Жидкостная биопсия протоковой аденокарциномы и предраковых состояний поджелудочной железы

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Рак поджелудочной железы (РПЖ) занимает 12-е место по заболеваемости и 7-е место по смертности среди всех онкологических заболеваний [1]. 90% РПЖ составляет протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (ПАПЖ) [1]. Относительная пятилетняя выживаемость пациентов с данным заболеванием не превышает 10–15% [1, 2]. Одной из причин столь высокой летальности является поздняя диагностика ПАПЖ [1]. Несмотря на применение современных методов диагностики, таких как компьютерная томография, магнитно-резонансная томография, эндосонография, биопсия под контролем ультразвукового исследования, анализ сывороточных маркёров (СА 19-9, ракового эмбрионального антигена), в настоящий момент лишь около 5% новообразований выявляются на I стадии [1]. В то же время клиническая манифестация и, как следствие, выявление около 70–80% ПАПЖ происходят на стадии локального распространения или метастазирования [1].

Скрининг ПАПЖ среди широких слоёв населения представляется неэффективным ввиду малой распространённости данного заболевания [2]. Вероятно, более целесообразным является поиск ПАПЖ среди лиц с состояниями, предрасполагающими к его развитию. Так, хронический панкреатит (ХП) считается одним из наиболее значимых факторов развития ПАПЖ и увеличивает вероятность возникновения данного новообразования в 2,7–16 раз [2]. К сожалению, пациенты с ХП имеют повышенный уровень СА 19-9 и изменённую структуру поджелудочной железы, из-за чего диагностика ПАПЖ на ранней стадии как с помощью анализа сывороточных маркёров, так и с помощью визуализационных методов у таких больных затруднена [3]. Гистопатологическое исследование является ключевым методом диагностики ПАПЖ, однако у пациентов с ХП, особенно в случае малого количества желёз, отсутствии признаков периневральной или сосудистой инвазии в биоптате, выявление данного новообразования остаётся сложной задачей, выполнение которой в значительной степени зависит от квалификации патологоанатома [4]. Предраковые состояния, к которым относят внутрипротоковую папиллярную муцинозную неоплазию (ВПМН) и внутриэпителиальную неоплазию поджелудочной железы (ВНПЖ) высокой степени злокачественности, также увеличивают риск развития ПАПЖ [5]. В то же время пятилетняя выживаемость пациентов с имеющимися ВПМН или ВНПЖ составляет более 85%, поэтому их раннее выявление может позволить существенно сократить смертность пациентов с ПАПЖ [6, 7]. К сожалению, в силу малых размеров, локализации поджелудочной железы и отсутствия клинических проявлений данные новообразования крайне редко выявляют с помощью современных методов лабораторного и инструментального анализа [8]. Биопсия с последующим гистопатологическим исследованием является «золотым стандартом» диагностики новообразований поджелудочной железы [9]. Чувствительность и специфичность тонкоигольной аспирационной биопсии под контролем эндоскопической ультрасонографии достигают 93,1 и 100% соответственно [8, 9]. К сожалению, данный метод, несмотря на свои преимущества, характеризуется затруднениями в оценке базальным мембран органа, нежелезистой структуры ткани, а также дифференциальной диагностике предраковых состояний и ПАПЖ, которые могут иметь схожие морфологические признаки [5, 9].

В настоящий момент наиболее оптимальным способом лечения протоковой аденокарциномы является комбинация химиотерапии и оперативного вмешательства [10]. Тонкоигольная биопсия под контролем ультрасонографии обязательна к выполнению для всех пациентов, которым планируется проведение химиотерапии, а также рекомендуется всем пациентам с подозрением на резектабельные новообразования поджелудочной железы. Однако в некоторых случаях операция выполняется без предварительного морфологического исследования новообразования [10]. К сожалению, до 5–10% пациентов, перенёсших резекцию сугубо на основе клинических и радиологических подозрений, на самом деле могут иметь доброкачественное или неопухолевое поражение поджелудочной железы [9, 11]. В идеальных условиях у таких пациентов должна была быть применена менее травматичная операция или вовсе консервативная терапия [12]. И наоборот — очаговые новообразования поджелудочной железы могут длительно протекать под маской ХП или псевдокист [13]. На сегодняшний день морфологическое исследование биопсийного материала является тем методом, который позволяет с высокой чувствительностью выявить наличие у пациента онкологического заболевания [9, 13]. К сожалению, данная операция является болезненной процедурой, сопряжённой с риском развития жизнеугрожающих состояний и диссеминации опухолевых клеток [10, 11].

Таким образом, морфологическое исследование биопсийного материала — ключевой метод выявления ПАПЖ и предраковых новообразований, однако существует необходимость в создании метода диагностики, который мог бы дополнять гистологическое исследование и позволял бы неинвазивно или малоинвазивно, а также с высокой эффективностью выявлять ПАПЖ и дифференцировать злокачественные новообразования, предраковые состояния и неопухолевые заболевания поджелудочной железы. В настоящее время уделяется всё больше внимания развитию жидкостной биопсии [19]. Данная технология основана на анализе опухолевых дериватов (внеклеточные опухолевые нуклеиновые кислоты, циркулирующие опухолевые клетки и т. п.) в биологических жидкостях организма. Целью обзора является рассмотрение характеристик жидкостной биопсии в диагностике ПАПЖ, её предшественников и доброкачественных заболеваний поджелудочной железы.

Настоящее исследование проведено с целью изучения характеристик анализа различных маркёров ПАПЖ в биологических жидкостях пациентов в диагностике и прогнозе данного новообразования. Поиск литературы проводили в базах данных eLibrary.Ru, КиберЛенинка, PubMed и Google Scholar. В исследовании учитывали оригинальные работы, опубликованные с 2010 по 2024 г. Ключевые слова включали: «жидкостная биопсия», «Liquid biopsy», «протоковая аденокарцинома поджелудочной железы», «Pancreatic ductal adenocarcinoma», «внеклеточная опухолевая ДНК», «Cell-free DNA», «внеклеточная опухолевая РНК», «Cell-free RNA», «метилирование», «Methylation», «циркулирующие опухолевые клетки», «Circulating tumor cells».

