Application of the principles of colloidal chemistry to obtain the purest preparation of tetanotoxin

Abstract

If you take a broth culture of a tetanus bacillus and filter it through a Chamberland'a candle, then, as you know, you will get a completely transparent, sterile liquid with pronounced toxic properties.

Full Text

Если взять бульонную культуру столбнячной палочки и про­фильтровать ее через свечу Chamberland’a, то, как известно, при этом получится совершенно прозрачная, стерильная жидкость с резко-выраженными ядовитыми свойствами. Путем впрыскивания этой жидкости лабораторным животным удается вызвать у них характер­ную картину заболевания, не отличающуюся от той, которая наб­людается у животных при заражении их чистой культурой b. tetani. Метод фильтрации через свечу, примененный впервые Roux и Y е r s і n’oм на бульонной культуре дифтерийной палочки, дает та­ким образом возможность получить отдельно от тел столбнячных микробов ту субстанцию, которой микроб только и обязан своим болезнетворным действием на животный организм. Отсюда понятно и стремление всестороннее изучить эту субстанцию как c биолого­физиологической, так и с химической стороны,—стремление, кото­рое было проявлено различными исследователями тотчас, как толь­ко стало возможным иметь в руках сырой материал в виде ядови­того бульонного фильтрата столбнячных бактерий.

Наиболее ценными в этом отношении являются исследования Brieger’a и его школы. Еще в 1890 году Brieger’oм и Franke Рем были сделаны попытки выделить из профильтрованной бульонной культуры столбняка деятельное вещество тетаноток­сина в более чистом виде, чем оно находится в бульонном фильт­рате. Сущность метода Вгіеgеr’а и Fränkеlʹя сводится к тому, что они насыщали бульонный фильтрат сернокислым аммони­ем и полученный осадок диализировали для удаления солей и вы­сушивали в vacuum’e при 40°. Кроме сернокислого аммония, для получения осадка авторы применяли также алкоголь с прибавлени­ем незначительного количества уксусной кислоты. Осадок в этом случае подвергался той же обработке, что и при методе с серно­кислым аммонием. Полученный тем или другим путем осадок об­ладал резкими ядовитыми свойствами, вызывая при впрыскивании животным—белым мышам и морским свинкам—характерную кар­тину столбняка. По химическим свойствам, как и следовало ожи­дать, осадок этот оказался белковоподобным телом. По исследова­ниям Brieger’a и Frankelʹя, он дает характерные белко­вые реакции-биуретовую, милоновскую, ксантопротеиновую; его водные растворы—оптически деятельны, вращая плоскость поляри­зации влево.

Принимая во внимание, с одной стороны, способность давать белковые реакции, а с другой—ясно выраженную ядовитость пре­парата, Brieger и Fränkel называют его токсалъбумином. Названные авторы, таким образом, считают, что свойство да­вать белковые реакции и ядовитость принадлежат одной и той же субстанции полученного ими порошка, не считаясь с боле простым предположением, что порошок этот представляет из себя пеструю смесь различного рода протеиновых веществ и неизвестного нам по- своему химическому строению токсина, быть может, ничего общего с белками и не имеющего. В этом именно смысле Вгіеgеr’у и Fгänкеl’ю было сделано возражение в том же самом году Faber’ом, который указал, что белковые реакции так называемого токсальбумина зависят от посторонних токсину веществ, примеши­вающихся к нему из питательной среды при осаждении сернокис­лым аммонием.

Ряд других авторов,—Vаіllагd и Vincent, Tizzoni и Cattani, Fermi и Pernossi, Kitasato и Weyl, Ушинский, Федоров и др., работавшие с тетанотоксином,—не внесли ничего существенно-нового в методику получения более чисто­го препарата тетанотоксина, и работы их являются интересными и ценными, главным образом, в смысле обогащения наших знаний о биолого-физиологических свойствах токсина. Что касается вопроса: о химическом строении яда, то почти все указанные авторы выска­зываются за протеиновую природу тетанотоксина, указывая в то же - время на близость его к классу ферментов. Основанием для последнего взгляда служит известная лабильность токсина по отношению к действию физических агентов (температура, свет и т. д.), актив­ность его в почти-невесомых количествах, а также, между прочим, как па это впервые указали Vaillard и Vinсеnt,—способ­ность токсина увлекаться из раствора различного рода индифферент­ными осадками (фосфатами кальция, глиноземом и пр.).

