+0,15** 32,67+4,04***	0,60+0,12** 30,07+4,24***	< 0,01 < 0,05	> 0,05 > 0 05	> 0,05 <0 05
CD25, 109/л%	0,19±0,02 10,62±0,94	0,22+0,03 11,75±1,09	0,24±0,01* 15,49+0,70***	0,31+0,06 13,86+2,37	0,33+0,04** 15,33+1,38**	0,23+0,05 11,67+1,01	0,25+0,03* 13,13+1,49	> 0,05 < 0,01	> 0,05 > 0 05	> 0,05 > 0 05
CD72, 109/л%	0,16±0,01 8,79±0,96	0,18+0,02 9,15+0,79	0,15±0,01 9,48+0,44	0,22+0,05 10,71+1,93	0,17+0,02 8,53+1,03	0,09+0,01** 5,33+0,14**	0,12+0,02 6,31+0,99*	> 0,05 > 0,05	> 0,05 > 0 05	> 0,05 > 0 05
CD71, 109/л%	0,15±0,02 7,96±0,74	0,16+0,02 8,65+1,03	0,15±0,01 9,68+0,41*	0,19+0,05 8,71+1,63	0,21+0,02* 10,37+2,10	0,09+0,02* 5,33+0,87*	0,11+0,01* 5,88+0,85*	> 0,05 > 0,05	> 0,05 > 0 05	> 0,05 > 0 05
CD38, 109/л%	0,99±0,08 52,48±1,66	1,06+0,09 58,20+2,45*	0,78+0,03* 49,90+1,43	1,06+0,22 50,50+4.32	1,00+0,06 48,33+2,65	1,00+0,20 48,50+2,30	0,92+0,08 44,64+3,33*	< 0,01 < 0,01	> 0,05 > 0 05	> 0.05 > 0 05
CDllb, 109/л%	0,45±0,04 24,20+1,35	0,59+0,08 33,20+2,31***	0,53+0,02 35,53+0,76***	0,59±0,12 26,40+4,03	0,62+0,07 30,83+1,90**	0,72+0,14* 32,50+0,83***	0,77+0,04*** 39,38+3,21**	> 0,05 > 0,05	> 0,05 < 0 05	> 0,05 < 0 05
CD45RA, 109/л%	1,79±0,18 90,00±1,25	1,42+0,24 85,60±2,18	1,18+0,05*** 77,00+1,59***	1,70+0,25 77,00+1,36***	1,65+0,10 79,21+2,64**	1,34+0,12* 75,04+1,46***	1,51+0,11 74,67+3,43***	> 0,05 < 0,01	> 0,05 > 0,05	> 0,05 > 0 05
CD26,109/л%	0,90±0,08 52,00±2,62	0,77+0,08* 41,00+3,73**	0,73+0,05** 46,32+1,21***	1,02+0,14 48,14+1,93	1,05+0,07 49,03+2,01	0,87+0,16 46,33+3,75	0,90+0,07 44,81 + 2,83*	> 0,05 > 0,05	> 0,05 > 0,05	> 0,05 > 0 05
CD95, 109/л%	1,27±0,13 64,25±4,7$	1,30±0,14 65,30+2,57	0,80+0,03*** 56,88+1,61*	1,06+0,19 47,33±2,26**	1,26+0,06 60,28+1,67	1,01+0,23 47,00+3,89**	1,07+0,06* 51,91+3,33*	< 0,01 < 0,01	> 0,05 > 0,05	> 0,05 < 0,001

Примечание. *Р<0,05, ** Р<0,001, Р<0,0001 по сравнению с данными здоровых. В остальных случаях Р>0,05.

 

В периоде ранней реконвалесценции у больных данной группы отмечались дальнейшее повышение относительного содержания HLA-DR+ лимфоцитов на 30,4% и значительное увеличение их абсолютного количества в 2,3 раза при сохраняющихся высоких абсолютных и относительных показателях CD25+ и CDllb+лимфоцитов, сниженных относительных значениях CD45RA+icneTOK. По сравнению с показателями острого периода заболевания увеличилось абсолютное и относительное содержание СБ38+лимфоцитов на 40,1% и 30,3%, СО95+клеток — на 57,5% и 6% соответственно.

В периоде поздней реконвалесценции на фоне нормализации общего числа лейкоцитов, лимфоцитов и их основных популяций и субпопуляций (CD3 + , CD4+, CD8+, CD16+) у больных лакунарной ангиной сохранялось отличие по сравнению со здоровыми лицами в содержании лимфоцитов с экспрессией активационных и ряда дифференцировочных антигенов лейкоцитов: достоверно высокое абсолютное и относительное содержание HLA-DR+ и CDllb+лимфоцитов, высокое абсолютное количество СО25+лимфоцитов, сниженное относительное содержание CD72+, CD71+, CD45RA+, CD26+, СЭ38+лимфоцитов при уменьшении абсолютного и относительного содержания СИ95+лимфоцитов.