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОТОКОВОЙ АДЕНОКАРЦИНОМЫ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Как известно, развитие ПАПЖ представляет собой процесс, в ходе которого опухолевая клетка претерпевает множество преобразований, затрагивающих её генетическую и эпигенетическую регуляцию, а также антигенный состав (рис. 1). Поиск наиболее специфических изменений, характерных для большого числа пациентов и позволяющих выявить наличие опухолевой ткани, составляет одну из главных задач на пути развития жидкостной биопсии [2].

 

Рис. 1. Основные генетические, эпигенетические и антигенные изменения, характерные для процесса онкогенеза протоковой аденокарциномы поджелудочной железы. ВПМН — внутрипротоковая папиллярная муцинозная неоплазия; ПАПЖ — протоковая аденокарцинома поджелудочной железы.

Fig. 1. General genetic, epigenetic and molecular changes related to pancreatic ductal adenocarcinoma formation.

 

Генетические изменения

Отличительной особенностью ПАПЖ являются мутации кодонов 12, 13 и 61 гена KRAS, которые встречаются в 90–95% ПАПЖ и в 30–80% предраковых новообразований [2, 7]. Помимо них, к распространённым генетическим изменениям ПАПЖ относят мутации генов CDKN2A, TP53 и SMAD4, которые наблюдают у 70–80%, 50–70% и 50% пациентов соответственно. Они являются относительно поздними событиями в процессе онкогенеза и имеют значительно большее число кодонов с возможными мутациями. К менее часто встречающимся изменениям относятся мутации генов ARID1A, RNF43, TGFBR2, LRP1B, PREX2, GNAS и DNMT3A, которые возникают менее чем у 10% пациентов с ПАПЖ [7, 14, 15]. Среди них определённый интерес представляет мутация кодона 201 гена GNAS, которую фиксируют у 6% пациентов с ПАПЖ, но у 19–75% пациентов с ВПМН [16]. Другой особенностью ВПМН являются мутации гена RNF43, которые регистрируют в 0–10% ВПМН низкой степени злокачественности, но в 20–75% ВПМН высокой степени злокачественности [16].

Эпигенетические изменения

ПАПЖ характеризуется значительными изменениями паттернов эпигенетической регуляции, которые включают альтерации метилирования генов и концентраций ряда некодирующих РНК (нкРНК) [17, 18]. Наиболее часто гиперметилированными оказываются CpG-сайты генов-супрессоров опухоли: HOX, ZNF729, PRKCB, KLRG2, FGF10 и EGF, — а гипометилированными — сайты генов, провоцирующих опухолевое развитие: PTPRN2, HDAC4, SERPINB5 и EGFR. Помимо этого, в ПАПЖ наблюдается как гипо-, так и гиперметилирование NOTCH. Гены ppENK и CDKN2A являются гиперметилированными, а MUC4 — гипометилированным как в ПАПЖ, так и в предраковых новообразованиях [17, 18]. Частота гиперметилирования генов APC, WNK2 и CACNA1G растёт при увеличении степени злокачественности ВНПЖ [17, 18].

нкРНК также являются важным фактором эпигенетического регулирования работы клетки, влияющим на трансляцию матричной РНК. К основным типам нкРНК относят микроРНК, длинные некодирующие, а также кольцевые РНК (миРНК, днРНК и кРНК соответственно), из которых миРНК на сегодняшний момент считаются наиболее изученными. Среди нкРНК, чья экспрессия увеличивается при ПАПЖ, выделяют: миРНК-21, 186, 17-5р, 196b, днРНК HOTTIP, HOTAIR, PVT1, кРНК 0007367 и др. К онкосупрессирующим нкРНК, экспрессия которых обычно снижается в клетках ПАПЖ, относятся миРНК-506, 34, 142, 216b, 217, днРНК GAS5 и BC008363 [5, 19, 20]. Маркёры, экспрессия которых увеличивается в предраковых состояниях, включают миРНК-21, 486-3p, 338-3p, 196b и т. д. [9, 20]. В ВПМН высокой степени злокачественности отмечается уменьшение уровня миРНК-200a-3p, 1185-5p, 33a-5p, 574-3p, 663b и т. д. [21].

Изменения антигенного состава и морфологических характеристик опухолевой ткани

Морфологически ПАПЖ представляет собой железистые структуры неправильной формы с выраженной десмопластической реакцией стромы или в некоторых случаях с наличием саркомоподобного компонента с минимальной стромой между клетками [4]. Кроме того, обнаружение муцина при микроскопическом исследовании (в том числе с помощью окрашивания альциановым синим или муцинкармином) является важным диагностическим признаком муцинозных кистозных новообразований поджелудочной железы [9].

Клетки ПАПЖ характеризуются изменённым составом поверхностных антигенов, что может быть использовано с целью выявления циркулирующих опухолевых клеток. К антигенам, экспрессия которых значительно увеличивается в ПАПЖ по сравнению с нормальными клетками, относят MSLN, ANXA10 и GPC1 [22]. Клетки ПАПЖ также характеризуются наличием антигенов EpCAM и FAPα, а также продуктов экспрессии мутантных генов KRAS и TP53. Кроме того, экспрессия MUC1, MUC4, MUC5, а также CA19-9 характерна для ВНПЖ и ВПМН [9, 23, 24]. В то же время в клетках ПАПЖ отмечается сниженная экспрессия р16, метастина, а также исчезновение мембранного и появление цитоплазматического Е-кадгерина [4].

ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ ЖИДКОСТНОЙ БИОПСИИ ПРОТОКОВОЙ АДЕНОКАРЦИНОМЫ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ПРЕДРАКОВЫХ СОСТОЯНИЙ

Жидкостная биопсия позволяет обнаруживать наличие онкологического заболевания при помощи анализа опухолевых дериватов в биологических жидкостях организма. В настоящем разделе описаны различные способы выявления и количественного анализа подобных дериватов у лиц с ПАПЖ и высоким риском возникновения данного заболевания [25–34].

Внеклеточная ДНК

Внеклеточная ДНК (вкДНК) выделяется в процессе клеточной гибели или направленной секреции. Её концентрация в биологических жидкостях в норме не превышает 40 нг/мл, однако может в несколько раз увеличиваться при прогрессировании онкологических заболеваний ввиду возникновения гипоксической среды с низким рН, ведущей к стрессу и гибели клеток [25, 26]. Таким образом, вкДНК является важным маркёром данных состояний. В то же время на ранних стадиях её содержание может не отличаться от такового у пациентов с доброкачественными заболеваниями поджелудочной железы и здоровых людей [27]. Следовательно, для ранней диагностики онкологических заболеваний необходимо избирательное выявление опухолевой фракции вкДНК (воДНК). Данное положение является умозаключением авторов настоящей рукописи. Ввиду того, что генетический материал и клеточные процессы в опухолевых клетках подвергаются значительным изменениям, воДНК, как правило, в среднем на 20–30 п. н. короче нормальной вкДНК, что может быть использовано для ее дифференцирования [27]. К сожалению, на ранних стадиях доля воДНК в вкДНК относительно невысока, что препятствует её обнаружению на основе анализа размера её фрагментов [27]. Для этого более целесообразен анализ специфических изменений воДНК, которые включают генетический и эпигенетический компонент.

Выявление воДНК может производиться в различных биологических жидкостях, но наиболее часто изучаемым субстратом является плазма. Благодаря небольшому количеству мутационных сайтов и широкой распространённости среди пациентов однонуклеотидные замены в гене KRAS являются предпочтительными для анализа генетическими изменениями при ПАПЖ (табл. 1). Как чувствительность, так и специфичность выявления ПАПЖ на III–IV стадиях достигает 70–90% [28, 29], впрочем, в исследовании P. Kirchweger и соавт. чувствительность составляет 64,3% [30]. ПАПЖ на I–II стадиях выделяют значительно меньше воДНК, в результате чего чувствительность диагностики на основе выявления данного маркёра снижается до 30–35% при специфичности 99,5–100% [31–33]. В исследовании A. Berger и соавт. с помощью анализа мутаций GNAS в плазме также удалось выявить пациентов с ВПМН с чувствительностью и специфичностью лишь 50 и 100% соответственно (p <0,0001). При этом дифференцировка пациентов с ПАПЖ и с ВПМН производилась также с чувствительностью 50% при специфичности 100% [29]. Не менее важной задачей является дифференциальная диагностика протоковой аденокарциномы и ХП, а также доброкачественных новообразований поджелудочной железы. А.R. Wang и соавт. продемонстрировали возможность дифференциальной диагностики ПАПЖ и доброкачественного новообразования с чувствительностью 35,2% и специфичностью 88,6% при анализе мутаций KRAS [34].

Панкреатический сок является субстратом, более тесно контактирующим с опухолевой массой, ввиду чего он превосходит плазму по абсолютному содержанию воДНК более чем в 100 раз [35]. Было показано, что его исследование с помощью геномного секвенирования нового поколения (NGS) позволяет выявлять как ПАПЖ, так и ВПМН с чувствительностью, близкой к 100% [36, 37]. В нашей предыдущей экспериментальной работе также был изучен диагностический потенциал жидкостной биопсии плазмы и желчи в диагностике ПАПЖ. Чувствительность анализа желчи составила около 90%, в то время как анализа плазмы — лишь 60%. Желчь превосходила плазму как по абсолютному (248,6 [6, 743; 1068] копий/мл против 3,26 [0; 19, 225] копий/мл, р <0,001), так и по относительному (0,045 [0; 0, 413]% против 1,74 [0, 2; 11, 11]%, p=0,002) содержанию воДНК [38].

Анализ метилирования вкДНК также является перспективным с диагностической точки зрения. Чаще всего исследуют гены ADAMTS1, ADAMTS2, BNC1, BMP3 (табл. 2). Исследование метилирования одиночных генов позволяет диагностировать ПАПЖ с чувствительностью до 50–80% и специфичностью более 80% [39, 40]. С помощью комбинированного анализа метилирования ADAMTS1 и/или BNC1 можно диагностировать ПАПЖ I и II стадий с высокой (до 90–95%) чувствительностью [41]. В то же время высокопроизводительный анализ метилирования широких панелей генов позволяет диагностировать ПАПЖ с чувствительностью до 80–90% [42]. Эффективность анализа метилирования панелей генов подтверждается высокой (>90%) чувствительностью и специфичностью жидкостной биопсии при дифференциальной диагностике ПАПЖ и ХП [43, 44].

В работе S. Majumder и соавт. при анализе панкреатического сока чувствительность и специфичность диагностики ПАПЖ I–II стадии составили 70 и 86% соответственно [45]. Тогда как в исследовании S. Yokoyama и соавт. с помощью анализа метилирования генов семейства MUC, содержащихся в панкреатическом соке, удалось с чувствительностью 100% и специфичностью 88% выявить ВПМН кишечного типа [46].

Внеклеточная РНК

Выделение внеклеточной РНК, в отличие от вкДНК, происходит, как правило, вследствие направленной секреции, а не клеточной гибели [20]. При возникновении онкологических заболеваний в биологических жидкостях организма выявляются нкРНК, уровень экспрессии которых может в десятки раз отличаться от такового у здоровых людей, что можно использовать в диагностических целях [47–50].

