К вопросу о цитохимическом исследовании лейкоцитов

Аннотация

Цитохимические исследования лейкоцитов приобрели в настоящее время большое теоретическое и практическое значение.

Полный текст

Одним из перспективных направлений современной гематологии является разработка анализа ферментного спектра и выделение пулов клеток с различными ферментными характеристиками. Известно, что в лейкоцитах имеет место своеобразная кооперация активности различных энзимов. При раздельном изучении ферментов такая кооперация не выявляется. Несмотря на актуальность проблемы одновременного определения двух или нескольких ферментов в лейкоцитах, мы нашли в литературе лишь единичные описания подобных методов.

Нами предложены методы сочетанного выявления активности кислой (КФ) и щелочной (ЩФ) фосфатаз в нейтрофилах и сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и кислой фосфатазы в лимфоцитах на мазках периферической крови. Методы заключаются в последовательной локализации в лейкоцитах активности сначала одного, а затем второго фермента. Конечные продукты первой и второй цитохимических реакций, должны иметь различный цвет.

Для окраски на фосфатазы был применен метод М. Берстона, модифицированный нами (автор пользовался им для выявления КФ и ЩФ в гистологических препаратах кости). Тонкие мазки периферической крови фиксировали в охлажденном (4°С) 60% ацетоне с добавлением ЭДТА в течение 30 с, ополаскивали в воде и инкубировали в среде Гольдберга и Барка при температуре 37° в течение 2 ч. Для выявления-активности ЩФ окрашенные на КФ мазки погружали в раствор, состоящий из нафтола AS-МХ-фосфата (0,1 мкг/мл) и прочного синего РР (0,2 мкг/мл) в 0,2 М трис буфере pH 9,2, на 40 мин при комнатной температуре. Ядра лейкоцитов докрашивали, 2% раствором метилового зеленого. При иммерсионной микроскопии таких мазков в сегментоядерных нейтрофилах обнаруживаются мелкие пылевидные гранулы красного цвета — активность КФ и крупные синие — активность ЩФ. Предложенный метод позволяет подразделить нейтрофилы на три пула по содержанию КФ и ЩФ. Первый пул характеризуется содержанием в клетках КФ и ЩФ одновременно, второй и третий не содержат активной щелочной фосфатазы и имеют низкое и высокое содержание КФ соответственно.

Второй метод дает возможность одновременно выявлять СДГ и КФ в лимфоцитах. Он состоит в следующем. Фиксированные в ацетоне препараты (см. выше) помещали на «рельсы» во влажную камеру мазком вверх. На них наносили несколько капель инкубационной среды, содержащей сукцинат натрия (10 мкг/мл), нитротетразолиевый синий (1 мкг/мл) на 0,2 М фосфатном буфере pH 7,4, и инкубировали в течение часа при 37°. Затем мазки промывали, содержание КФ определяли описанным выше методом. При микроскопии в лимфоцитах наблюдались мелкие синие гранулы (СДГ-активпость) и участки цитоплазмы, окрашенные в красный цвет (активность КФ).

Сочетанное определение в лейкоцитах двух ферментов позволит глубже изучить функциональное состояние каждой отдельной клетки, расширит диагностические возможности цитохимических методов.

Методы оформлены в виде рацпредложений № 27 и № 28 за 1976 г. в КГМ.И.