Structural studies of fibrinolysis: how to disassemble a clot

Full Text

Известно, что фибринолитическая система действует через плазмин-активную протеазу, которая образуется из связанного с фибрином плазминогена под действием его активаторов, к числу которых относятся тканевый (тПА) и урокиназный (уПА) типы. Плазмин в определенных местах расщепляет фибрин, образуя растворимые фрагменты. Благо­даря достаточно серьезному их изучению была создана молекулярная модель рас­щепления полипептидной цепи [4, 23, 25]. Растворимые продукты деградации фиб­рина были исследованы в том числе и методом трансмиссионной электронной микроскопии, позволявшей судить об их строении [31]. Трехмерные изображения некоторых фрагментов фибриногена, полученные с высокой степенью разре­шения, дали богатую информацию о процессах связывания с фибрином раз­личных белков и о некоторых механиз­мах фибринолиза [26, 36].

Как скорость распада фибрина, так и структура его растворимых фрагмен­тов частично определяются строением са­мой фибриновой сети. При превраще­нии фибриногена в фибрин активация плазминогена под действием тПА идет быстрее, и скорость этой реакции су­щественно зависит от особенностей структуры фибрина. Например, в сгуст­ках, образованных из толстых нитей, превращение плазминогена в плазмин под влиянием тПА и распад этих сгуст­ков происходят быстрее, чем когда они состоят из тонких нитей [1, 16, 35]. Од­нако при других условиях сгустки из толстых волокон могут растворяться медленнее [6], так что эксперименталь­ные условия и методы измерения ско­рости лизиса нужно выбирать очень ос­торожно [21]. Вдобавок ко всему сгустки фибрина из патологически тонких во­локон, образуемых некоторыми ано­мальными фибриногенами, обнаружи­вают пониженную способность связывать плазминоген и низкую скорость фибринолиза [14, 20, 29]. Чтобы объяс­нить эти разнообразные наблюдения и понять молекулярные основы фибрино­лиза, нужно больше знать о физических изменениях в фибриновом матриксе, которые предшествуют его растворению.

В настоящей работе обобщены резуль­таты недавних экспериментов с исполь­зованием трансмиссионной и сканиру­ющей электронной микроскопии, а также конфокальной световой микро­скопии, которые дают важную инфор­мацию о структурных изменениях фиб­ринового полимера в ходе его дезорга­низации. Многие из этих результатов оказались неожиданными и навели на мысль о некоторых новых возможных молекулярных механизмах фибринолиза.

Общепринятая макроскопическая модель физических изменений в нераст­воримом фибрине по ходу его плазми­новой деградации основана на том, что фибриновый сгусток расщепляется сна­ружи внутрь с послойным высвобожде­нием продуктов распада [7, 25]. Такое представление сложилось из характерис­тики белков, полученных путем расщеп­ления предварительно лиофилизирован­ных и измельченных частиц фибрина. При изучении динамики фибринолиза с помощью конфокальной лазерной ска­нирующей флюоресцентной микроско­пии было также обнаружено, что плаз­миновая деградация сгустка проявляется последовательным послойным уменьше­нием его размера [11, 12]. Наблюдаемое в процессе лизиса сгустка резкое усиле­ние связывания плазминогена и тПА ограничивается тонкой каймой около фронта лизиса, а изменения, сопровож­дающие деградацию, сосредотачивают­ся в еще более узкой смежной полосе.

Были разграничены две последова­тельные фазы лизиса [11]. В ходе первой фазы, прелизиса, плазминоген накапли­вается на поверхности сгустка в резуль­тате увеличения его сродства, обуслов­ленного открытием С-концевых лизи­новых центров связывания в местах образования первых плазминовых “на­сечек”. При этом почти не видно ника­ких физических изменений. Во второй фазе, фазе окончательного лизиса, фиб­риновая сеть становится подвижной,
разрушается и быстро исчезает. Иссле­дование лизиса фибрино-тромбоцитар­ных тромбов, проведенное с использо­ванием ультраструктурного подхода, в основном было посвящено регуляции процесса под действием ингибитора ак­тиватора плазминогена [15].