Среди различных типов внеклеточных РНК в диагностике ПАПЖ наиболее подробно описаны миРНК-10b, 19b-3p, 21, 25-3p, 210 (табл. 3). Чувствительность и специфичность диагностики ПАПЖ при анализе лишь одной миРНК в сыворотке варьирует от 70 до 90% [47]. Однако диагностической мишенью исследований жидкостной биопсии, как правило, становятся панели миРНК, анализ которых способен выявить ПАПЖ с высокими чувствительностью и специфичностью (до 90–95%) [48]. В исследовании X. Lai и соавт. при анализе миРНК-10b, 21, 30c и 181a в плазме достигалась 100% чувствительность и специфичность, однако в данной работе было ограниченное количество участников: всего 29 пациентов с ПАПЖ и 6 здоровых добровольцев [49]. Таким образом, наиболее часто изучаемым маркёром среди внеклеточных РНК являются миРНК, впрочем, внимание уделяется и другим нкРНК. Так, в работе C. Xu и соавт., в которой изучался диагностический потенциал жидкостной биопсии ПАПЖ на основе анализа панели кРНК-0060733, 0006117, 0064288, 0007895 и 0007367, чувствительность оказалась равна 84%, а специфичность — 71% [50].

Анализ миРНК в плазме также показал хорошую способность к дифференциальной диагностике ПАПЖ и ХП (чувствительность и специфичность до 81,5 и 93,3% соответственно) [51–53]. Анализ миРНК-16, 21 и 25 в панкреатическом соке, по всей видимости, не обладает значительно большей эффективностью в дифференциальной диагностике ПАПЖ и ХП, по сравнению с анализом плазмы (чувствительность и специфичность 84,2 и 81,5% соответственно) [54]. К сожалению, дифференцировать ПАПЖ и другие новообразования поджелудочной железы оказывается сложнее. Так, в исследовании Z. Cao и соавт. при анализе ряда миРНК чувствительность и специфичность жидкостной биопсии составили 64,8 и 64,9% соответственно [51].

Что же касается ВПМН, анализ панели из 30 миРНК плазмы в исследовании J. Permuth-Wey и соавт. позволил диагностировать данное новообразование с чувствительностью и специфичностью 78,6% и 62,5% соответственно [55]. В работах N. Kuratomi и соавт. и С. Vicentini и соавт. показано, что плазма и панкреатический сок пациентов с ВПМН, ХП и здоровых добровольцев различаются по содержанию некоторых миРНК. К сожалению, авторы не ставили цель зафиксировать чувствительность и специфичность анализа [53, 56].

Циркулирующие опухолевые клетки

Циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) — гетерогенная клеточная популяция, включающая как жизнеспособные, так и апоптотические клетки, происходящие из первичной опухоли или её метастазов. Поскольку ЦОК сохраняют фенотипические и генотипические изменения опухоли, их анализ в плазме может являться многообещающим способом диагностики ПАПЖ [24, 57–61].

Несмотря на то что большая часть исследований жидкостной биопсии ПАПЖ на сегодняшний момент сосредоточена на анализе воДНК и воРНК, в некоторых работах, посвящённых выявлению ЦОК, были достигнуты значимые результаты. Как правило, выявление ЦОК выполняют с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), иммунофлуоресцентного или цитологического исследований. Клетка признаётся опухолевой, если имеет фенотип: CD45–, DAPI+, CK+, EpCAM+ (табл. 4). Анализ ЦОК в плазме крови позволяет с чувствительностью 50–90% и специфичностью около 100% диагностировать ПАПЖ [24, 57–59]. При этом частота обнаружения ЦОК была выше у пациентов с более высокой стадией ПАПЖ (от 60% на I–II стадии до 97% на стадии IV) [57, 58]. В исследовании J. Kuvendjiska и соавт. диагностика ВПМН при помощи анализа маркёров L1CAM+ VIM+ PDX1+ в крови обладала чувствительностью 37% и специфичностью 100% [60]. В исследовании E. Buscail и соавт. изучалась возможность дифференциальной диагностики ПАПЖ и ВПМН, однако чувствительность анализа не превышала 30% [61].

Чувствительность жидкостной биопсии в диагностике ПАПЖ при анализе ЦОК в панкреатическом соке составляет 77,8% [62]. Чувствительность и специфичность цитологического исследования панкреатического секрета в выявлении ВПМН в исследовании M. Tag-Adeen и соавт. не превышает 60 и 79% соответственно [63]. В то же время в исследовании K. Miyamoto и соавт. с чувствительностью 40% удалось выполнить дифференциальную диагностику ВПМН низкой и высокой степени злокачественности [64].

ОБСУЖДЕНИЕ

Гистопатологическое исследование биопсийного материала является важнейшим методом диагностики ПАПЖ, позволяющим с высокой чувствительностью и специфичностью обнаруживать даже очаговые новообразования поджелудочной железы [13]. Однако успех данной процедуры сильно зависит от квалификации патологоанатома и полноты взятия биоптата [4, 9]. Вероятно, жидкостная биопсия может найти применение как дополнительный метод диагностики онкологических заболеваний. Данная технология демонстрирует значительную (до 90–95%) чувствительность и специфичность в диагностике ПАПЖ на III–IV стадиях при анализе как внеклеточных нуклеиновых кислот, так и ЦОК в различных биологических жидкостях (табл. 1–4). В то же время наблюдаются ограничения, препятствующие выявлению ПАПЖ на более ранних стадиях, ВПМН, а также дифференциальной диагностике их с ХП и другими новообразованиями поджелудочной железы.

