Влияние низкоинтенсивного излучения He-Ne лазера на спектр липидов и кинетику агрегации тромбоцитов при перитоните

Полный текст

Низкоинтенсивное излучение He-Ne лазера обладает широким спектром биологической активности и находит широкое применение при лечении различных заболеваний в качестве терапевтического биостимулирующего фактора [2, 7]. Однако пути реализации его биологической активности, особенно роль липидов в этих процессах, в достаточной мере не изучены, что во многом ограничивает его применение для целенаправленной коррекции клеточных и органных функций.

Целью настоящей работы был анализ фотоиндуцированных преобразований в липидном компоненте таких хемореактивных структур крови, как тромбоциты. Полученные результаты позволяют оценивать роль биохимических изменений в спектре липидов в процессах восприятия и формирования клеточного ответа при воздействии низкоинтенсивного лазерного излучения и возможность лазерной коррекции патологических процессов в липидном обмене при перитоните.

Перитонит моделировали под наркозом у 30 беспородных собак, которым вводили в брюшную полость каловую взвесь в 0,9% растворе хлорида натрия из расчета 0,3 г/ кг массы тела. Тромбоциты венозной крови, взятой в реактивной стадии перитонита и стабилизированной 0,1 М ЭДТА (в соотношении 10:1), получали путем дробного центрифугирования крови, суспендировали в буфере Тироде (pH 7,4) [8]. Липиды экстрагировали смесью хлороформ-метанол (1:2, по объему) [6]. Нейтральные липиды делили на силикагелевых пластинах (ТОО “Хромтех”, Россия) в системе растворителей гексан/ диэтиловый эфир/ уксусная кислота (90:10:1, по объему). Фосфолипиды фракционировали методом двумерной хроматографии на пластинах TLC Plates (Sigma-Aldrich) с применением систем растворителей хлороформ/ метанол/ 0,25% аммиак/ вода (90:54:5:8, по объему) и хлороформ/ метанол/ ледяная уксусная кислота/ вода (90:40:10:4, по объему). Содержание липидов определяли денситометрическим методом (денситометр Model GS-670, BIO-RAD, США) после обработки хроматограмм 5%-й фосфорномолибденовой кислотой. Для исследования агрегационной активности тромбоциты получали из венозной крови, стабилизированной 3,8% цитратом натрия (9:1, по объему), а обогащенную ими плазму — путем центрифугирования крови при 200 g в течение 10 минут и затем готовили образцы с концентрацией клеток до 200000/ мкл. Кинетику агрегации тромбоцитов регистрировали оптическим методом с помощью двулучевого агрегометра THROMLITE 1006 (СП “Био-ХимМак”, Москва), используя в качестве индуктора агрегации АДФ в конечной концентрации, равной 20 мкМ. Основными параметрами агрегации выбраны следующие показатели: степень — максимальное относительное изменение светопропускания в результате агрегации и скорость, представляющая тангенс угла наклона указанной касательной, а также время и характер агрегации.

Для облучения использовали He-Ne лазер ЛГ-75 (632,7 нм; 2 мВт) с экспозицией 5 минут (доза — 6 Дж/ см²). Исследуемые параметры измеряли через 30 минут после облучения. Данные обрабатывали методом вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента.

Как показали результаты наших исследований и данные других авторов [2], наиболее выраженная биостимулирующая активность излучения Не-Nе лазера характерна для оптического воздействия в течение 5 минут (биологическая доза — 6 Дж/ см²). В такой дозе низкоинтенсивное лазерное излучение индуцирует в составе липидов тромбоцитов широкий спектр изменений (см. таблицу).

 

Влияние низкоинтенсивного излучения Не-Nе лазера на спектр липидов тромбоцитов (в %) в норме и при перитоните

Липиды	Норма		Перитонит
	до облучения	после облучения	до облучения	после облучения
Холестерин	24,51±0,71	21,65±0,49*	32,25±0,95****	34,60±1,01
Эфиры холестерина	7,00±1,20	9,85±0,60*	11,43±1,81****	10,50±2,51
1,2-диацилглицерин	3,75±0,21	1,44±0,14***	3,83±0,22	4,00±0,18
Триацилглицерин	5,71±0,60	5,45±0,40	6,00±0,66	4,18±0,46*
Свободные жирные кислоты	4,43±0,58	6,88±0,54*	7,38±0,22****	2,42±0,21***
Суммарные фосфолипиды	54,50±2,10	54,70±1,95	38,98±1,11****	44,20±2,23***
Фосфатидилэтаноламин	24,10±1,65	17,80±2,10*	30,06±1,68****	28,08±2,25
Фосфатидилинозит	7,37±0,59	11,28±1,08***	4,25±0,41****	3,03±0,34
Фосфатидилсерин	9,36±0,24	4,52±0,15***	4,88±0,34****	4,90±0,10
Фосфатидилхолин	35,60±1,17	41,03±1,48**	30,56±1,59****	37,83±2,03*
Сфингомиелин	22,46±2,39	21,66±2,40	21,92±1,34	17,89±2,04
Лизофосфатидилхолин	1,14±0,05	3,42±0,14***	7,41±0,69****	8,77±0,21
Фосфатидная кислота	0,50±0,07	1,63±0,06***	—	—

