Microvesiculation in immunoconflict pregnancy and hemolytic disease of newborns

Full Text

Гемолитическая болезнь плода и новорожденного (ГБН) при иммуноконф- ликтной беременности — наиболее частая причина перинатальной заболеваемости и смертности детей [7, 13]. Эта проблема до настоящего времени остается актуальной прежде всего в связи с отсутствием методов или средств, позволяющих устранять уже наступившую сенсибилизацию к антигену Rh. Частота ГБН довольно высокая (5:1000).

Действующим агентом в механизме иммунного гемолиза является комплемент, а антитела играют роль связующего звена между комплементом и эритроцитами. При воздействии комплемента на сенсибилизированный эритроцит из клетки через поврежденную мембрану проходят ионы калия, фосфаты и рибонуклеотиды. Это ведет к расстройству ионного баланса клетки и к разрушению эритроцита. Образующиеся при некрозе и апоптозе фрагменты клеточных мембран способны замыкаться и образовывать пузырьки диаметром от 0,05 до 3,0 мкм. Размер микровезикул зависит от природы агента, воздействующего на клетку-мишень. Микровезикулы формируются в частности на клеточной поверхности эритроцитов, слущиваясь с цитоплазматической мембраны. Электронномикроскопически было показано, что эти частицы представляют собой уни- ламиллярные микровезикулы со средним диаметром 0,2 мкм [14].

Приток кальция в эритроциты, вызванный ионофором [9] или опосредованный комплексом С5b-9 комплемента, равно как и в эндотелиальные клетки [10], ведет к частичной потере мембранной фосфолипидной асимметрии и экспонированию на поверхность прокоагулянтного фосфатидилсерина, сопровождаемому слущиванием микровезикул с соответствующего места плазматической мембраны. Обнаружение микровезикул осуществляется рядом методов: путем ультрафильтрации, электронной микроскопии, иммунологическими методами, по гемокоагуляционной активности и активности 5’-нуклеотидазы.

Диагностика ГБН включает комплекс клинико-лабораторных исследований, проводимых в дородовом и послеродовом периодах. Одним из основных применений диагностической энзимологии в настоящее время является определение активности ферментов с целью обнаружения острого или хронического повреждения клеток. Например, лишь на наружной поверхности мембраны можно выявить активность 5’-нуклеотидазы [6].

5’-нуклеотидаза (5’-рибонуклеотидфосфогидролаза, КФ 3.1.3.5) избирательно гидролизует эфирную связь в 5’-ри- бонуклеотиде с образованием рибонуклеозида и неорганического фосфата. Биохимические исследования этого энзима показали, что он является трансмембранным гликопротеином [11] и содержит фосфатидилинозитный якорь.

Интенсивность микровезикуляции по маркерному ферменту 5’-нуклеотидазе оценивали у 98 пациенток на протяжении беременности по триместрам, из них у 14 женщин с физиологически протекавшей беременностью (контрольная группа) и у 84 резус-изосенси- билизированных беременных. У рожениц контрольной группы родились здоровые дети, у резус-изосенсибилизированных беременных — дети с врожденной желтушной формой гемолитической болезни (32), с послеродовой желтушной формой (21), новорожденные с резус- отрицательной принадлежностью крови (16) и здоровые с резус-положительной принадлежностью крови (7). У 8 женщин на различных сроках беременности наступила внутриутробная гибельплода (отечная форма ГБН и внутриутробная смерть с мацерацией).

Группы женщин (контрольная и основная) по возрасту, состоянию здоровья и перенесенным заболеваниям были идентичны. Различались они по репродуктивному анамнезу. Так, 6 из 14 женщин контрольной группы были первобеременными, все резус-изосенсиби- лизированные беременные — повторнородящими.

Исследования активности фермента показали, что 5’-нуклеотидаза в сыворотке крови у женщин контрольной группы во II триместре беременности составляла 63,82±8,34 нкат/л, в III триместре — уже 80,93±8,91 нкат/л, то есть прослеживалась тенденция к усилению микровезикуляции с нарастанием срока беременности. На рис. 1 представлены данные, полученные при исследовании активности фермента у 84 резус-изосенсибилизированных беременных.

 

Рис. 1. Интенсивность микровезикуляции (активность маркерного фермента 5’-нуклеотидазы) в сыворотке крови при физиологической и ре зус-конфликтной беременности по триместрам.

 

Как видим по данным рис. 1, имеет место возрастание микровезикуляции на протяжении беременности с достижением максимума в III триместре, как и в контроле. При сравнении активности фермента при физиологически протекающей беременности (контрольная группа) и резус-изосенсибилизированной во II и III триместрах между ними выявлено различие (Р <0,05).