Дальнейшим шагом вперед на пути к очищению столбнячного яда являются последующие работы Brieger’a него сотрудников. Через три года после того, как Вriеgеr причислил тетаноток­син к токсальбуминам, этот автор совместно с Соhn’ом внес не­которые изменения в первоначальный свой метод получения токси­на. По видоизмененному способу профильтрованный столбнячный бульон осаждается сернокислым аммонием, осадок собирается и вы­сушивается, а- затем для очищения от примесей подвергается обра­ботке уксуснокислым свинцом с небольшим количеством аммиака, диализируется и вновь высушивается при низкой t (21—22°). Полученный этим путем препарат токсина оказался значительно чи­ще, чем первый препарат Вriеgеr’а. Прежде всего, при испы­тании он не давал уже больше характерных белковых реакций; лишь от медного купороса с натронной щелочью получалось еще фиолетовое окрашивание, и кроме этой реакции, да способности осаждаться от сернокислого аммония новый препарат ничем более не напоминал белков. Также и в опытах па животных он оказал­ся самым сильным токсином, какой только был известен в то вре­мя по литературе. Минимальная смертельная доза для белой мыши,  убивающая ее в 48 часов, равнялась

На, основании полученных результатов, Brieger и Cohn заявляют, что специфический тетанотоксин не является истинным белком, так как его свойства никоим образом не соответствуют обычной характеристике белковых тел.

В дальнейшем Вriеgеrу удалось показать, что даже и свойство выпадать в осадке от сернокислого аммония вовсе не является обязательным для тетанотоксина. Оказывается, что по мере увеличения ядовитости культур в зависимости от продолжительности роста столбнячных микробов, способность токсина осаждаться от сернокислого аммония постепенно уменьшается и, наконец, совер­шенно исчезает у сильно вирулентных культур. Brieger об’ясняет это обстоятельство тем, что образование яда идет за счет пеп­тонов и альбумоз, по мере потребления которых бактериями пада­ет, а затем и вовсе исчезает зависящее от присутствия альбумоз выпадание осадка при осаждении бульона сернокислым аммонием. При неполном же израсходовании альбумоз, эти последние при осаждении их сернокислым аммонием увлекают за собой в осадок и находящийся в бульоне токсин, который сам по себе вовсе не осаждается этой солью. Следовательно, здесь дело идет о чисто-ме­ханическом увлечении токсина подобно. тому, как он увлекается и другими индифферентными осадками.

Исследования Вrіеgеr’а на этом не закончились, и вскоре он совместно с Воеr’ом опубликовал новый способ получения те­танотоксина в виде его цинкового соединения. Для этого фильтрат обрабатывается сернокислым или, еще лучше, хлористым цинком. Получающийся осадок цинкового соединения токсина не растворяет­ся в воде и потому может быть хорошо промыт ею от примесей. Растворы его в слегка подщелоченной воде или в физиологическом растворе NaCl не дают никаких белковых реакций и оптически яв­ляются недеятельными. Поэтому Brieger и Воеr считают, что их новый препарат не содержит и следов белка и не является так называемым дериватом последнего.

Таким образом Brieger, начав в своих исследованиях с утверждения, что тетанотоксин есть ничто иное, как ядовитый бе­лок, токсальбумин, в последнем своем слове совершенно отказывает­ся от этого взгляда, считая токсин во всяком случае не белком и даже не дериватом его.

Наши знания о природе тетанотоксина до настоящего време­ни чрезвычайно скудны. Oppenheimer в своей работе о ток­синах и антитоксинах следующим образом резюмирует состояние наших знаний о токсинах вообще и тетанотоксине в частности: „О химической природе токсинов нам неизвестно ровно ничего. Так же, как и энзимы, к которым они очень близки, токсины сначала бы­ли отнесены к белкам и названы токсальбуминами. Чем больше, однако, стараний было приложено к тому, чтобы их очистить, тем более склонялись к мысли, что белковые тела являются лишь трудно устранимыми примесями, и что чистые токсины, по всей вероятности,—не белковые тела в обычном смысле слова. И самому Вrіеgеr’у, который ввел понятие о токсальбуминах, удалось по­лучить препараты токсинов, которые совершенно не давали белко­вых реакций. Это—единственная черта, притом отрицательного характера, которая нам известна относительно строения токсинов. Приходится ограничиться представлением, что токсины суть тела сложного молекулярного строения, — вероятно, родственные белками, с которыми они сходятся в некоторых свойствах, в особенности же приближаются к загадочным ферментам, с которыми они имеют много общего и по реакциям, и по образу действия.