Примечание. * Р <0,05; ** Р <0,01; *** Р < 0,001; **** Р <0,001 — различие с нормой.

 

Опосредованное лазерной биостимуляцией усиление обмена липидов проявляется увеличением содержания фосфотидной кислоты (в 3,3 раза), фосфатидилхолина (на 15,3%) и фосфатидилинозита (на 53,1%), фонды которых, как известно, служат в метаболических циклах источниками для образования вторичных мессенджеров [12, 13]. Запуск липидзависимых сигнальных систем при фотостимуляции может стать молекулярной основой для формирования клеточного ответа. В пользу этого также свидетельствует рост в фотомодифицированных тромбоцитах уровня свободных жирных кислот (на 55,3%) и лизофосфатидилхолина (в 3 раза) — продуктов гидролитического расщепления фосфатидилхолина при участии фосфолипазы Известно, что как лизофосфатидилхолин, так и арахидоновая кислота, преобладающая в пуле свободных жирных кислот вследствие высокой специфичности фосфолипазы А₂ к арахидонатсодержащим фосфолипидам, являются вторичными мессенджерами, участвующими в передаче сигнала в клетку [13]. Для изменения структурно-функционального состояния биомембран тромбоцитов существенным фактором является уменьшение доли аминосодержащих фосфолипидов фосфатидилэтаноламина (на 26%), фосфатидилерина (на 51,7%) и холестерина (на 11,7%) — важнейшего регулятора жидкостного состояния биомембран.

Отмеченные изменения в спектре липидов могут лежать в основе модификации функциональной активности тромбоцитов, поскольку они вызывают перераспределение числа аминогрупп, изменение заряда, микровязкость и, как следствие, адгезивность [11]. В частности, увеличение концентрации холестерина и рост “жесткости” биомебран являются важнейшими условиями агрегации тромбоцитов [3]. В то же время цвиттерион фосфатидилхолин предотвращает агрегацию [4], поэтому его накопление, наряду с другими фотоиндуцированными сдвигами в липидном компоненте, указывает на понижение агрегационных свойств тромбоцитов.

В норме основные параметры кинетики АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов имеют следующие величины: степень — 33,30±4,76%, максимальная скорость — 1,21±0,15 tg/ a, время агрегации — 123,6±17,8 с. Для фотомодифицированных тромбоцитов характерно уменьшение величины степени агрегации в среднем на 43% (Р <0,001), рост скорости на 49% (Р <0,001) и сокращение времени агрегации на 10% по отношению к контролю. Низкоинтенсивное лазерное излучение модифицирует физиологическую активность тромбоцитов, ограничивая процесс агрегации. В основе модификации функций тромбоцитов, по-видимому, могут лежать как отмеченные выше фотоиндуцированные качественные и количественные изменения в составе мембранных липидов, так и понижение хемочувствительности тромбоцитов к агрегирующему действию АДФ. При этом увеличение скорости агрегационного процесса, по-видимому, является следствием фотоиндуцированной активации липидзависимых сигнальных систем и образования интермедиатов липидного обмена — вторичных посредников, играющих важную роль в процессе агрегации тромбоцитов.

В реактивной стадии перитонита в липидном спектре тромбоцитов происходят существенные изменения. На фоне понижения содержания суммарных фосфолипидов отмечается рост доли холестерина (на 31,6%) и его эфиров (на 63,3%), а также свободных жирных кислот (на 66,6%). Накопление фосфатидил-этаноламина (на 24,7%) сочетается с понижением уровня фосфотидилинозита (на 42,3%) и фосфатидилсерина (на 47,9%). Уменьшение доли фосфатидилхолина (на 14,2%) сопряжено с существенным увеличением содержания лизофосфолипидов (на 550%).