На уровне отдельных фибриновых волокон, как тонких, так и толстых, для объяснения результатов экспериментов была предложена модель расщепления сгустка снаружи внутрь [1]. Иными сло­вами, было предположено, что плазмин сначала удаляет поверхностный слой волокна, образуя по ходу переварива­ния все более тонкие нити. Эта же идея легла в основу модели фибринолиза, разработанной с целью предсказания способности сгустка пропускать через себя жидкость, в том числе содержащую тромболитические препараты [21, 22].

Рис. 1. Сканирующая электронная микроскопия поверхностей расщепляемого сгустка. Образцы исследовались на разных сроках после нанесения плазмина на поверхность сгустка. Сгустки, в которых переваривание вызывалось добавлением тПА, выглядели точно так же.А — контрольный сгусток до переваривания, В — ранняя стадия переваривания (0,2 Ед/мл плаз­мина, 30 минут), С — промежуточная стадия (0,2 Ед/мл плазмина, 1 час), D — поздняя стадия (0,2 Ед/мл плазмина, 3,5 часа).

Исследование поверхности расщеп­ляемого сгустка методом сканирующей электронной микроскопии. При сравне­нии с контролем (рис. 1А) наиболее очевидным было появление множества свободных концов фибрина (рис. 1В). По всей поверхности сгустка как длинные, так и короткие волокна имели ровно усеченные концы. Целых волокон почти не было, большинство из них имело один слепой конец, а другим они при­креплялись к сгустку.

Вопреки ожиданиям того, что по мере переваривания фибриновые нити должны постепенно уменьшаться в диа­метре, они, наоборот, после действия плазмина становились толще (рис. 1 С, D) [28]. Это происходило потому, что пуч­ки фибрина состояли из оставшихся неразрушенными волокнистых сегмен­тов, претерпевших латеральную агрега­цию. Такой эффект можно объяснить только поперечным рассечением воло­кон, поскольку именно латеральная аг­регация, в норме происходящая в про­цессе полимеризации, ведет к образованию толстых нитей фибрина [30]. Гистограммы распределения фиб­риновых пучков по диаметру на разных стадиях переваривания показали, что по мере расщепления пик сдвигался в сто­рону увеличения диаметра. При этом ге­терогенность пучков по диаметру также возрастала, что в совокупности объяс­няется латеральной агрегацией попереч­но расщепленных фибриновых нитей [28]. Иногда пучки фибрина были покрыты “фолликулами” различных раз­меров, которые представляли собой аг­регированные обрезки волокон (рис. 1C). Фрагментация и удаление целых сегмен­тов фибрина, а также связывание от­дельных волокон в агрегаты ведет к фор­мированию сети с большим размером пор по сравнению с контролем. Общий вид и последовательность изменений были такими же и при расщеплении сгустка смесью тПА и плазминогена.

Эти наблюдения согласуются с данными, полученными другими способа­ми. Например, по ходу полимеризации фибрина и его одновременного расщеп­ления в присутствии плазминогена и тПА мутность сначала возрастает и толь­ко затем, по мере растворения сгустка, уменьшается. Всплеск мутности иногда наблюдается и в самом начале процесса расщепления сгустка, что совпадает с преходящим появлением в этот момент очень толстых волокон. К аналогичному выводу приводят измерения жесткости сгустка во время фибринолиза с крат­ковременной фазой гиперригидности, предшествующей его растворению [13].