Таким образом в настоящее время мы не знаем, что пред­ставляют из себя токсины по составу, да и не можем этого знать ибо не умеем пока выделять их в чистом виде. Последняя задача была-бы облегчена, если бы мы знали хоть одно их специфическое свойство, будь то химического или физического характера, и это свойство могло-бы нам дать в руки орудие для выделения токсина в наиболее чистом виде. Для того, чтобы хоть немного приблизить­ся к разрешению этой задачи, посмотрим сначала, что представля­ет из себя тот сырой материал, из которого предстоит нам выде­лить и получить по возможности чистый препарат тетанотоксина.

Профильтрованная через свечу Chamberland’a столбняч­ная бульонная культура представляет из себя пеструю смесь химических веществ, находящихся частию в состоянии истинного раст­вора, как, напр., альбумозы, пептоны, а также и сам токсин. Здесь я считаю нужным сделать самые краткие замечания по воп­росу о том, что представляет из себя истинный раствор и так на­зываемое коллоидальное состояние вещества.

Молекулы вещества, находящегося в состоянии истинного раствора, во многих отношениях ведут себя так, как если бы веще­ство это находилось в газообразном состоянии. Законы, выведенные для газообразного состояния, во многих отношениях оказываются со­вершенно верными и для истинных растворов, в особенности, если дело идет о сильно разведенных растворах. В газообразном состоя­нии молекулы вещества, как известно, находятся в постоянном прямолинейном движении; с чрезвычайно большой скоростью они пробегают пространство, пока встреча со стенкой сосуда или другой газовой частицей не заставит их изменить направление и скорость их движения. Отдельные молекулы не связаны меж­ду собой силой взаимного притяжения, которая проявляет себя на весьма небольшом расстоянии, и газ стремится расширить­ся и занять возможно больший объем соответственно живой силе газовых частиц. Как известно, увеличивая внешнее давление, мы можем превратить газ в жидкое состояние. Переход этот есть след­ствие постепенного сближения газовых молекул между собою, так что в известный момент взаимное притяжение между частицами вступает в свои права и побеждает стремление газа к расширению. Этого притяжения затем оказывается достаточно для того, чтобы еще более сблизить частицы и образовать из них более или менее плотную массу, обладающую свойствами, присущими жидкому со­стоянию.