Основной причиной низкой чувствительности, вероятно, является малое количество специфических маркёров, выделяемых вышеуказанными новообразованиями, по сравнению с ПАПЖ на поздних стадиях. Так, концентрация вкДНК в плазме зачастую составляет до 30 нг/мл, в то время как панкреатический сок содержит до 2600 нг/мл вкДНК [35]. Как видно из приведённых исследований, анализ секрета поджелудочной железы в большинстве случаев обладает большей чувствительностью в диагностике ПАПЖ на I–II стадиях, а также дифференцировке их от ХП и ВПМН (табл. 1–4). К сожалению, ретрохолангиопанкреатография, в ходе которой осуществляется забор данного биоматериала, является дорогой, трудоёмкой и высокоинвазивной процедурой [36, 37]. Кроме того, её применение связано с риском возникновения холангита, панкреатита и кровотечений, что препятствует рутинному сбору панкреатического сока [65]. В нашем предыдущем исследовании показано, что желчь как субстрат, более тесно контактирующий с опухолевой тканью, также превосходит плазму по содержанию воДНК [38]. Её рутинный сбор возможен примерно в 40% случаев, когда ПАПЖ локализуется в головке поджелудочной железы и приводит к механической желтухе, требующей дренирования желчи. К сожалению, нарушение оттока происходит на поздней стадии, что препятствует раннему обнаружению ПАПЖ. Анализ желчи также, вероятно, не позволит диагностировать ПАПЖ, локализованную в теле или хвосте железы.

На результаты жидкостной биопсии также влияет количество исследуемого субстрата и способ выделения и анализа дериватов опухоли. В приведённых исследованиях выделение маркёров производилось из 0,2–10 мл плазмы и 0,2–1 мл панкреатического сока (табл. 1–4), что вкупе с использованием наборов для выделения нуклеиновых кислот с различной эффективностью могло влиять на результаты анализа [66]. Известно, что ПЦР в реальном времени (ПЦРрв) характеризуется меньшей чувствительностью при работе в диапазоне низких концентраций нуклеиновых кислот и слабой устойчивостью к ингибиторам ПЦР в отличие, например, от цифровой капельной ПЦР (цкПЦР) и NGS, что особенно заметно при анализе одиночных воДНК в плазме [67, 68]. Тем не менее при анализе панелей маркёров или исследовании панкреатического секрета, результаты ПЦРрв во многом сходны с таковыми у цкПЦР и NGS (табл. 1–4).

 

Таблица 1. Данные анализа генетических изменений внеклеточной опухолевой ДНК в диагностике протоковой аденокарциномы поджелудочной железы и предраковых состояний

Table 1. Analysis data of genetic alterations of cell-free DNA in diagnosis of pancreatic ductal adenocarcinoma and premalignant pancreatic neoplasms

Исследование	Участники исследования (n)	Биоматериал	Метод анализа	Мишени	Результаты
J. Wu и соавт., 2014 [28]	ПАПЖ: 36 Контроль: 24	Плазма (0,2 мл)	ПЦРрв	KRAS: G12V/D/R, G13S/D	Чувствительность 72,2% Специфичность 100%
A. Berger и соавт., 2016 [29]	ПАПЖ: 24 ВПМН: 21 Контроль: 38	Плазма*	цкПЦР	GNAS R201C/H KRAS G12V/D	ВПМН против контроля: Чувствительность 80,95% Специфичность 84,21% ПАПЖ против контроля: Чувствительность 83,33% Специфичность 92,11%
P. Kirchweger и соавт., 2022 [30]	ПАПЖ: 70	Плазма (10 мл)	цкПЦР	KRAS: G12V/D/C/A/S G13D/R/V Q61H/K/L Q61R, 183A>T, Q61H, 183A>C,	Чувствительность 64,3%
J. Cohen и соавт., 2017 [31]	ПАПЖ: 221 Контроль: 182	Плазма (7,5 мл)	Safe-SeqS	KRAS: G12V/D/R/A/C Q61H	Чувствительность 29,9% Специфичность 99,5%
K. Affolter и соавт., 2021 [32]	ПАПЖ: 14 Контроль: 4	Плазма (5 мл)	NGS	Панель из 118 генов	Чувствительность 35,7% Специфичность 100%
K. Watanabe и соавт., 2022 [33]	РПЖ без лечения: 71 РПЖ после лечения: 74	Плазма (4 мл)	NGS	Панель 52 генов	Чувствительность (без лечения) 56% Чувствительность (после лечения) 36%
R. Wang и соавт., 2022 [34]	ПАПЖ: 105 Доброкачественное новообразование ПЖ: 44	Плазма (2,5 мл)	цкПЦР	KRAS: G12V/D/R	Чувствительность 35,2% Специфичность 88,6%
A. Volckmar и соавт., 2019 [36]	ВПМН: 12 Псевдокисты: 3	Панкреатический сок (0,5 мл)	NGS	KRAS G12V/D/R, G13D/L Q61H GNAS R201C/H/S	Чувствительность 100% Специфичность 100%
M. Choi и соавт., 2019 [37]	ПАПЖ: 21	Панкреатический сок*	NGS	Панели мутаций KRAS, TP53	KRAS: Чувствительность 86% TP53: Чувствительность 29%
M. Jain и соавт., 2024 [38]	ПАПЖ: 95 ВПМН + доброкачественные новообразования ПЖ: 18 Контроль: 38	Плазма (5 мл) Желчь (5 мл)	цкПЦР	KRAS G12A/C/D/R/S/V, G13D, Q61H(183A>C)/ Q61H (183A>T)/ K/L/R	Плазма (ПАПЖ/контроль): Чувствительность 61,0% Специфичность 100% Плазма (ПАПЖ/другие новообразования): Чувствительность 61,0% Специфичность 94,0% Желчь: Чувствительность 90,0%

Примечание здесь и в табл. 2–4. ПАПЖ — протоковая аденокарцинома поджелудочной железы; РПЖ — рак поджелудочной железы; ХП — хронический панкреатит; ВПМН — внутрипротоковая папиллярная муцинозная неоплазия; цкПЦР — цифровая капельная полимеразная цепная реакция; Safe-SeqS — система безопасного секвенирования (safe-sequencing system); NGS — геномное секвенирование нового поколения. * Данные не указаны в публикации.

