Термическая инактивациятканевого тромбопластина

Аннотация

Тепловая инактивация тканевого тромбопластина является реакцией сложного порядка, включающей, помимо денатурации апопротеида, дезорганизацию липидных составных частей. При нагревании в аэробных условиях окисление тромбопластина также способствует его инактивации. Хранение препаратов тканевого тромбопластина в анаэробных условиях увеличивает их биологическую стабильность.

Полный текст

Тканевой тромбопластин является инициальным фактором свертывания крови по внешнему пути, в котором участвуют фактор VII и ионы кальция. По химической природе он липопротеид, фрагмент клеточных мембран [2]. Тканевой тромбопластин,.

получаемый чаще всего из ткани головного мозга, широко используется в медицинской практике для определения протромбинового индекса и некоторых других гемо- стазиологических показателей. Выпускаемые препараты тканевого тромбопластина имеют ограниченный срок годности. Настоящее исследование направлено на изучение условии, влияющих на стабильность этих препаратов.

Препарат тканевого тромбопластина из мозга кролика получали по методу [5]. Суспензию тромбопластина готовили из расчета 10 мг/мл. В качестве субстрата использовали лиофилизированную оксалатную бычью плазму, содержащую 3,15 г/л фибриногена, а в качестве источника факторов II и X — лиофилизированную нормальную сыворотку человека, которую смешивали с 0,1 М раствором оксалата натрия в соотношениях 9:1.

Тромбопластиновое время определяли по методу [4] со следующей модификацией. К 0,1 мл бычьей плазмы приливали 0,1 мл оксалатной сыворотки человека и 0,1 мл суспензии тромбопластина. Смесь инкубировали при 37° в течение 1 мин., затем приливали 0,2 мл 0,025 М раствора хлористого кальция и рассчитывали время появления сгустка.

Исследование процесса термической инактивации начинали с анализа динамики потери активности суспензии тромбопластина при температурах от 0 до 100°. При температурах от 0 до 40 инактивация при кратковременной инкубации в пределах часа практически не наблюдается. Динамика инактивации при температурах от 60 до 100 при доступе воздуха представлена на рис. 1.

Тис. 1. Динамика тепловой инактивации тканевого тромбопластина. По оси ординат— активность тромбопластина в Ig-шкале; по оси абсцисс — время в мин.

Кинетический анализ показал, что константы скорости инактивации тромбопластина при 60 и 100° уменьшаются с течением времени, и процесс термической инактивации не может быть описан как реакция I или II порядка, то есть порядок реакции термической инактивации является более сложным.

Известно, что даже реакции термической инактивации ферментов, имеющих чисто белковую природу, в редких случаях следуют кинетике I порядка [1]. Инактивация тканевого тромбопластина, имеющего сложную липопротеидную природу, априорно может складываться из нескольких промежуточных стадий, включающих инактивацию белковой и липидной частей. При термической инактивации в присутствии воздуха, кроме денатурационных изменений, может происходить окисление кислородом воздуха.

При тех же температурах нами были рассчитаны величины энергии активации процесса инактивации по методу Паттона (1968). Эти величины колебались в пределах от 17 до 49 кДж/моль, что значительно ниже величин 167—419 кДж/моль, приводимых Паттоном для инактивации чисто белковых ферментов. Полученный результат позволяет предположить, что в процессе инактивации тканевого тромбопластина, помимо денатурации апопротеида, происходит менее энергоемкая потеря упорядоченности липидного компонента.

Для препаратов тканевого тромбопластина, инактивированных инкубацией при температурах 0, 40. 60 и 100° в течение 20 мин на образцах субстратной плазмы, растворенных в 3,15 г/л растворе фибриногена, были определены кинетические параметры по методу Скэтчарда (см. табл.).

 Кинетические параметры препарата тканевого тромбопластина

                                                                 Температура инактивации 

Показатель		0	40	60	100
Углах	(сек—1)	0,032	0,028	0,018	0,014
Kd	(М)	4,519-10-9	4,378- 10-9	4,284-10-9	4,008-10-9

Рис. 2. График Лайнуивера—Бэрка.

Как видно из таблицы и рис. 2, тепловая денатурация тканевого тромбопластина при 60 и 100° приводит к уменьшению max и не сопровождается изменением Ничто в первом приближении указывает на то, что при инактивации уменьшается число каталитически активных центров на поверхности липопротеидных мембран, а сродство оставшихся центров к субстратам существенно не изменяется.

Для выявления вклада окислительных реакций была изучена термическая инактивация тканевого тромбопластина при 60 и 100° после 5-минутного пропускания азота через суспензию тромбопластина (рис. 3).

Рис. 3. Динамика тепловой инактивации тканевого тромбопластина в атмосферном воздухе и азоте. По оси ординат — активность тромбопластина в lg-шкале; по оси абсцисс — время в мин. А — температура инактивации 60°, Б — температура инактивации 100°.

Как видно из рис. 3, в атмосфере азота термическая инактивация тканевого тромбопластина происходит медленнее, чем на воздухе. Но и после устранения атмосферного кислорода порядок реакции процесса инактивации продолжает оставаться сложным.

Исследования показывают, что инактивация тромбопластина на воздухе является сложным процессом, в котором, наряду с денатурацией белкового компонента и окислительными реакциями, имеет значение дезорганизация липопротеидных ансамблей, из которых состоит этот инициальный фактор свертывающей системы крови. Хранение препаратов тканевого тромбопластина в анаэробных условиях увеличивает их биологическую стабильность.