Молекулы вещества, находящегося в состоянии истинного раство­ра, точно так же стремятся распространиться и занять возможно больший объем, ограниченный, правда, в данном случае пределами растворителя. Частицы растворенного вещества находятся под влия­нием двух факторов: 1) притяжения частиц растворителя и 2) жи­вой силы их собственного движения. Растворенное вещество удер­живается в растворе, причем отдельные молекулы вещества оказы­ваются не связанными между собой силой притяжения, потому что молекулы растворителя притягивают их к себе е большей силой, чем сила взаимного притяжения между отдельными молекулами раство­ренного вещества. С точки зрения притяжений место, занимаемое частицей растворенного вещества, не имеет значения: где-бы внутри жидкой системы ни находилась эта частица,—везде действие при­тягательных сил на нее одинаково. Поэтому-то частицы растворен­ного вещества могут перемещаться, как будто бы они находились под влиянием энергии их собственного движения; вследствие этого растворенное вещество стремится к увеличению своего объема со­вершенно так же, как это происходило-бы с эквимолекулярным ко­личеством газообразного вещества, поставленного в те же условия относительно объема и температуры. Однако, такое состояние может существовать только до тех пор, пока силы взаимного притяжения между отдельными молекулами растворенного вещества оказываются как-бы парализованными силами притяжения со стороны молекул растворителя. Наоборот, как только последнего рода силы оказы­ваются несостоятельными вследствие перевеса над ними сил притя­жения между молекулами растворенного вещества, как это бы­вает, напр., в пересыщенных растворах,—частицы растворенного вещества притягиваются друг к другу и начинают образовывать сначала чрезвычайно мелкие, а потом и более крупные молекуляр­ные конгломераты. Этот конденсационный процесс в пересыщенных растворах протекает таким образом, что первоначально в различных точках системы образуются чрезвычайно мелкие молекулярные конгло­мераты растворенного вещества, так называемые первоначальные центры, которые затем увеличиваются в объеме, с одной стороны, путем соединения отдельных конгломератов между собой, а с другой за счет присоединения к ним находящихся в растворе и не  соединившихся между собой отдельных молекул. Результатом посте­пенного роста первоначальных центров явится, в конце концов, образование частиц, видимых простым глазом, т. е, образование осадка. Первый процесс, отвечающий образованию первоначальных центров, немного больших по величине, чем молекула, протекает аналогично реакциям в растворах и зависит от степени насыщения растворимости данного вещества. Второй же процесс, состоящий в увеличении отдельных молекулярных конгломератов, зависит от условий, которые явились следствием первого процесса. Мы можем представить себе такое положение дел, когда образовавшиеся в ре­зультате первого процесса конгломераты могут в дальнейшем уве­личиваться только путем слияния отдельных конгломератов между собой, тогда как увеличение их на счет присоединения отдельных молекул почти не имеет места, или, наоборот, увеличение идет главным. образом за счет второго процесса. Так, напр., если в пересыщенном растворе образовалось лишь очень мало первоначаль­ных центров, то они в дальнейшем могут расти почти исключи­тельно за счет присоединения отдельных молекул, так как, благо­даря своей малочисленности, эти центры находятся между собой на значительном расстоянии и потому не могут влиять друг на друга. Наоборот, при известных условиях, напр., при наличности очень сильного пресыщения раствора, с самого начала в системе возни­кают многочисленные первоначальные центры так, что на образование их из раствора извлекаются почти все молекулы растворен­ного вещества, или, вернее, такое количество их, что состояние пресыщенности раствора при этом уничтожается, и наступает, та­ким образом, равновесие между оставшимися в растворе молекулами—с одной стороны и молекулярными конгломератами—с другой.

Равновесие это определяется концентрацией получившегося раствора и степенью растворимости образовавшихся конгломератов. По­нятно, что в дальнейшем при этих условиях рост первоначальных центров может идти только путем слияния отдельных конгломера­тов между собой.

От недостаточно выясненных в настоящее время условий и действующих здесь сил процесс слияния отдельных конгломератов между собой может протекать весьма медленно. Действуют ли здесь электрические силы в виде одноименных электрических зарядов, сосредоточенных на поверхностях молекулярных конгломератов и препятствующих таким образом слиянию конгломератов между со­бой, или другие какие-то силы, но процесс дальнейшего роста конгломератов идет вперед чрезвычайно медленно, и в отдельных случаях нужны, быть может, десятки или даже сотни лет, чтобы дело дошло до своего логического конца, т. е. слияния отдельных конгломератов, до образования крупных частиц, видимых простым глазом (флокуляпия) и выпадения растворенного раньше вещества, из жидкости в виде осадка (седиментация). Таким образом мне имеем здесь дело с совершенно особенным состоянием вещества, причем самым характерным признаком этого состояния является наличность конденсационных процессов в виде медленного, но прог­рессивного роста взвешенных в жидкости молекулярных конгломе­ратов; эти конденсационные процессы приводят в конце концов к выделению бывшего в растворе вещества в осадок. Такое-то пере­ходное,—так сказать, эволютивное,— состояние и носит название коллоидальною состояния вещества. С молекулярно кинетической точки зрения между настоящими растворами и коллоидальным со­стоянием разницы нет никакой; с точки зрения равновесия суще­ственное различие заключается в том, что коллоидальное состояние представляет собой систему, в которой неизбежно, хотя и очень, медленно, происходит процесс конденсации, т. е. переход к устой­чивому равновесию, тогда как раствор является абсолютно устой­чивой системой.