Изучение продуктов, удаляемых при расщеплении. Структуру растворимых продуктов переваривания фибрина изу­чали методом трасмиссионной элект­ронной микроскопии с негативным кон­трастированием [28]. Фрагменты, отли­чающиеся по размеру и форме, были очень разнообразны, однако их набор был одинаковым после прямого пере­варивания плазмином или расщепления смесью плазминогена и тПА. Самым уди­вительным было наличие очень больших частиц, высвобождаемых из сгустка. Наиболее крупные продукты состоят, по-видимому, из множества разных фрагментов фибриновых пучков, обра­зуя структуры размером несколько мик­рон и более (рис. 2А). Концы этих обра­зований часто ровно обрублены, что указывает на перпендикулярный харак­тер разреза по отношению к оси воло­кон (рис. 2С). В ранних переварах при низкой концентрации плазмина фиб­риновые пучки иногда сохраняют свою общую форму. Можно даже различить от­дельные волокна и поперечную исчерченность с периодом 22,5 нм (рис. 2В), хотя в большинстве случаев обычный для фибрина узор не определяется. После более продолжительного переваривания появляются рыхлые аморфные аг­регаты, состоящие из более мелких частиц и образующие замысловатые ажурные сети (рис. 2В). В этих агрегатах почти не обнаруживаются отдельные волокна, хотя размер агрегатов и их порозность свидетельствуют о том, что они состоят из нескольких слившихся недорасщепленных волокон или протофиб­рилл.

В индивидуальных волокнах, которые обнаруживались во всех образцах раство­римого перевара, нередко удавалось раз­личить детали их структуры [28]. Обыч­но эти волокна имели компактную латеральную упаковку в центре, но раз­ветвлялись на тонкие волоконца по кра­ям и на концах. При негативном кон­трастировании биологических структур распределение контраста обычно отра­жает картину плотности белка. Более темные области, соответствующие мень­шей плотности белка, в некоторых участках этих волокон объясняются фор­мированием брешей на месте белка, уда­ленного при расщеплении (рис. 2 В). Есть и более яркие участки с высоким со­держанием белка, представляющие со­бой, возможно, места связывания плаз­мина [33] (рис. 2В). Свободные концы пересеченных волокон выявлялись во всех образцах изучаемых сгустков, что свидетельствует о значительном преоб­ладании перерезки волокон в попереч­ном направлении (рис. 2А, С). В боль­шинстве образцов определялись также небольшие образования, которые мож­но идентифицировать как комплексы, образующиеся на поздних стадиях фиб­ринолиза (рис. 2D). В них можно разли­чить глобулярные элементы, соответ­ствующие доменам фибрин(оген)а, что позволяет идентифицировать эти ком­плексы как DD/E, DY/YD и DXD/YY [31]. Эти небольшие фрагменты преоб­ладают на самых поздних сроках пере­варивания.

Наблюдение за физическим процессом растворения сгустка в реальном масшта­бе времени с помощью конфокальной све­товой микроскопии. Лизис сгустка мы изучали методом лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, преиму­щество которой состоит в отсутствии фиксации, высушивания или окраши­вания сгустка. Процесс растворения гид­ратированного сгустка в таких условиях можно наблюдать в реальном масштабе времени, хотя разрешающая способ­ность этого метода, конечно, уступает электронной микроскопии [18]. В свето­вой микроскопии биологические объек­ты часто метятся флюоресцентным зондом, который помогает адекватно кон­трастировать и визуализировать неболь­шие структуры, однако флюоресценция по мере сканирования постепенно гас­нет, поэтому количественно оценить результаты достаточно трудно. По этой причине в наших опытах сгустки поме­чались коллоидным золотом и сканиро­вались в режиме отражения [18]. Иссле­дованию подвергались сгустки плазмы крови, так как, они, во-первых, ближе по составу и строению к сгусткам in vivo и, во-вторых, они состоят из более тол­стых волокон, которые лучше видны под световым микроскопом.

Рис. 2. Трансмиссионная электронная микроскопия с негативным контрастированием продуктов переваривания фибрина. А — пучки волокон с разветвленными концами, В — фибрин, окруженный ажурной сетью частично расщепленных протофибрилл, С — волокно с отчетливым обрезанным кон­цом: справа виден зазубренный край обрезанного волокна, слева внизу — частично отсеченный кусок волокна, D — маленькие частицы на поздних стадиях переваривания. Кружками обведены примеры комплексов DD/E.