Приводим результаты активности 5’-нуклеотидазы в сыворотке крови у резус-изосенсибилизированных беременных в зависимости от исходов родов (табл. 1).

 

Таблица 1. Активность 5’-нуклеотидазы в сыворотке крови у резус-изосенсибилизированных беременных в зависимости от исходов родов (нкат/л)

Исходы родов	5’-нуклеотидазная активность у матерей
	во П триместре беременности      (19-31 нед)	в III триместре беременности        (32—40 нед)
Новорожденные с резус-отрицательной принадлежностью крови	94,9±7,1	102,2±7,6
Новорожденные с послеродовой желтушной формой ГБН	94,5±6,4	116,8±8,4
Новорожденные с врожденной формой ГБН	78,1±6,1	103,2±6,2
Новорожденные с отечной формой ГБН	86,2±7,4	121,0±7,3

 

Наличие или отсутствие внутриутробного поражения, вынашивание резус-отрицательного плода не оказывают существенного влияния на процесс микровезикуляции в организме матери во время беременности. Однако и при таком анализе полученных результатов также прослеживается увеличение активности фермента с нарастанием срока беременности.

5’-нуклеотидазную активность в родах определяли у 62 рожениц, у 20 из них имело место физиологическое течение беременности и родов, у 32 — резус-конфликт, а у 10 резус-изосенси билизированных женщин новорожденные родились с резус-отрицательной принадлежностью крови. Активность фермента в родах во всех группах не превышала нормы, в контрольной группе этот показатель был даже несколько выше (табл. 2), но у всех не превышал значений для лиц женского пола соответствующего возраста [4, 8].

Мы сравнили уровень микровезикуляции в родах с этим же показателем в III триместре беременности в соответствующих группах. По нашим данным, в 2 группах рожениц с резус-конфликтом (врожденная и послеродовая желтушная формы) и резус-изосенсибилизацией (вынашивающих резус-отрица- тельный плод) процесс протекал несколько слабее, чем в аналогичных группах. В контрольной же группе (при физиологическом течении беременности и родов) в родах он был выше, чем в III триместре беременности (109,8 и 79,9 нкат/л соответственно).

Наши данные указывают на значительное, двукратное увеличение активности маркерного фермента микровезикуляции в ретроплацентарной крови у родильниц контрольной группы по сравнению с таковым в венозной крови у этих женщин в родах. Так, если в родах она была равна 109,8 нкат/л, то в ретроплацентарной крови — 224,5 нкат/л.

Активность маркерного фермента 5’-нуклеотидазы в сыворотке ретроплацентарной крови у изосенсибилизированных женщин, родивших новорожденных с резус-отрицательной принадлежностью крови, была в 5 раз выше, чем в сыворотке венозной крови рожениц (табл. 2).

 

Таблица 2. 5’-нуклеотидазная активность в родах при физиологической и резус-конфликтной беременности (нкат/л)

Исходы родов	Сыворотка крови рожениц
	венозная	ретроплацентарная
У здоровых рожениц здоровые новорожденные (контрольная группа)	109,8±7,4	224,5±9,8
У рожениц с изосенсибилизацией новорожденные с резус-отрицательной принадлежностью крови	98,8±10,4	483,5±19,8
		Р2-4<0,05
У рожениц с резус-конфликтом новорожденные с послеродовой желтушной формой ГБН	101,3±9,4	414,3±16,2
		Р3-4<0,05
С врожденной желтушной формой ГБН	79,9±7,3	433,5±18,3
		Р1-4<0,05

 

Из табл. 2 видно, что у изосенсибилизированных женщин, которые родили детей, впоследствии заболевших послеродовой желтушной формой ГБН, активность 5’-нуклеотидазы в сыворотке ретроплацентарной крови была в 4 раза выше, чем в венозной крови матерей в родах, а у женщин, родивших детей с признаками врожденной желтушной формы ГБН, активность фермента в сыворотке ретроплацентарной крови более чем в 5 раз превышала таковую в сыворотке венозной крови.

Увеличение активности 5’-нуклеотидазы в ретроплацентарной крови у резус-конфликтных пациенток обеих групп (Р <0,05), видимо, зависит от процесса деструкции, неизбежно возникающего в конце беременности. При отделении последа от стенок матки в III периоде родов образуется ретроплацентарная гематома, составляющая основу изливающейся затем ретроплацентарной крови, в которую поступает большое количество микровезикул из клеточных мембран. При резус-конфликте деструктивные явления более выражены [1, 2, 3, 5].