Коллоидальная система состоит, таким образом, из двух со­ставных частей: 1) из жидкости и 2) из распределенного в ней в виде взвеси молекулярных конгломератов вещества. Жидкая часть носит название дисперсионной среды, а взвешенные в ней части­цы— дисперсной части. То и другое вместе называется дисперсной системой. Величина взвешенных в жидкости частиц может быть чрезвычайно различна; верхняя граница этой величины приближает коллоиды к механическим взвесям—суспензиям, а нижняя к раство­рам, и коллоиды по величине частицы занимают среднее положе­ние между суспензиями и истинными растворами. Вследствие ма­лой величины частиц и большого числа их получается огромное развитие поверхности, отделяющей дисперсную часть от дисперсион­ной среды. Чрезвычайное развитие поверхности раздела в свою- очередь ведет за собой особо важное значение различного рода по верхостных энергий и всех факторов, изменяющих величину этих энергий.

Ограничиваясь пока этими представлениями о коллоидальном: состоянии материи, обратимся теперь к нашему токсину. С точки зрения только что изложенных представлений бульонный фильтрат столбнячной культуры представляет из себя дисперсную систему, в которой в качестве дисперсной части служат, с одной стороны, интересующий нас столбнячный токсин и ряд других продуктов жизнедеятельности микробов, а с другой сложные органические ве­щества, находящиеся в каждом бульоне: альбумозы, пептоны и пр. Столбнячный токсин, возникая в результате жизнедеятельности столбнячных микробов, сразу по своем рождении попадает в среду, состоящую из очень пестрой смеси веществ, находящихся в кол­лоидальном состоянии. В силу присущего мелким частицам свойства адсорбировать приходящие с ними в соприкосновение взвешенные вещества, несомненно, токсин оседает, концентрируется на поверхно­сти взвешенных в бульоне коллоидальных частичек. Факт взаимной адсорбции коллоидов в настоящее время строго установлен, и в на­шем случае трудно лишь сказать, на каких именно коллоидальных частицах, оседает столбнячный яд в бульонной среде. Не касаясь вопроса о законах адсорбции вообще, укажем лишь, что адсорбция, помимо чисто физических причин, в значительной степени зависит также и от химического состава адсорбируемого и адсорбирующего вещества. Так как о химической природе токсина нам ничего неиз­вестно, то само собой понятно, что и о характере адсорбирующих его коллоидальных частиц говорить не приходится. Волей неволей приходится ограничиваться лишь указанием в общей форме, что токсин оседает на поверхности тех коллоидальных частиц, которые легче всего притягивают его к себе в силу физического притяже­ния, а также, быть может, и в силу некоторого слабого химиче­ского сродства. Но, как бы то ни было, токсин не распределяется равномерно по всему бульону, а занимает в нем рассеянную дис­позицию, и наша задача, следовательно, сводится к тому, чтобы рассеянные частицы собрать вместе и выделить их из бульона.

Подобно всякой другой дисперсной системе, бульонный фильтрат мы должны рассматривать, как систему неустойчивую, где взвешен­ные в дисперсионной среде коллоидальные частицы стремятся слиться в более крупные образования, выпадающие из жидкости в виде осадка. Процесс этот является результатом действия сил поверхност­ного натяжения, сосредоточенных на поверхности коллоидальных частиц и обнаруживающих свое действие при столкновениях этих частиц между собой, столкновениях, которые, как известно, постоянно происходят в дисперсионной среде.

Представим себе взвешенные в жидкости коллоидальные частицы в виде образований шаровидной формы. Молекулы, из которых состоит все образование, обладают особого рода силой сцепления, а с другой стороны каждая молекула испытывает на себе действие тех же сил сцепления со стороны окружающих ее молекул. Если мы возьмем молекулу, расположенную где-нибудь внутри молекуляр­ного конгломерата, то нетрудно видеть, что силы сцепления, дей­ствующие на эту молекулу со стороны других молекул, окружающих ее со всех сторон, взаимно уничтожаются. Это относится ко всем молекулам, расположенным внутри молекулярного конгломерата, где, следовательно, силы сцепления регулируют лишь величину среднего расстояния между отдельными молекулами. Сказанное относительно взаимного уравновешивания сил сцепления, действующих на моле­кулы внутри молекулярного конгломерата, перестает быть верным для молекул, расположенных у самой поверхности: здесь отдельная молекула окружена другими не со всех сторон и испытывает одно­стороннее притяжение внутрь вследствие отсутствия притяжения по направлению кнаружи соответственно свободной стороне. Все молекулы поверхностного слоя, находясь в таком именно положении, втягиваются внутрь шаровидного образования, которое, благодаря этому, представляется какой-бы обтянутым снаружи эластической пленкой, стягивающей расположенные внутри молекулы в одну бо­лее или менее компактную массу. Сила эта, как известно, носит в физике название силы поверхностного натяжения.

