On erythroprecipitins and hemoglobin precipitins

Abstract

In 1903, A. Klein showed that when rabbits are immunized with an extract of red blood cells in their serum, precipitins that differ in their properties from Uhlenhuth's precipitins are formed. Klein called them erythroprecipitins, in contrast to the sulfurprecipitins commonly used in practice.

Full Text

В 1903 году А. Klein ¹) показал, что при иммунизации кроликов экстрактом эритроцитов в сыворотке их образуются преципитины, отличающиеся по своим свойствам от преципитиаов Uhlenhuth’a. Klein назвал их эритропреципитинами, в отличие от серумпреципитинов, обычно применяющихся в практике. Для иммунизации кроликов Klein ²) пользовался экстрактами, приготовленными таким образом: красные кровяные тельца многократно промывались на центрифуге физиологическим раствором NaCl до тех пор, пока промывные воды не переставали давать реакцию на белок, затем физиологический раствор сливался с осадка эритроцитов, и последние разрушались четырехкратным об’емом дестиллированной воды. После того к полученному лаковому раствору добавлялся 8,5% раствор NaCl в пропорции 1:9, и смесь вновь центрифугировались до тех пор, пока помутившийся раствор не делался вновь прозрачным. Полученный таким образом раствор Klein вводил кроликам в брюшную полость 8 раз по 15 к. сант. В результате иммунизации Klein получил сыворотку, дающую приципитацию только с экстрактами эритроцитов, но не с сывороткой соответствующей крови. Наряду с образованием эритропреципитинов Klein получил также в сыворотке опытных животных и агглютинины.

Последний вывод Кlein’а был проверен Кочкиным ³), который иммунизировал 1 морскую свинку экстрактом эритроцитов и, кроме того, 2 кроликов и 5 морских свинок—растворами кристаллического гемоглобина. Выводы Кочкина были таковы, что ни экстракт эритроцитов, ни гемоглобин не содержат в себе ни гомолитических антигенов, ни гэмагглютнниногенов.

Через год после диссертации Кочкина вышла работа Leers’a ⁴), иммунизировавшего 8 кроликов экстрактами эритроцитов человека по методу Кlein’а, причем 6-ти кроликам он вводил экстракт в полость брюшины, а 2-м—в ушную вену. В результате Leers получил сыворотки, специфичные только для крови человека, титра от 1 : 100 до 1:1500, но большинство сывороток Leers’a давало преципитацию не только с экстрактами эритроцитов, но и с нормальной сывороткой человека. Особенно интересны были опыты Leers’a с кровью, смешанной со спермой и мокротой, где серумпреципитпновая реакция давала большой % ошибки, а эритроципитиновая—всегда давала правильный ответ.

После Leers’a вспрос об эрптропреципптпнах был почему-то забыт, п только в 1922 году Hektoen и Schulhof ¹) вполне подтвердили специфичность эритропрецппитинов, но указали, что эритропреципитиновая сыворотка всегда содержит в себе небольшое количество серумпреиипитинов, от которых может быть освобождена добавлением небольшого количества нормальной сыворотки соответствующего животного и последующим отцентрифугированном образовавшагося осадка.

Наконец, в 1923 г. Higaschi ²) иммунизировал кроликов кристаллическим гемоглобином собаки и лошади, полученным по способу Hoppe-Seyler’a и перекристаллизованным 1 — 2 раза. При этом Higaschi получил специфические сыворотки, которые давали с соответствующим антигеном реакции преципитации и связывания комплемента, но не давали ни гемолиза, ни агглютинации эритроцитов соответствующего животного. Higaschi вводил кроликам интравенозно 6—10 раз по 0,005—0,1 кристаллического гемоглобина с промежутками в 9 -10 дней. При применении нечистых препаратов гемоглобина Higasсhі получал, кроме гэмоглобинпреципитинов, также агглютинины и лизины, почему он и считает эритропреципитины Кlein’а не за самостоятельные антитела, а за смеси гэмоглобинпреципитинов, лизинов и агглютининов.

