Уровень маркёров апоптоза и пролиферации клеток в зоне рестеноза после реконструктивных вмешательств на артериях нижних конечностей

Полный текст

Актуальность. В настоящий момент отмечают постоянный рост количества реконструктивно-восстановительных вмешательств на магистральных артериях нижних конечностей. Успех хирургического лечения ведёт к купированию ишемии нижних конечностей и улучшению качества жизни пациента. Однако развитие рестеноза зоны вмешательства сводит на нет успех операций и требует повторных реконструкций.

Гиперплазия неоинтимы (НИ) — одна из основных причин, ведущих к рестенозу. Пролиферативный ответ интимы представляет собой часть процесса нормального заживления сосудистой стенки после операционной травмы. Однако в ряде случаев происходит развитие неконтролируемой гиперплазии НИ, предотвращение и контроль которой остаются нерешённой проблемой [1].

В последнее время ряд исследований, посвящённых изучению патогенеза данного осложнения, показывает, что система апоптоза может играть важную роль в развитии гиперпла-
зии НИ [2].

Апоптоз — форма генетически запрограммированной гибели клеток, которая играет ключевую роль в регуляции клеточного состава различных тканей, в том числе и артериальной стенки, как в норме, так и при атеросклеротическом поражении [3, 4].

Современные методы диагностики (световая микроскопия, проточная цитометрия и др.) позволяют определять морфологические признаки апоптоза — уменьшение размера клетки, сморщивание цитоплазматической мембраны, конденсация ядра, разрывы нитей ядерной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и др. Более информативным способом служит определение биохимических маркёров апоптоза, дающее практические точки приложения для терапевтического воздействия при лечении пациентов с облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей (­ОААНК) [5].

В доступной литературе баз данных Pub­med, Elibrary, Google Scholar, Medline исследований, посвящённых изучению лабораторных маркёров апоптоза в зоне рестеноза у пациентов ОААНК, найдено не было.

К основным маркёрам, участвующим в регуляции системы апоптоза в клетках сосудистой стенки относятся белки семейства Всl2, р53 [6].

Р53 представляет собой стресс-зависимый белок, который активируется различными стимулами (повреждение ДНК, гипоксия, окислительный стресс), присутствующими при атеросклерозе. После активации он тормозит смену фаз клеточного цикла, поддерживая тем самым стабильный клеточный состав. Своё участие в регулировании апоптоза он осуществляет либо через белки семейства Всl2 (индуцируя проапоптотический белок Вах при ингибировании антиапоптотического белка Всl2), либо через рецепторный путь (индуцируя взаимодействие Fas-рецептора с Fas-лигандом с последующей активацией каспаз) [7].

R.Y. Cao и соавт. (2017) показали, что у мышей, лишённых гена белка р53, происходит ускоренное развитие атеросклеротического поражения, причём гладкомышечные клетки (ГМК) имеют увеличенную скорость пролиферации на фоне незначительной их гибели [8].

Другой активный участник системы апоптоза — семейство белков Вcl2. К основным его представителям относятся антиапоптотический белок Всl2 и проапоптотический белок Вах. Их соотношение Всl2/Вах в митохондриальной мембране определяет судьбу клетки и называется проапоптотическим индексом. Данные белки были обнаружены в клетках атеросклеротической бляшки (преимущественно ГМК и макрофаги) при различной локализации поражения [9]. Рядом учёных показано, что два противоположных клеточных процесса, пролиферация и апоптоз, существуют вместе в зоне рестеноза сонной артерии крысы после баллонной ангиопластики [10].

Роль пролиферации и миграции клеток в формировании гиперплазии НИ в зоне рестеноза доказана экспериментальными и клиническими исследованиями. Один из ключевых представителей пролиферации и миграции клеток, принимающий участие в формировании гиперплазии НИ, — тромбоцитарный фактор роста ВВ (PDGF ВВ — от англ. platelet-­derived growth factor). В ответ на операционную травму он активируется в первые часы и индуцирует миграцию ГМК из медии в интиму. Применение ингибиторов PDGF ВВ в экспериментальных моделях приводило к уменьшению формирования НИ. Однако взаимосвязь и соотношение PDGF ВВ с маркёрами апоптоза в развитии гиперплазии НИ изучены недостаточно, а полученные результаты противоре­чивы [11].

Цель. Исходя из вышеизложенного, была сформулирована цель нашего исследования: оценка количества маркёров апоптоза и пролиферации клеток, а также их взаимосвязей в зоне рестеноза артериальных реконструкций.