Активность 5’-нуклеотидазы в ретроплацентарной крови резус-иммунизированных родильниц, отражающая микровезикуляцию, позволяет объективно оценивать этот процесс.

Основным методом лечения тяжелых форм ГБН является заменное переливание крови (ЗПК). Его преимущество заключается в устранении главной причины болезни — гемолиза эритроцитов плода путем выведения поврежденных клеток, антител, способствующих гемолизу, и токсичного непрямого билирубина. Мы сравнили активность 5’-нуклеотидазы со значениями непрямого билирубина в сыворотке пуповинной крови в группах новорожденных (см. рис. 2). По нашим данным, нормальному уровню непрямого билирубина (61 мкмоль/л) в пуповинной крови здоровых новорожденных соответствует нормальная активность 5’-нуклеотидазы (90,01±6,14 нкат/л). У здоровых детей с резус-отрицательной принадлежностью крови он составил 74,47±7,12 нкат/л, а у новорожденных с послеродовой желтушной формой ГБН — 80,56±7,77 нкат/л. При врожденной желтушной форме гемолитической болезни уровни непрямого билирубина и 5’-нуклеотидазы в сыворотке пуповинной крови были повышены приблизительно в 2 раза. Коэффициент корреляции между этими показателями составил 0,42 (Р <0,05). Причина усиленной микровезикуляции при гемолитической болезни новорожденных очевидна. Фиксация антител на резус-положительных эритроцитах ведет к формированию и активации мембраноатакующего комплекса С5b-9 комплемента.

 

Рис. 2. Соотношение уровня билирубина (мкмоль/л) и активности 5’-нуклеотидазы (нкат/л) в пуповинной крови новорожденных при различных исходах родов.

Обозначения: незаштрихованные столбцы — непрямой билирубин, заштрихованные — 5’-нуклеотидаза; 1 — здоровые новорожденные (контрольная группа), 2 — новорожденные с резус-отрицательной принадлежностью крови, 3 — с послеродовой желтушной формой гемолитической болезни, 4 — с врожденной желтушной формой.

 

Активность 5’-нуклеотидазы определяли у новорожденных с гемолитической болезнью также в процессе выполнения ЗПК. Эти исследования были проведены у 14 новорожденных при ЗПК от одного до 3 раз. У всех к началу первого ЗПК имел место почасовой прирост непрямого билирубина. У 11 из 14 детей активность 5’-нуклеотидазы к началу первого ЗПК также возросла (179,6 нкат/л). 7 из 14 новорожденных было проведено по два ЗПК. К моменту окончания второго ЗПК у всех детей активность 5’-нуклеотидазы не выявлялась. Исчезновение ее активности в наших наблюдениях отражает, по-видимому, не отсутствие микровезикул, а ингибирование фермента стабилизатором крови цитратом, связывающим Са²⁺ (5’-нуклеотидаза — Са²⁺-зависимый фермент). Уровень же непрямого билирубина у новорожденных оставался повышенным еще в течение 1—3 суток и был в пределах, не требующих ЗПК.

Выводы

1. В крови женщин по мере нарастания срока беременности усиливается процесс микровезикуляции клеточных мембран.
2. При резус-конфликтной беременности процесс микровезикуляции более интенсивен, чем при физиологически протекающей беременности.
3. При внутриутробном поражении плода гемолитической болезнью (врожденная желтушная форма) наряду с повышением уровня непрямого билирубина в сыворотке крови резко усиливается процесс микровезикуляции.
4. Определение активности 5’-нуклеотидазы при гемолитической болезни новорожденных можно использовать в качестве дополнительного метода диагностики микровезикуляции при этой патологии.

About the authors

А. F. Subkhankulova

Kazan State Medical University

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com

Department of Biochemistry, Department of Obstetrics and Gynecology No. 2

Russian Federation, Kazan

D. M. Zubairov

Kazan State Medical University

Email: info@eco-vector.com

Academician of the Academy of NT, Professor, Head of the Department of Biochemistry, Department of Obstetrics and Gynecology No. 2

Russian Federation, Kazan

F. B. Subkhankulova

Kazan State Medical University

Email: info@eco-vector.com

Department of Biochemistry, Department of Obstetrics and Gynecology No. 2

Russian Federation, Kazan

B. G. Sadykov

Kazan State Medical University

Email: info@eco-vector.com

Department of Biochemistry, Department of Obstetrics and Gynecology No. 2

Russian Federation, Kazan

References

Supplementary files