Нетрудно видеть, что при столкновениях молекулярных конгло­мератов между собой сила эта тотчас же перестает действовать в точках соприкосновения конгломератов. В этих точках молекулы того и другого столкнувшегося конгломерата взаимно притягивают друг друга с той именно стороны, которая до сего времени была свободна; этим самым указанные молекулы в смысле действия на них сил сцепления становятся в положение молекул, расположен­ных внутри молекулярного конгломерата,— другими словами, здесь сила поверхностного натяжения уничтожается. В то же время на протяжении остальной поверхности того и другого столкнувшегося конгломерата силы эти продолжают действовать. Само собою по­нятно, что результатом такого распределения сил поверхностного натяжения будет как-бы постепенное сдавливание столкнувшихся конгломератов в одно общее целое, т. е. образование в конце кон­цов более крупной частицы. Понятно также, что, чем больше в каждом отдельном случае сила поверхностного натяжения, тем вернее в каждом отдельном случае сталкивания частиц обеспечивается наступление процесса слияния, и затрудняется, наоборот, возможность их нового разъединения под влиянием сил противоположного направ­ления. В зависимости также от величины сил поверхностного натя­жения, само собой разумеется, стоит и быстрота процесса слияния и уплотнения частиц.

Будучи предоставлен самому себе, процесс слияния коллоидальных частиц идет в зависимости от устойчивости коллоидальной си­стемы, в общем, чрезвычайно медленно, не имея возможности, за недостатком времени, останавливаться подробно на вопросе о при­чинах устойчивости коллоидальных систем, я должен ограничиться лишь самыми общими замечаниями по этому вопросу.

Большинство исследователей считает, что причиной устойчи­вости служат электрические силы. На молекулярные конгломераты, взвешенные в дисперсионной среде, нужно смотреть, как на носителей электрических зарядов. Заряды эти, будучи одинакового знака, вызывают взаимное отталкивание, препятствующее слиянию коллоидальных частиц между собой, т. е. образованию более круп­ных агрегатов и выпадению вещества в осадок. Кроме того, раз молекулы коллоидальных частиц заряжены одноименным электриче­ством, то нужно признать, что электрические силы действуют в направлении противоположном силам молекулярного притяжения,  которым, как мы только что видели, обязана своим происхожде­нием сила поверхностного натяжения. Таким образом электрические силы, являясь как-бы антагонистами молекулярных сил, должны понижать поверхностное натяжение коллоидальных частиц, и, если в силу, каких-либо причин произойдет уменьшение или нейтрализа­ция электрического заряда, то сила поверхностного натяжения ча­стиц должна увеличиться. Коллоидальные частицы в конечном ито­ге удерживают свое положение и приобретают устойчивость вслед­ствие взаимодействия двух сил: молекулярной аттракции с одной стороны и электрического отталкивания одноименно заряженных молекул с другой. Дело сводится, в конце концов, к величине поверхностного натяжения, представляющего собой равнодействующую только что указанных сил, и понятно, поэтому, что все условия, которые ведут к изменению величины электрического заряда, будут влиять и на величину поверхностного натяжения коллоидальных частиц, а, следовательно, и на процесс слияния их между собой: ускорять его в случае увеличения силы поверхностного натяжения и задерживать в случае понижения.