После добавления раствора тПА с одной стороны сгустка мы наблюдали движение фронта лизиса с периодичес­ким сканированием образцов [18]. В этих опытах было отчетливо видно, что по мере удаления крупных кусков волокна разрезались поперек. Отщепленные сег­менты волокон или исчезали, или всту­пали в процесс латеральной агрегации. Как и в опытах с электронной микро­скопией, волокна не уменьшались в ди­аметре, а либо быстро исчезали, либо, наоборот, утолщались за счет того, что недорасщепленные сегменты волокон латерально агрегировали с другими во­локнами. Тонкие фибриллы отсекались и затем быстро исчезали, тогда как толстые волокна перед тем как лизиро­ваться, обычно сначала подвергались ча­стичному разрежению с формировани­ем нарастающей щели между сохранив­шейся частью волокна и остальным сгустком.

Опыты проводились со сгустками различного строения и сформированны­ми под действием разных концентраций тромбина. Строение этих сгустков харак­теризовалось количественно путем ана­лиза изображений, полученных при кон­фокальной микроскопии [18]. Скорость продвижения лизирующего фронта была выше в сгустках, образованных толстыми волокнами, по сравнению с тонкими. Однако отдельно взятые тонкие волок­на исчезали быстрее, чем толстые. Это противоречие может быть обусловлено несколькими обстоятельствами. В част­ности, большое значение имеет плот­ность волокон в сгустке. Так, нежный сгусток, образованный тонкими волок­нами, содержит гораздо больше таких волокон, чем грубый сгусток, состоя­щий из толстых волокон. Именно поэто­му суммарная скорость расщепления первого сгустка меньше, хотя одиноч­ные тонкие волокна расщепляются быст­рее толстых. Кроме того, наблюдение за| движением фронта связывания мечено­го тПА показало, что скорость переме­щения этого фронта в грубых сгустках также выше, чем в нежных. Таким об­разом, можно заключить, что скорость лизиса зависит от структуры фибрина и общей архитектоники фибриновой сети.

Представленные данные позволяют более детально рассмотреть физический процесс фибринолиза. Они показывают, что в ходе фибринолиза происходит крупномасштабное изменение трехмер­ной целостности и механической ста­бильности фибрина, совпадающее с высвобождением растворимых продук­тов деградации. Мы располагаем резуль­татами прямого наблюдения за фибри­нолитическими изменениями индиви­дуальных волокон. На этом уровне след­ствием локальной активности плазми­на являются поперечная перерезка во­локон и образование ряда больших растворимых продуктов. То обстоятель­ство, что местное действие плазмина осуществляется поперек волокна, пред­ставляется очень важным. По мере рас­щепления у волокон увеличивается чис­ло свободных концов, тогда как их диаметр меняется мало. Эти изменения увеличивают проницаемость сгустка для жидкости, что является исключительно важным для транспорта ферментов [14, 22]. Таким образом, поперечно-боковое расщепление плазмином отдельных во­локон фибрина с образованием больших пор может приводить к прогрессивному ускорению фибринолиза за счет повы­шения проницаемости сгустка. Это об­легчает доступ фермента к более глубо­ким слоям сгустка и способствует его расщеплению.

Обнаруженные нами наиболее круп­ные продукты переваривания, которые высвобождались до полного растворения сгустка, оказались крупнее и разнород­нее, чем можно было ожидать. Среди них были агрегаты нескольких фибриновых волокон, а также сегменты отдельных волокон. Самые большие растворимые производные, внутренняя структура ко­торых почти отсутствует, по своему об­щему виду соответствовали большим агрегатам фибрина, наблюдаемым при сканирующей электронной микроско­пии поверхности сгустка перед его ра­створением. Их четкие поперечно усе­ченные концы указывают на то, что они образовались вследствие бокового раз­реза. Отсутствие структурной упорядо­ченности указывает на то, что перед отщеплением они претерпели глубокую внутреннюю деградацию. Были обнару­жены и более мелкие продукты расщеп­ления, аналогичные описанным ранее [31]. Растворимые фрагменты, состоящие из обрывков целых волокон или их пуч­ков, могут появиться в результате ло­кального протеолитического пересече­ния волокон, а не вследствие равномерного действия плазмина, ко­торое проявлялось бы прогрессивным уменьшением диаметра волокон.