Мои первые опыты с иммунизацией кроликов экстрактами эритроцитов человека относятся к периоду 1920-21 года, когда мною было иммунизировано 4 кролика, причем им делались ин’екции внутрибрюшинно, по классическому методу Uhlenhuth’a, с промежутками в 5—6 дней. Эта первая попытка была неудачна,—два кролика погибли от анафилаксии после 2-ой ин'екции, 1 кролик не дал иммунной сыворотки, и 1 кролик дал сыворотку с титром 1:1000 как для нормальной сыворотки человека, так и для экстракта эритроцитов.

Свою неудачу я мог об’яснить главным образом тем, что в моем распоряжении тогда не было соответствующего оборудования, и я не мог тогда получить эритроцитов, вполне отмытых от сыворотки. Что же касается большого % гибели животных, то это обстоятельство наблюдалось и у Кlеіn’а, и у Leers’a.

В прошлом году в нашей лаборатории вновь начато было иммунизирование кроликов, и не только экстрактом эритроцитов, но и кристаллическим гемоглобином. К изложению этих опытов я теперь и перехожу.

До настоящего времени нами иммунизировано 4 кролика экстрактом эритроцитов человека и 6 кроликов—растворами кристаллическаго гемоглобина лошади.

Техника приготовления экстракта эритроцитов нами применялась та же, что и у Klein’a, за тем исключением, что эритроциты растворялись не в 4-кратном, а в 3-кратном oбʹеме воды, и. вместо разведения экстракта эритроцитов 8,5% раствором NаСІ, нами просто прибавлялась к полученному раствору эритроцитов кристаллическая поваренная соль до содержания ее, соответствующего содержанию в физиологическом растворе. Кровь человека нами получалась из родильнаго приюта (послеродовая).

Что касается хода иммунизации, то кролику № 1 17/ХІ 1926 было введено интравенозно 3 к. с. экстракта эритроцитов, 24/Х1—10 к. с. и 1/XII—10 к. с. После третьей инʹекции exitiis letalis при явлениях анафилаксии. Испытание сыворотки этого кролика показало полное отсутствие в ней как эритро-, так и серум- преципитинов.

Кроликам 2—4 вводились меньшие дозы того же антигена, из-за боязни тоже вызвать у них явления анафилаксии. Всем этим 3 кроликам ин’екции делались одновременно, причем всем им вводилось одинаковое количество экстракта эритроцитов. Всем им было сделано по 5 ин’екции, а именно, 12/II 1927 по 2 к. с. экстракта эритроцитов, 15/ІI—по 2,5 к. с., 20/II-по 3 к. с., 23/ІІ—по 3,5 к. с. и 28/II—по 4 к. с. Все три кролика перенесли ин’екции хорошо, явлений анафилаксии у них не наблюдалось. Через 12 дней, т. е. 13 III, от всех трех кроликов взяты пробы крови (из ушной вены), и, после отстаивания сыворотки, поставлены пробы на преципитацию как растворов экстракта эритроцитов, применявшегося для иммунизации, так и растворов нормальной сыворотки человеческой крови.

Так как предполагалось произвести вторичную иммунизацию этих кроликов, то для пробы у всех их были взяты лишь небольшие количества крови, почему и произведено было собственно не испытание титра полученных сывороток, а только испытание их активности.

Практика Кlein’a и Leers’a показала, что эритропреципитиновые сыворотки вообще имеют невысокий титр, почему для пробы нами были взяты только слабые растворы как экстракта эритроцитов, так и нормальной сыворотки, а именно: 1:100, 1: 200 и 1: 300.

Сыворотки всех трех кроликов дали со всеми этими растворами преципитацию, т. е. все полученные сыворотки содержали как эритропреципитины, так и серумпреципитины; другими словами говоря, результаты у нас были те же, что и полученные Hektoenом и Schulhofʹом. Более интересные результаты получены были нами при иммунизации гэмоглобином.