Обращаясь теперь к нашему токсину, мы видим, что задача наша сводится к тому, чтобы ускорить протекающий при нормальных условиях чрезвычайно медленно процесс слияния нагруженных токсином коллоидальных частиц и таким образом вызвать быструю их с диментацию. Этого мы можем достичь, повысив поверхностное натяжение частиц. Для последней же цели в вашем случае особенно было-бы удобно воспользоваться свойством электролитов. Извест­но, что электролиты, находясь в растворе, диссоциируют, т. е. рас­падаются на ионы, снабженные электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от химической природы. Находясь в пос­тоянном движении, ионы эти сообщают непрерывные толчки или удары встречающимся на пути их движения препятствиям (обусловливая, между прочим, этим обстоятельством существование осмо­тического давления у растворов). Само собой разумеется, и взве­шенные в жидкости молекулярные конгломераты также будут подвергаться этой как бы бомбардировке со стороны ионов, результаты которой мы можем представить себе в виде равномерного давления со всех сторон на коллоидальную частицу. Это обстоятельство дол­жно привести в свою очередь к повышению поверхностного натяжения частиц. С другой стороны, принимая во внимание сущес­твование у ионов электрического заряда, необходимо допустить вли­яние со стороны ионов и на электрический заряд коллоидальных частиц: уменьшение или нейтрализация этого заряда, как указыва­лось выше, приводит в конечном итоге к повышению поверхностно­го натяжения и последующему осаждению коллоидальных частиц из дисперсионной среды.

Нужно отметить, что явления осаждения коллоидов помощью электролитов у различных коллоидов далеко неодинаковы: одни кол­лоиды осаждаются даже малейшими количествами солей, другие, наоборот, гораздо менее чувствительны к действию электролитов. Коллоиды первой группы, к которым относятся металлы, называют­ся неустойчивыми, тогда как входящие во вторую, альбумин, же­латина и вообще органические коллоиды, а, следовательно, и нага токсин, носят название устойчивых. Что касается осаждения, или, как принято говорить, коагуляции неустойчивых коллоидов, то, как общее правило, коагулирующая способность электролита к опреде­ленному коллоиду зависит только от аниона или только от катиона, но никогда от обоих вместе, и быстро возрастает соответственно повышению значности активного иона. Поэтому коагулирующая способность разных солей, обладающих одинаковым активным ионом, по отношению к данному коллоиду одинакова. Радикал, которому принадлежит коагулирующая способность, всегда обладает противоположным электрическим зарядом по сравнению с зарядом коллоида. Поэтому, напр., щелочами осаждаются положительные коллоиды, тог­да как отрицательные выпадают от прибавления кислот. Это и понятно, так как коагуляция отвечает понижению заряда или, точнее, есть следствие уменьшения заряда коллоидальных частиц, налич­ность же заряда, наоборот, служит необходимым условием устойчи­вости коллоидов.

В случае коагуляции устойчивых коллоидов, когда для осаж­дения пользуются солями тяжелых металлов, аналогия с только что описанными явлениями у неустойчивых коллоидов полная. Наоборот, при коагуляции устойчивых коллоидов солями щелочных металлов коагуляция не зависит, как у неустойчивых коллоидов, от ионов - одного знака, но оба иона соли действуют одновременно и незави­симо друг от друга. Поэтому коагуляция нейтральными солями  имеет аддитивный характер, слагающийся из суммы действия отдель­ных ионов. Для коллоидов с ясно выраженной щелочной реакцией коагулирующая способность анионов возрастает в следующем по­рядке:

CNS<I<Br<N03 <C1<C2H3O2<HPO2<SO., а для катионов:

NH4<K<Na<Li.

Это—так называемые ряды Hofmeister’a.

Указанное независимое действие отдельных ионов резко отли­чает этот тип коагуляции от коагуляции неустойчивых коллоидов. Но различие выступает еще резче, если принять во внимание, что, прибавлением нейтральных солей удается коагулировать электрически нейтральные устойчивые коллоиды (альбумин). Этот факт указывает, что образование осадка непременно и существенно не связано с про­цессом электрической природы.