Динамика содержания различных липидов, в том числе бурный рост содержания свободных жирных кислот и лизофосфатидилхолина, а также уменьшение уровня фосфолипидов, являются отражением высокой активности фосфолипаз и преобладания в модифицированных тромбоцитах гидролитических процессов. Данный комплекс биохимических изменений, в том числе повышение уровней холестерина и фосфати-дилэтаноламина, а также понижение доли отрицательно заряженных фосфатидилсерина и фосфатидилинозита, как свидетельствуют данные литературы, среди прочих причин могут лежать в основе роста агрегационной активности тромбоцитов [1, 4, 5].

Действительно, при перитоните агрегационная активность тромбоцитов резко возрастает: степень и максимальная скорость агрегации соответственно повышаются на 66% и 88,4% (Р <0,001), время сокращается на 11% (Р <0,05); отмечается практически полное отсутствие времени задержки по сравнению с нормой. Очевидно, дисфункции тромбоцитов при перитоните могут быть обусловлены различными причинами. Например, типичны для воспалительного процесса повышение содержания биологически активных соединений (АДФ, ФАТ, серотонина и др.) [10], поступление в кровь активных внутриклеточных протеаз, тромбо-пластических субстанций и активация контактных факторов, которые усиливают агрегацию тромбоцитов [9]. Однако, как было отмечено выше, молекулярной основой гиперфункции тромбоцитов при перитоните могут выступать и соответствующие изменения в спектре мембранных липидов.

При перитоните низкоинтенсивное лазерное излучение стимулирует комплекс качественных и количественных сдвигов в спектре липидов тромбоцитов, включающий уменьшение доли триацилглицеридов (на 30,3%), свободных жирных кислот (на 67,2%), увеличение доли суммарных фосфолипидов (на 13,4%), а также накопление фосфатидилхолина (на 23,8%). Рост доли фосфатидилхолина, важнейшего структурно-функционального компонента биомембран, точнее, восполнение его фонда следует отнести к позитивным фотоиндуцированным изменениям приспособительно-компенсаторного характера. При изучаемой патологии в тромбоцитах лазерное облучение подавляет накопление свободных жирных кислот, обладающих мембранно-деструктивным действием, что может быть следствием как фотомодификации фосфолипазы А^ и ограничения ее высокой каталитической активности, так и активизации биосинтетических процессов, приводящих к увеличению содержания суммарных фосфолипидов. В этой связи становится очевидным то, что лазерное облучение способствует понижению высокого уровня функциональной активности тромбоцитов при перитоните. В таких условиях параметры кинетики агрегации фотомодифицированных тромбоцитов при действии 20 мкМ АДФ изменяются следующим образом: величина степени агрегации уменьшается на 55% (Р <0,001), скорость практически не изменяется, время увеличивается на 12,6% (Р <0,05) относительно исходных параметров.

Таким образом, низкоинтенсивное излучение Не-Nе лазера оказывает на обмен липидов в тромбоцитах модифицирующее действие, обнаруживая ряд специфических особенностей в норме и при перитоните. Во-первых, инициирует запуск липидзависимых сигнальных систем, интермедиатами которых являются свободные жирные кислоты, лизофосфатидилхолин, 1,2-диацилглицерин, фосфатидная кислота, фосфатидилинозит. Во-вторых, стимулирует сдвиги в спектре липидов, которые сопряжены с изменениями физико-химического состояния биомембран и, вероятно, носят приспособительный характер. При перитоните инициируемые лазерным излучением изменения в спектре липидов тромбоцитов, по-видимому, носят компенсаторно-приспособительный характер, позволяющий, по крайней мере, частично нивелировать негативные последствия, вызванные накоплением свободных жирных кислот, понижением уровня суммарных фосфолипидов и доли фосфатидилхолина. При перитоните лазерное излучение оказывает на липидный обмен корригирующее действие. Модификация липидного компонента фотомодифицированных тромбоцитов во многом обусловливает низкий уровень их агрегационной активности в норме и при патологии.

Об авторах

В. А. Трофимов

Мордовский государственный университет; Казанский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: info@eco-vector.com

Кафедра биохимии, Кафедра факультетской хирургии, Кафедра патологической физиологии

Россия, Саранск; Казань

М. М. Миннебаев

Мордовский государственный университет; Казанский государственный медицинский университет

Email: info@eco-vector.com

Профессор, заведующий кафедрой патологической физиологии, Кафедра биохимии, Кафедра факультетской хирургии

Россия, Саранск; Казань

А. П. Власов

Мордовский государственный университет; Казанский государственный медицинский университет

Email: info@eco-vector.com

Профессор, заведующий кафедрой факультетской хирургии, Кафедра биохимии, Кафедра патологической физиологии

Россия, Саранск; Казань

Список литературы

Дополнительные файлы