Для иммунизации мы применяли кристаллический гэмоглобин лошади, полученный из Лаборатории биологической химии и хранившийся около года. Гэмоглобин этот был перекристаллизован 5 раз. Из него готовился 1% раствор в дестиллированной воде, затем этот раствор центрифугировался от 3 до 6 часов, причем на дне пробирок получался осадок, над которым был совершенно прозрачный раствор. Раствор этот осторожно снимался пипеткой, к нему добавлялась поваренная соль до физиологпческаго содержания, и затем раствор вводился кроликам в ушную вену.

При иммунизациии кролика № 5 была сделана попытка фильтровать раствор гэмоглобина через свечу Silberstein’a, но это было сделано только раз, причем только через сутки было получено 5 к. с. прозрачной, соломенно-желтой жидкости. При остальных- ин’екциях растворы не фильтровались, из-за опасения порчи раствора при длительном стоянии.

При каждой ин’екции 1 к. с. применявшегося раствора гэмоглобина высушивался на часовом стекле и взвешивался на химических весах; путем такого определения сухого остатка гэмоглобина точно высчитывались количества гэмоглобина, введенные кроликам. Перед началом иммунизации сыворотки всех опытных кроликов были испытаны на преципитацию растворов гэмоглобина лошади, причем все дали отрицательные результаты.

Кроликѵ № 5 23'X 1926 введено 5 к. с. раствора гэмоглобина, профильтрованного через свечу Silberstein’a, причем количество введенного гэмоглобина не было определено взвешиванием. 28/Х—вторая ин’екция 5 к. с. раствора, содержавших в себе 0,0441 гэмоглобина, 5/ХІ—третья ин’екция 10 к. с., или 0,107 гемоглобина, 12/ХІ—четвертая ин’екция 10 к.с., или 0,061 гэмоглобина, и 20/ХІ—пятая ин’екция 10 к. с., или 0,074 гэмоглобина. Всего в первую серию кролику было введено немного более 0,2861 гэмоглобина. Испытание сыворотки на 12-й день после пятой ин’екции показало, что сыворотка совершенно неактивна.

Через 2 месяца тому же кролику начата вторая серия ин’екции: 22/1 1927— первая ин’екция 3 к. с. раствора, или 0,0221 гэмоглобина, 25/1—вторая ин’екция 8 к. с., или 0,0592 гэмоглобина, 28/1—третья ин’екция 10 к. с., или 0,172 гэмоглобина, и 9/11— пятая ин'екция 10 к. с., или 0,058 гэмоглобина. Таким образом за вторую серию кролику было введено 0,4058 гэмоглобина, а всего в обе серии—несколько более 0,6919 гэмоглобина.

Немного ранее была закончена первая серия иммунизации кроликов №№ 6, 7 и 8. Ин’екции этим кроликам делались в одни и те же дни, причем почти всегда им вводилось одинаковое количество раствора гэмоглобина.

Ход иммунизации этих кроликов был следующий: 16/1 первая ин’екция—всем трем кроликам введено по 3 к. с. раствора, или по 0,07215 чистого гэмоглобина; 19/I—вторая ин'екция по 5 к. с., пли по 0,0155 гэмоглобина; 22/I—третья ин’екция по 5 к. с., или по 0,0385 гэмоглобина; 25/1—четвертая ин’екция по 8 к. с., пли по 0,0592 гэмоглобина; 28/I—пятая ин’екция кроликам № 6 и № 8 по 9 к. с., или по 0,0945 гэмоглобина, а кролику № 7—8,5 к. с., или 0,08925 гэмоглобина. Таким образом, кролики №№ 6 и 8 за 5 ин’екций получили по 0,30985 гэмоглобина, а кролик № 7—0,3046 гэмоглобина.