 

Таблица 2. Данные анализа метилирования внеклеточной опухолевой ДНК в диагностике протоковой аденокарциномы поджелудочной железы и предраковых состояний

Table 2. Cell-free DNA Methylation analysis data in diagnosis of pancreatic ductal adenocarcinoma and premalignant pancreatic neoplasms

Исследование	Участники исследования (n)	Биоматериал	Метод анализа	Мишени	Результаты
K. Shinjo и соавт., 2020 [39]	РПЖ: 47 Контроль: 14	Плазма (1 мл)	цкПЦР	ADAMTS2, HOXA1, PCDH10, SEMA5A, SPSB4	Чувствительность 49,0% Специфичность 86,0%
J. Yi и соавт., 2013 [40]	РПЖ: 42 Контроль: 26	Плазма*	ПЦРрв	ADAMTS1, BNC1	ADAMTS1: Чувствительность 48,0% Специфичность 92,0% BNC1: Чувствительность 79,0% Специфичность 89,0%
M. Eissa и соавт., 2019 [41]	ПАПЖ: 39 Контроль: 95 ХП: 8	Плазма (2 мл)	ПЦРрв	Промотеры ADAMTS1, BNC1	ПАПЖ/ контроль: Чувствительность 97,3% Специфичность 91,6% ПАПЖ/ ХП: Чувствительность 87,5% Специфичность 91,6%
H. Wu и соавт., 2022 [42]	ПАПЖ: 74 ХП: 25 Контроль: 65	Плазма (5 мл)	Секвенирование	Панель из 56 маркёров	ПАПЖ/контроль: Чувствительность 82% Специфичность 88% ПАПЖ/ХП: AUC 85,0%
T. Liggett и соавт., 2010 [43]	РПЖ: 30 ХП: 30	Плазма (0,2 мл)	ПЦРрв	Панель метилирования 17 генов	Чувствительность 91,2% Специфичность 90,8%
Y. Wu и соавт., 2023 [44]	ПАПЖ: 8 ХП: 8	Плазма (2 мл)	NGS	Панель метилирования 6 сайтов PRKCB и 4 сайтов KLRG2	AUC 100%
S. Majumder и соавт., 2021 [45]	ПАПЖ + ВПМН (группа 1) высокой степени: 38 Доброкачественное новообразование + контроль (группа 2): 73	Панкреатический сок (1 мл)	ПЦРрв	C13orf18, FER1L4, BMP3	Группа 1/группа 2: Чувствительность 83% Специфичность 86% ПАПЖ I–II стадий/группа 2: Чувствительность 70% Специфичность 86%
S. Yokoyama и соавт., 2014 [46]	ПАПЖ: 15 ВПМН кишечного типа: 8 Контроль: 2	Панкреатический сок*	ПЦРрв	MUC1, MUC2, MUC4	ПАПЖ/контроль: Чувствительность 87% Специфичность 80% ВПМН/контроль: Чувствительность 100% Специфичность 88%

Примечание здесь и в табл. 3, 4. ПЦРрв — ПЦР в реальном времени; AUC — площадь под ROC-кривой. * Данные не указаны в публикации.

 

Таблица 3. Данные анализа некодирующих РНК в диагностике протоковой аденокарциномы поджелудочной железы и предраковых состояний

Table 3. Analysis data of non-coding RNA in diagnosis of pancreatic ductal adenocarcinoma and premalignant pancreatic neoplasms

Исследование	Участники исследования (n)	Биоматериал	Метод анализа	Мишени	Нормализация	Результаты
R. Que и соавт., 2013 [47]	ПАПЖ: 22 Доброкачественные новообразования + ампуллярная карцинома + ХП + контроль: 47	Сыворотка (1 мл)	ПЦРрв	миРНК-21, 17-5p, 155, 196-а	U6	miR-17-5p: Чувствительность 72,7% Специфичность 92,6% miR-21: Чувствительность 95,5% Специфичность 81,5%
X. Zou и соавт., 2019 [48]	ПАПЖ: 30 Контроль: 30	Плазма (0,2 мл)	ПЦРрв	Панель: let-7b-5p, миРНК-192-5p, 19a-3p, 19b-3p, 223-3p, 25-3p	миРНК-34	Чувствительность 93,3% Специфичность 96,0%
X. Lai и соавт., 2017 [49]	ПАПЖ: 29 Контроль: 6	Плазма (0,25 мл)	ПЦРрв	миРНК-10b, 21, 30c, 181a	миРНК-425-5p	миРНК-10b/21/30c/181a: Чувствительность 100% Специфичность 100%
C. Xu и соавт., 2024 [50]	ПАПЖ: 88 Контроль: 46	Плазма (0,2 мл)	ПЦРрв	hsa_circ_0060733, 0006117, 0064288, 0007895, 0007367	Β-actin	Чувствительность 84,0% Специфичность 71,0%
Z. Cao и соавт., 2016 [51]	ПАПЖ: 156 Другие новообразования: 85 ХП: 57	Плазма (0,625 мл)	ПЦРрв	Панель 1: миРНК-486-5p, 126-3p, 106b-3p Панель 2: миРНК-486-5p, 126-3p, 106b-3p, 938, 26b-3p, 1285	U6, миРНК-16	ПАПЖ/ХП (панель 1): Чувствительность 82,7% Специфичность 84,4% ПАПЖ/другие новообразования (панель 2): Чувствительность 64,8% Специфичность 64,9%
S. Guo и соавт., 2021 [52]	ПАПЖ: 27 ХП: 15	Плазма (1 мл)	ПЦРрв	миРНК-95-3p, 26b-5p	Набор миРНК, выявлявшихся в каждом образце	Чувствительность 81,5% Специфичность 93,3%
C. Vicentini и соавт., 2020 [53]	ПАПЖ: 58 ВПМН: 20 ХП: 15	Плазма (0,4 мл)	FISH ПЦРрв	Панель 800 миРНК	U6	*
K. Nesteruk и соавт., 2022 [54]	ПАПЖ: 54 Контроль: 118	Панкреатический сок (0,2 мл) Плазма (0,2 мл)	ПЦРрв	ПС: миРНК-16, 21, 25 Плазма: миРНК-210, СА19-9	Среднее значение сигнала в группе контроля	Чувствительность 84,2% Специфичность 81,5%
J. Permuth-Wey и соавт., 2015 [55]	ВПМН: 42 Контроль: 24	Плазма (0,5 мл)	Прямое мультиплексное измерение экспрессии генов	Панель из 30 миРНК	мРНК генов «домашнего хозяйства» ACTB, B2M, GAPDH, RPL19, RPLP0	Чувствительность 78,6% Специфичность 62,5%
N. Kuratomi и соавт., 2021 [56]	ВПМН: 13	Панкреатический сок (0,5 мл)	NGS	миРНК-10a-5p, 106b-5p, 197-3p, 664a-3p, let-7d-3p	Уровни данных нкРНК в здоровых тканях	*