Каков бы ни был в каждом отдельном случае механизм дей­ствия электролита, несомненно лишь, что в нем мы имеем сред­ство, при помощи которого можно повысить поверхностное натяже­ние коллоидальных частиц и тем самым вызывать их седиментацию. В нашем случае со столбнячным токсином нам нужно прежде все то выбрать такую концентрацию электролита, которая была-бы дос­таточна для осаждения нагруженных токсином коллоидальных час­тиц из бульонной среды, в которой ведь кроме них имеется целый ряд других коллоидальных частиц. Предполагая, что различного ро­да частицы обладают различным поверхностным натяжением, мы должны допустить, что, в зависимости от взятой нами концентрации электролита, будут седиментироваться лишь те частицы, поверхнос­тное натяжение которых не меньше некоторой предельной величи­ны, и чем меньше поверхностное натяжение частицы, тем большая концентрация электролита нужна для повышения поверхностного натяжения до величины, достаточной для наступления седиментации. Таким образом путем постепенного повышения концентрации элек­тролита мы можем получить в осадке фракции коллоидов, характе­ризующихся одним общим признаком, именно, величиной поверхност­ного. натяжения коллоидальных частиц. В одной из таких фракций должен находиться и интересующий нас токсин. Определить зара­нее, в какой именно фракции соберется наш токсин, совершенно не представляется возможным. В каждом отдельном случае в зави­симости от качества продуктов, из которых приготовлен бульон, от токсичности разводки и т. д. условия адсорбции токсина коллоидаль­ными частицами будут меняться, равно как будет меняться и вели­чина поверхностного натяжения нагруженных токсином частиц. Учесть заранее характер этих изменений совершенно невозможно, и практическая задача найти необходимые условия для получения по возможности чистой фракции токсина под силу лишь одному эмпиризму.

Из опытов, поставленных с этой целью мной совместно с д-ром Лондоном во время работ в лаборатории на форте Император Але­ксандр I по приготовлению противостолбнячной сыворотки для нужд, действующей армии, выяснилось, что при концентрации сернокислого аммония, взятого нами в качестве электролита, равной 18— 20%, получается такое увеличение поверхностного натяжения токси­ноностных частиц, которого как раз достаточно для того, чтобы на ­ступило их взаимное слияние с последующей седиментацией. Отсю­да ясно, что для получения наиболее чистого препарата тетаноток­сина нужно вначале осадить все то, что выпадает при более низ­кой концентрации сернокислого аммония, равной примерно 17%. этой соли, и то, что выпало, отцентрифугировать и отбросить; за­тем остается прибавить к жидкости 1%—3% сернокислого аммо­ния, причем полученный при этих, условиях осадок и будет пред­ставлять из себя концентрированный токсиноносный коагулят. В це­лях дальнейшего очищения осадок следует подвергнуть повторному растворению с последующим осаждением сернокислым аммонием соответствующей концентрации вплоть до того момента, пока опыт на животных не покажет, что дальнейшая очистка не ведет к усилению ядовитости препарата. Таким путем нам удалось получить препарат токсина, минимальная смертельная доза которого для белой мыши, убивающая ее в 48 часов, равнялась  т. е. пре­парат в 3 раза сильнее Briegeгʹовского.

В заключение я хотел-бы сделать еще одно маленькое заме­чание, а именно: согласно изложенным выше представлениям от­дельные фракции коллоидов при дробном осаждении характеризуются, как общим признаком, величиной поверхностного натяжения кол­лоидальных частиц. Нужно здесь, однако, иметь в виду, что кроме ветчины поверхностного натяжения при дробном осаждении будет иметь также значение и величина коллоидальных частиц: чем больше по своему объему данные частицы, тем скорее они дадут при своем слияния настолько крупные образования, что наступит их седиментация. Поэтому-то мало-дисперсные системы, т. е. системы с крупными по величине коллоидальными частицами, осаждаются уже при малых концентрациях электролита, для высоко-дисперсных же систем концентрация электролита, необходимая для наступления коагуляции, должна быть выше. Все это указывает, что полученный пут и дробного осаждения осадок должен представлять из себя все таки пеструю смесь веществ, и, конечно, не может быть и речи о получении этим путем химически-чистого препарата тетанотоксина. Тем не менее, метод этот, не являющийся сам по себе новым, бу­дучи применен для специальной цели в освещении и с точки зрения принципов коллоидальной химии, дал весьма удовлетворительные ре­зультаты. Этим путем удалось получить препарат тетанотоксина в 3 раза сильнее, а, следовательно, и чище, чем самый чистый из­вестный в литературе препарат Briegeга. Кроме того этим же ме­тодом Лондону и Пахотипой удалось из поджелудочного сока, содержащего в себе, как известно, очень пеструю смесь ферментов, получить раздельно ферменты амилолитический, протеолитический и липолитический.