Результаты фенотипирования лимфоцитов у больных лакунарной и язвеннопленчатой ангиной в динамике заболевания позволяют выделить среди исследованных популяций ИКК по дифференцировочным антигенам наиболее значимые изменения экспрессии на лимфоцитах активационных маркеров

HLA-DR, CD25, CD71, CD26, CD38, CD95, CD 11b, CD45RA. Однако экспрессия этих маркеров на лимфоцитах больных ангиной неоднозначна в зависимости от характера местного воспаления и фазы инфекционного процесса.

В острой фазе заболевания с развитием общеинфекционного токсического синдрома независимо от характера местного воспалительного процесса наблюдалась лейкоцитарная реакция с повышением числа лейкоцитов и снижением числа лимфоцитов. На этом фоне у больных язвенно-пленчатой ангиной активация ИКК на антигенное воздействие сопровождалась увеличением экспрессии только HLA-DR антигена в отличие от аналогичного показателя при лакунарной ангине, при которой на фоне активационных процессов лимфоцитов имело место увеличение экспрессии HLA-DR, CD25, CD71 антигенов, что является характерной чертой полноценной активации ИКК лимфоидного ряда [4]. Отсутствие экспрессии рецепторов к IL-2 и трансферрину ведет к блокаде последующей пролиферации клеток и, следовательно, к нарушению иммунного ответа на конкретный антиген.

Известно, что в передаче активационного сигнала помимо Т-клеточного рецепторного комплекса участвуют антигены CD45RA [10]. Активация Т-лимфоцитов сопровождается изменением фенотипа клеток СО45КА+(“наивные, непримированные”) на CD45RA+ (“клетки памяти”)При лакунарной ангине в остром периоде снижается содержание “наивных” лимфоцитов в отличие от показателей при язвенно-пленчатой форме, что свидетельствует об активации Т-лимфоцитов в первой группе больных. На отсутствие активации Т-лимфоцитов и их субпопуляций у больных язвенно-пленчатой ангиной указывает отсутствие экспрессии CD95 антигена на CD4+ и CDS+лимфоцитах при двухцветном окрашивании клеток. Активация лимфоцитов, по данным Miyawaki Т. и соавт. [13], сопровождается экспрессией Fas/APO-1 (CD95) антигена, что наблюдалось у больных лакунарной ангиной в виде повышения числа CD4+/CD95+ и CD8+/CD95+ лимфоцитов.

В периоды ранней и поздней реконвалесценции у больных лакунарной ангиной сохранялась активация лимфоцитов (высокое абсолютное и относительное содержание HLA-DR+, CD25+ лимфоцитов), что свидетельствовало об активном процессе со стороны иммунной системы. У больных язвенно-пленчатой ангиной в динамике заболевания экспрессия лишь HLA-DR антигена на лимфоцитах оставалась на повышенном уровне, что, по-видимому, является особенностью данной формы заболевания. Однако на поздних сроках содержание лимфоцитов с рецепторами к трансферрину (CD71+) у больных ангиной достоверно уменьшилось независимо от выраженности местного воспалительного процесса, а экспрессия CD72 антигена (пан-В-клеточный маркер, лиганд CD5 антигена на Т-лимфоцитах, участвует в активации продукции IL-2 и экспрессии рецептора к IL-2) значительно снизилась в обеих группах больных. Снижение экспрессии CD71 и CD72 антигенов на лимфоцитах у больных ангиной на 20—25-й день от начала заболевания может служить в определенной мере показателем иммуносупрессии при данной патологии и требует включения иммуномодулирующих препаратов в комплексную терапию больных ангиной.

Таким образом, определение активационных маркеров и ряда дифференцировочных антигенов лейкоцитов позволило выявить у больных ангиной изменение фенотипа лимфоцитов как в острой фазе заболевания, так и в периоды ранней и поздней реконвалесценции.

ВЫВОДЫ

1. У больных ангиной независимо от формы заболевания наблюдается увеличение количества лимфоцитов, экспрессирующих активационный маркер HLA-DR. При лакунарной ангине имеет место активация лимфоцитов, проявляющаяся увеличением экспрессии HLA-DR, CD25, CD71 антигенов.
2. При язвенно-пленчатой ангине активация лимфоцитов сопровождается увеличением экспрессии только HLA-DR антигена.
3. На поздних сроках наблюдения (20 — 25-й день болезни) у больных ангиной независимо от характера местного патологического процесса сохраняется высокое содержание HLA-DR+ лимфоцитов на фоне снижения CD72+ лимфоцитов и нарушения экспрессии рецептора к трансферрину (CD71+), что свидетельствует о наличии супрессии иммунной системы в периоде поздней реконвалесценции.

About the authors

I. G. Mustafin

Казанский государственный медицинский университет; Республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИДом; НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Москва

V. Kh. Fazylov

Казанский государственный медицинский университет; Республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИДом; НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Москва

A. O. Baryshnikov

Казанский государственный медицинский университет; Республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИДом; НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Москва

References

Supplementary files