Примечание здесь и в табл. 4. FISH — флуоресцентная гибридизация in situ. * Данные не указаны в публикации.

 

Таблица 4. Данные анализа циркулирующих опухолевых клеток в диагностике протоковой аденокарциномы поджелудочной железы и предраковых состояний

Table 4. Analysis data of circulating tumor cells in diagnosis of pancreatic ductal adenocarcinoma and premalignant pancreatic neoplasms

Исследование	Участники исследования (n)	Биоматериал	Метод анализа	Мишени	Результаты
I. Freed и соавт., 2023 [24]	ПАПЖ: 68 Контроль: 11	Кровь (2 мл)	ПЦФМ	CD45– DAPI+ CK (++/+/–)/VIM (+/–) EpCAM+/FAPα+	Чувствительность 97,6% Специфичность 100%
H. Liu и соавт., 2017 [57]	ПАПЖ: 95 Контроль: 48	Кровь (2 мл)	FISH, ИФЛА	CD45– DAPI+ CEP8>2	Чувствительность 75,8% Специфичность 68,7%
J. Ankeny и соавт., 2016 [58]	ПАПЖ: 72 Контроль: 28	Кровь (4 мл)	ИФЛА	CD45– DAPI+ CK+/ CEA+	Чувствительность 75,0% Специфичность 96,4%
E. Dotan и соавт., 2016 [59]	РПЖ: 50	Кровь (7,5 мл)	FISH	CD45– DAPI+ CK+ MUC-1	Чувствительность 48%
J. Kuvendjiska и соавт., 2023 [60]	ВПМН: 27 Контроль: 5	Кровь (6 мл)	ИФЛА	EpCAM+ L1CAM+ VIM+ PDX1+	Чувствительность 37% Специфичность 100%
E. Buscail и соавт., 2019 [61]	ПАПЖ: 22 ВПМН: 8 Контроль: 20	Кровь (7,5 мл)	ИФЛА	CD45- DAPI+ CK+ EpCAM+	Чувствительность (ПАПЖ/ВПМН) 30% Специфичность (ПАПЖ/ВПМН) 100% Чувствительность (ПАПЖ/контроль) 50% Специфичность (ПАПЖ против контроль) 90%
E. Buscail и соавт., 2019 [61]	ПАПЖ: 22 Контроль: 20	Кровь (7,5 мл)	ИФЛА	GPC1	Чувствительность 50% Специфичность 90%
K. Kitagawa и соавт., 2023 [62]	ПАПЖ: 9 Контроль: 13	Панкреатический сок*	Цитологическое исследование	—	Чувствительность 77,8% Специфичность 100%
M. Tag-Adeen и соавт., 2018 [63]	ВПМН: 29	Панкреатический сок*	Цитологическое исследование	—	Чувствительность 60% Специфичность 79%
K. Miyamoto и соавт., 2020 [64]	Злокачественная ВПМН: 15 Доброкачественная ВПМН: 23	Панкреатический сок*	Цитологическое исследование	—	Чувствительность 40,0% Специфичность 100%

Примечание. ИФЛА — иммунофлуоресцентный анализ; ПЦФМ — проточная цитофлуориметрия. * Данные не указаны.

 

Бисульфитная конверсия — метод, используемый для анализа метилирования воДНК в некоторых исследованиях. Ввиду того, что данная реакция может приводить к деградации 50–90% нуклеиновых кислот, диагностика ПАПЖ с её использованием характеризуется чувствительностью до 50% [39, 40, 69]. Анализ эпигенетической регуляции панелей генов позволяет увеличить чувствительность до 82% [42]. Однако использование метил-чувствительных рестриктаз, высокоспецифичных к определённым участкам ДНК, может значительно снизить потери воДНК и увеличить чувствительность анализа до 91% [43, 70]. К сожалению, далеко не все последовательности нуклеотидов, содержащие перспективные для анализа участки метилирования, несут сайты рестрикции, пригодные для применения созданных на текущий момент рестриктаз [71].

Поиск ЦОК осуществлялся, как правило, с помощью цитологического исследования, которое зависит от квалификации персонала. Это могло стать причиной относительно низкой (30–80%) чувствительности диагностики (см. табл. 4). Исследование I. Freed и соавт., в котором использовалась проточная цитометрия, характеризовалось крайне высокой чувствительностью 97,6%. В то же время в данной работе не были указаны клинические характеристики участников исследования, в том числе стадии заболевания [24]. Существуют и другие данные в пользу того, что выявление ЦОК при помощи цитологического исследования позволяет с чувствительностью свыше 90% обнаружить ПАПЖ на IV стадии [58]. Однако данных для оценки эффективности подобного подхода на ранних стадиях заболевания недостаточно.