Скорость фибринолиза существенно зависит от размера фибриновых воло­кон и строения сети. Скорость раство­рения сгустков, состоящих из толстых волокон, больше, чем из тонких, хотя индивидуальные толстые волокна раз­рушаются медленнее. В некоторых слу­чаях неэффективный тромболиз может быть связан с формированием медлен­но расщепляемых сгустков, образован­ных тонкими волокнами.

Предположительные молекулярные механизмы. Почему сгустки, образован­ные толстыми волокнами, расщепляются быстрее, чем сгустки, состоящие из тон­ких волокон? Представленные результа­ты позволяют предположительно объяс­нить это явление [18, 20, 1, 35]. Когда плазмин в определенных местах пересе­кает волокна, то фибрин, состоящий из толстых волокон, расщепляется быстрее, потому что число разрезаемых волокон в нем меньше. Кроме того, мы предпо­лагаем, что прогрессирующая агрегация волокон в ходе плазминовой деградации может представлять собой дополнитель­ный механизм усиления и ускорения фибринолитического процесса, так как расщепление происходит латерально. Наконец, скорость перемещения фрон­та связывания тПА в расщепляемом фибрине больше в грубых сгустках, об­разованных толстыми волокнами, чем в рыхлых сгустках из тонких волокон.

Почему волокна разветвляются на концах по мере переваривания? В про­цессе переваривания фибрина чаще все­го наблюдаются волокна с компактным строением в середине и расслоением в виде веточек на концах. Разветвление и расслоение частично расщепленных во­локон можно объяснить, исходя из на­ших представлений об образовании и строении фибрина. В процессе форми­рования сгустка фибриновые протофиб­риллы начинают агрегировать латераль­но только после достижения полимером определенной критической длины [3, 5, 33]. Когда этот процесс обращается вспять при плазминовой деградации, то дезагрегация, или “разборка”, прото­фибрилл может произойти при условии, что их пересечение ведет к образованию фрагментов, которые по размеру мень­ше, чем критическая длина, необходи­мая для боковой агрегации. Вызываемая этим дезагрегация может зависеть от сте­пени поперечного сшивания альфа-це­пей, которое стабилизирует латеральную агрегацию [23].

“Переползание” плазмина поперек фибрина. Наблюдаемый ход расщепле­ния согласуется с тем, что плазминоген связывается с фибрином в том месте, где две молекулы фибринмономера со­единены конец-в-конец в составе про­тофибриллы [33], хотя сами участки свя­зывания в молекуле пока точно не локализованы. Отсюда плазмин спосо­бен достигать точки расщепления на смежных протофибриллах, образуя до­полнительные С-концевые остатки ли­зина для связывания плазмина в про­цессе расщепления [27] (рис. ЗА). Представленные результаты указывают на то, что далее молекулы плазмина пе­редвигаются латерально, то есть попе­рек волокна, расщепляя новые участки и образуя вырезанные сегменты.

Для обоснования этой концепции следует отметить, что одинаковые участ­ки связывания плазминогена по длине протофибриллы расположены на рассто­янии 22,5 нм друг от друга, тогда как точно такие же участки на соседней бо­ковой протофибрилле удалены всего на 5—10 нм (рис. ЗА). Движение плазмина поперек фибрина может происходить в результате связывания второго крингла со следующим участком на другой про­тофибрилле, прежде чем высвобожда­ется первый крингл (рис. ЗВ, D). Одна молекула плазмина образует мостик между двумя соседними цепями фибри­на. “Переползание” плазмина поперек волокна согласуется с присутствием бо­лее чем одного связывающего крингла в каждой молекуле плазмина [17], а так­же с возможностью изменения его кон­формации (рис. ЗС) [8, 10].