Кролики №№ 9 и 10 иммунизировались тоже одновременно, а именно: 17/III—первая ин'екция по 3 к. с. раствора, или по 0,0405 гэмоглобина, 20/ІІІ— вторая ин'екция по 4 к. с., или по 0,034 гэмоглобина, 25/III—третья ин’екция по 5 к. с., пли по 0,0505 гэмоглобина, 30/III—четвертая ин’екция по 6 к. с., или по 0,0606 гэмоглобина, и 2/IV—пятая ин’екция по 7 к. с., пли по 0,1169 гэмоглобина. Таким образом кролики №.№ 9 и 10 за пять ин’екций получили всего по 0,3025 гэмоглобина.

Испытание сывороток всех кроликов, иммунизированных гэмоглобином, было произведено через 12 дней после пятой ин’екции, причем все сыворотки были испытаны на их активность не только по отношению к растворам гэмоглобина лошади и растворам нормальной сыворотки лошади, но и по отношению к сыворотке и крови человека и крови коровы.

Испытание полученных сывороток и здесь имело целью не точное установление титра их, а только решение вопроса о возможности получения гэмоглобинпреципптиновых сывороток и специфичности этих сывороток. Поэтому растворы испытуемых веществ были взяты в пределах от 1:10 до 1 : 200—для сывороток первых четырех кроликов и в пределах от 1:10 до 1:500—для двух последних кроликов.

Все сыворотки оказались не только видоспецифичны, но и строго органоспецифичны и давали ириципитацию исключительно только в растворах гэмоглобина лошади, в остальных же растворах, в том числе и в растворах нормальной сыворотки лошади, преципитации не было.

Из шести кроликов, иммунизированных гэмоглобином, кролики №№ 5, 7 и 8 дали приципитацию всех растворов гэмоглобина, примененных для определения титра (т. е. растворов от 1:10 до 1:200), кролик № 6 дал преципитацию только при разведении основного раствора гэмоглобина в пропорции 1:10, кролик № 9 дал тоже приципитацию всех применявшихся растворов гэмоглобина (в данном случае от 1:10 до 1: 500), и кролик № 9 преципитировал разведения основного раствора гэмоглобина до 1:300.

В качестве основного раствора гэмоглобина, из которого приготовлялись все разведения, при испытании сывороток кроликов 5, 6, 7 и 8 был взят такой раствор, 1 к. с. которого содержал 0,0039 гэмоглобина, а при испытании сывороток кроликов №№ 9 и 10—основной раствор заключал в 1 к. с. 0,0105 гэмоглобина.

Минимальные количества гэмоглобина, входившего в реакцию с преципитирующими сыворотками, были определены путем вычисления. Оказалось, что таким минимальным количеством гемоглобина для сыворотки № 5 было 0,00001755. для сыворотки № 6—0,000855, для сывороток, кроликов №№ 7 и 8—0,00004275’ для кролика № 9—0,0000189 и для кролика № 10—0,0000315 гемоглобина.

Несмотря то, что опыты нами пока еще не окончены, выводы из них ясны,—при иммунизации гэмоглобином, перекристаллизованным даже не 1—2 раза, каковой применял Higaschi, а перекристаллизованным 5 раз и сохранявшимся после этого долгое время,—получаются специфические гэмоглобинпреципитины.

Эти гэмоглобинпреципитины не только видоспецифичны, но и органоспецифичны, так как они оказываются недеятельными даже по отношению к сыворотке крови.

Иммунизация же по Кleіn’у,—экстрактом эритроцитов,—вызывает образование не только эритропреципитинов, но и серумпреципитинов. Кроме того, иммунизация по Кlеіn’у имеет еще и чисто-технические неудобства: получать экстракт эритроцитов можно только зимой, так как летом почти невозможно предупредить быстрое загнивание крови, почему и экстракт будет негоден для применения, иммунизировать же раствором гэмоглобина можно всегда, так как для приготовления такового раствора не требуется значительного времени.

Теперь остается только решить вопрос о том, почему же у нас получается такое резкое расхождение с мнением Кочкина, что гэмоглобин не содержит специфических антигенов? Ответ на этот вопрос, на мой взгляд, становится ясным, если рассмотреть опыты Кочкина.