Наконец, чувствительность и специфичность жидкостной биопсии определяются разнообразием и количеством исследуемых маркёров. Как правило, анализ панелей превосходит анализ одиночной молекулы (табл. 1–3). При комбинированном анализе воДНК/миРНК и СА19-9 чувствительность диагностики ПАПЖ на ранних стадиях повышается до 70–80%, а специфичность — до 95% [28, 50]. К сожалению, в рассмотренных нами работах не исследовались некоторые маркёры, которые могли бы значительно увеличить эффективность анализа. К таковым относятся, например, воДНК с мутациями генов CDKN2A, TP53 и SMAD4, встречающимися у 30–70% пациентов с ПАПЖ, или мутациями гена GNAS, которые наблюдаются в значительной доле ВПМН [16]. Кроме того, не анализировалось наличие MUC1, MUC2 и MUC4 в качестве маркёров ЦОК.

В настоящем обзоре обсуждали исключительно диагностическую роль жидкостной биопсии. Однако стоит отметить, что данный метод способен выполнять более широкий спектр задач. Во-первых, с помощью жидкостной биопсии возможно прогнозирование течения ПАПЖ. Известно, что пациенты с MUC-1-положительными ЦОК имеют более низкую среднюю выживаемость [2,7 мес (95% доверительный интервал (ДИ) 0,1–7,6)] по сравнению с пациентами с MUC-1-отрицательными ЦОК [9,6 мес (95%ДИ 3,9–12,8); p=0,044] или их отсутствием [8,8 мес (95%ДИ 6,0–10,9) p=0,014] [59]. Кроме того, наличие некоторых генетических изменений, например, мутаций KRAS G12V и G12D является неблагоприятным фактором выживаемости пациентов, тогда как генотипирование нерезектабельной опухоли с целью их обнаружения может выполняться посредством жидкостной биопсии [34]. миРНК-335-5p в сочетании с миРНК-340-5p являются потенциальными прогностическими биомаркерами метастазирования [52]. В исследовании J. Ankeny и соавт. пациенты с ЦОК ≥3 на 4 мл крови имели в 6,39 раза большую частоту наличия метастатического поражения на момент первичного обследования по сравнению с пациентами с меньшей концентрацией свободных клеток [58]. Наконец, количество воДНК и миРНК в биологических жидкостях пациента, как правило, уменьшается после успешных хирургического вмешательства или применения курса химиотерапии, что теоретически позволяет оценить эффективность лечения [30, 49].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, жидкостная биопсия поджелудочной железы является перспективным инструментом диагностики, прогноза и определения эффективности терапии ПАПЖ. Несмотря на ограничения в выявлении ПАПЖ на ранней стадии и ВПМН, а также дифференциальной диагностике этих состояний с доброкачественными заболеваниями поджелудочной железы, жидкостная биопсия может найти место в клинической практике. Однако данная технология пока что не способна заменить классические методы диагностики, в особенности гистопатологическое исследование. Для её развития необходимы стандартизация применяемых протоколов, а также проведение более крупных рандомизированных исследований, в том числе с определением выгоды от внедрения подобных высокотехнологичных процедур для системы здравоохранения.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: А.Д.П. — концептуализация, анализ, создание черновика, редактирование рукописи; Р.Т.И. — концептуализация, анализ, создание черновика, редактирование рукописи; Д.М. — концептуализация, редактирование рукописи, валидация; С.Л.М. — концептуализация, редактирование рукописи, валидация; Е.В.И. — редактирование рукописи, валидация, общее руководство.

Источник финансирования. Исследование выполнено в рамках государственного задания Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Благодарности. Мы благодарим Татьяну Евгеньевну Дахтлер за помощь в концептуализации и редактировании рукописи.

ADDITIONAL INFORMATION

Authors’ contribution. D.P.A. — conceptualization, formal analysis, writing — original draft, writing — review and editing; T.I.R. — conceptualization, formal Analysis, writing — original draft, writing —review and editing; M.J. — conceptualization, writing — original draft, validation; L.M.S. — conceptualization, writing — original draft, validation; V.I.E. — writing — original draft, validation, supervision. Thereby, all authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

Funding source. The study was carried within the state assignment of Lomonosov Moscow State University.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Acknowledgments. We highly appreciate the help of Tatjana Dakhtler in conceptualization and editing the review.

Об авторах

Давид Павлович Атаян

Ильинская больница

Email: d.atayan@ihospital.ru
ORCID iD: 0000-0001-9816-3008

зав. отд., отд. онкологии и гематологии

Россия, пос. Ильинское

Тагир Ирекович Рахматуллин

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Университетская клиника Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: tagir.rakhmatullin@internet.ru
ORCID iD: 0000-0002-4601-3478
SPIN-код: 7068-1678

студ., стажёр, отд. лабораторной диагностики

Россия, 119991, ул. Ленинские горы, д. 1, Москва; г. Москва

Марк Джайн

Университетская клиника Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Email: jain-mark@outlook.com
ORCID iD: 0000-0002-6594-8113
SPIN-код: 3783-4441

канд. биол. наук, ст. науч. сотр., отд. лабораторной диагностики

Россия, г. Москва

Лариса Михайловна Самоходская

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Университетская клиника Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Email: slm@fbm.msu.ru
ORCID iD: 0000-0001-6734-3989
SPIN-код: 5404-6202

канд. мед. наук, доц., зав. отд., отд. лабораторной диагностики

Россия, 119991, ул. Ленинские горы, д. 1, Москва; г. Москва

Вячеслав Иванович Егоров

Ильинская больница

Email: egorov12333@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8805-7604
SPIN-код: 4487-1663

д-р мед. наук, проф., рук. службы гепато-панкреато-билиарной хирургии

Россия, пос. Ильинское

Список литературы

Дополнительные файлы