Дополнительным свидетельством в пользу этого механизма служит наблю­дение, согласно которому плазминоген может осаждать продукты деградации фибрина, образуя комплексы плазмино­ген— продукты деградации фибрина в со­отношении 1:2 [2]. Кроме того, будучи добавленным к полимеризующемуся фибрину, плазминоген усиливает лате­ральную агрегацию протофибрилл, способствуя образованию сгустков с более толстыми волокнами [9]. Наконец, ког­да плазминоген ковалентно сшивался с фибрином, обнаруживались образцы, в которых молекула плазминогена была связана с концами трех или четырех це­пей фибрина [33[, которые, наверня­ка, принадлежат смежным протофиб­риллам.

Рис. 3. Схема расщепления фибрина плазми­ном и его “переползание” поперек волокна.

Трехузловые структуры представляют собой от­дельные молекулы фибрина, которые связыва­ются между собой со сдвигом на 1/2 длины и образуют двунитевые протофибриллы. Показан фрагмент двух протофибрилл, агрегированных ла­терально. U-образные молекулы плазмина пока­заны в виде существа с жующей головой (протео­литический домен) и конечностями (два фибринсвязывающих участка). Конформационные изменения плазмина позволяют последовательно связываться с соседними участками фибрина по мере перемещения конечностей поперек волокна.

А — плазмин прикрепляется в месте соеди­нения конец-в-конец двух молекул фибрина. При этом не важно, где именно расположены участ­ки связывания плазмина, так как упаковка мо­лекул и симметрия фибрина обусловливают фор­мирование одинаковых участков через каждые 22,5 нм по оси и гораздо ближе — поперек волокна. Стрелками показаны главные точки расщепления, расположенные посередине цепочки, соединяю­щей домены D и Е. В — плазмин связан с фибри­ном одним кринглом — это стартовая позиция для латерального перемещения плазмина. С — конформационное изменение позволяет плазми­ну связаться со вторым участком фибрина. D — изменение конформации возвращает молекулу в исходное состояние, так что она готова к рас­щеплению новых участков или к дальнейшему “переползанию”.

Итак, предлагаемый нами “ползу­чий” механизм работает благодаря тому, что участки связывания плазмин(оген)а ближе между собой в поперечном направ­лении, чем вдоль волокна. “Переполза­ние” требует наличия двух или более фибринсвязывающих участков в моле­куле плазмина и как минимум двух раз­ных конформационных состояний плаз­мина. Протеолитическое действие плаз­мина само по себе ведет к появлению новых плазминсвязывающих центров на фибрине.

Большая часть этих исследований была обеспе­чена грантами Национальных Институтов Здоро­вья США. Я благодарен моим коллегам и сотрудни­кам, которые участвовали в этой работе: это Юрий Веклич (Yuri Veklich), Жан-Филипп Коллет (Jean-Philippe Collet), Чандрашекаран Нагаевами (Chandrasekaran Nagaswami) и Чарльз Франсис (Charles W. Francis).

About the authors

John W. Weisel

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
United States

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Rice. 1. Scanning electron microscopy of the surfaces of a split bunch. The samples were studied at different times after the application of plasmin to the surface of the clot. Clots in which digestion was induced by the addition of tPA looked exactly the same. plasmin, 1 hour), D — late stage (0.2 U/ml plasmin, 3.5 hours).

Download (924KB)

Indexing metadata

3. Rice. 2. Transmission electron microscopy with negative staining of fibrin digestion products. A - fiber bundles with branched ends, B - fibrin surrounded by an openwork network of partially split protofibrils, C - fiber with a distinct cut end: the jagged edge of the cut fiber is visible on the right, a partially cut piece of fiber is below on the left, D - small particles in the late stages of digestion . Circles circle examples of DD/E complexes.

Download (714KB)

Indexing metadata

4. Rice. Fig. 3. Scheme of fibrin cleavage by plasmin and its “crawl” across the fiber.

Download (184KB)

Indexing metadata