Он иммунизировал одного кролика и одну морскую свинку нефильтрованным 5%раствором гэмоглобина внутрибрюшинно и только 2 и 3 раза, что, конечно, недостаточно. Остальных двух морских свинок Кочкин иммунизировал не 5% раствором гэмоглобина, как он это указывает, а, по-видимому, очень слабыми растворами,—в этих двух случаях Кочкин фильтровал растворы гэмоглобина через каолиновую свечу и после фильтрации не определял концентрации раствора, принимая, что она остается неизменной.

Между тем это совершенно неправильно. Насколько уменьшается концентрация раствора гэмоглобина после фильтрации, видно из опыта, поставленного мною 20/III: мною был приготовлен 1% раствор гэмоглобина (0,01 на 1 к. с. воды); через сутки—центрифугирование раствора впродолжение ½ часа, после чего 1 к. с. был взят на часовое стекло № 1 для определения остатка; оставшийся раствор профильтрован через свечу Сhаinbеr1аndʹa F, и 1 к. с. профильтрованного раствора тоже взят на часовое стекло № 2 для высушивания; взвешивание сухих остатков показало, что на стекле № 1 имеется 0,0056 гэмоглобина, а на стекле № 2—0,0004 гэмоглобина. Следовательно, после центрифугирования осталось только 56%, а после фильтрации—только 4% взятого гэмоглобина.

С другой стороны Higasсhі указывает, что сыворотка животного, иммунизированного гэмоглобином, не содержит ни агглютининов, ни лизинов, каковые искал Кочкин; но этому как будто несколько противоречат опыты Кочкина, получившего слабые гэмолизины при иммунизации нефильтрованным гэмоглобином.

Таким образом на основании еще пока небольшого числа поставленных нами опытов можно считать вполне выясненным, что иммунизация гэмоглобином ведет к образованию органоспецифических гэмоглобинпрепипитинов, вопрос же о практическом применении гэмоглобинпреципитиновой сыворотки может бытъ разрешен только дальнейшими исследованиями этой сыворотки, каковые и будут нами продолжаться.

Если в дальнейшем нам удастся получить сыворотку высокого титра, на что я вполне надеюсь при применении нескольких повторных серий иммунизации, то этим будет разрешен вопрос нового пути судебно-медицинского исследования крови,—мы будем ставить только одну гемоглобин-преципитиновую пробу и на основании этой пробы будем делать заключение о нахождении в исследуемом материале человеческой крови; все же остальные пробы на кровь, как, напр., реакция Telchmаun‘а, получение форменных элементов и спектральное исследование крови, станут излишними.

Такая экономия исследуемого материала чрезвычайно важна, так как, несомненно, в ближайшем будущем придется коренным образом изменить весь ход судебно-медицинского исследования крови, ибо нам уже недостаточно будет только решить вопрос о том, не принадлежит-ли исследуемая кровь человеку, а необходимо будет определить и пол, а может быть— и возраст, и национальность этого человека.

При такой экспертизе главная масса исследуемого материала будет расходоваться на решение этих последних вопросов, на доказательство же того, что этот материал заключает в себе кровь, и именно кровь человека, можно будет расходовать только минимальное количество материала. Мы должны заранее подготовить новые пути для такой возможности.

¹) Klein А. Wiener kl. Woch., 1903, №№ 5—6; Wiener kl. Rundschau, 1904 № 24.

²) Klein A. Centr. f. Bakter., Bd. XXXIX, Original.; Wiener kl. Woch., 1905, № 41.

³) Кочкин В. И. Дисс., Казань, 1911.

⁴) Leers О. Centr. f. Bakt, Bd. LIV.

¹) Hektoen L. and Schulhof К. Реф. в Zent. f. gericht. Med., 1925, Bd. V, H. 2.

²) Higaschi S. Реф. ibidem.