Материал и методы исследования. В когортное исследование были включены 14 пациентов c 2019 по 2020 г. с диагнозом «ОААНК. Посттромботическая окклюзия синтетических бедренно-подколенных шунтов выше щели коленного сустава». Все пациенты были мужского пола с III стадией заболевания по классификации А.В. Покровского–Фонтейна. Средний возраст пациентов составил 65±3,4 года, давность заболевания — 9±2,5 мес после первоначального реконструктивно-восстановительного вмешательства.

Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом Рязанского государственного медицинского университета им. И.П. Павлова (№7 от 03.03.2020).

После проведённого дополнительного обследования (ультразвуковое дуплексное сканирование, ангиография артерий нижних конечностей) пациенты подвергались повторным артериальным реконструкциям на базе Областной клинической больницы г. Рязани. Интраоперационно производили забор материала, представляющего собой дистальный анастомоз синтетического бедренно-подколенного шунта (раннее шунтабельная артерия, участок самого протеза с неоинтимальной выстилкой).

В качестве контроля использовали образцы артериальной стенки, полученные во время эксплантации органов от посмертных доноров без ОААНК (по данным ультразвукового дуплексного сканирования артерий нижних конечностей). Количество образцов — 8. Участок их забора — подколенная артерия. Все доноры были мужского пола, средний возраст составил 61±4,4 года. Различия по возрасту между исследуемой группой и группой контроля отсутствовали (р=0,143).

Образцы измельчали и готовили гомогенат с помощью лизирующего буфера Thermo Fisher Scientific (США) и роторного высокоскоростного гомогенизатора DIAX 900 (Heidolph, Германия) (насадка 6G), со скоростью 24 000 об./мин в течение 60 с при температуре +2 °C. Полученный гомогенат центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин (температура +2 °C). В полученном супернатанте определяли количество протеина Bcl-2 с помощью коммерческого набора Invitrogen (США), уровень Bcl2-ассоциированного белка X (Bax — от англ. Bcl2 associated X protein) — с помощью набора Cloud-Clone Corporation (Китай) количество белка р53 — с помощью набора Invitrogen (США), количество PDGF ВВ — с помощью набора Invitrogen (США) методом иммуноферментного анализа. Полученные показатели пересчитывали на содержание белка, которое оценивали по методу Бредфорда с помощью Coomassie Plus (Bradford) AssayKit (Thermo Fisher Scientific, США).

Статистический анализ полученных данных производили после оценки распределения показателей по критерию Шапиро–Уилка (р >0,05) с использованием пакета статистических программ Statistica 10.0. В связи с отклонением от нормального распределения данных для дальнейшего анализа применяли непараметрические тесты. Групповые различия оценивали с помощью критерия Манна–Уитни. Коэффициенты корреляции определяли с помощью теста Спирмена. Данные представлены медианой и межквартильным интервалом — Me (Q1–Q3). Принятый уровень статистической значимости — р <0,05.

Результаты. В ходе исследования было показано, что количество белка р53 в образцах с рестенозом было ниже значений в нормальной артериальной стенке — в 2 раза (р=0,015).

Количество PDGF ВВ в образцах с рестенозом превышало на 23,5% его количество в контрольных образцах (р=0,05).

В зоне рестеноза количество антиапоптотического белка Всl2 было повышено на 59% (р=0,008), а проапоптотического белка Вах — на 73% (р=0,25), соотношение Всl2/Вах — на 71% (р=0,473) по сравнению с их количеством в контрольных образцах (табл. 1).

 

Таблица 1. Маркёры апоптоза и пролиферации клеток у пациентов с рестенозом зоны реконструкции

Показатели, Me [Q1–Q3]	Р53, ед./мг	PDGF ВВ, нг/мг	Всl2, нг/мг	Вах, нг/мг	Всl2/Вах
Образцы с рестенозом зоны артериальной реконструкции	0,07 [0, 06; 0, 08]	0,17 [0, 09; 0, 34]	1,61 [1, 21; 1, 8]	6,0 [5, 1; 7, 2]	0,28
Образцы с нормальной артериальной стенкой	0,14 [0, 09; 0, 24]	0,04 [0, 02; 0, 09]	0,9 [0, 77; 1, 26]	4,4 [3, 2; 6, 7]	0,20
р	0,015*	0,05*	0,008*	0,25	0,473

Примечание: *статистически значимое отличие (р <0,05); Ме — медиана; Q1–Q3 — нижний и верхний квартили; PDGF ВВ — тромбоцитарный фактор роста ВВ.

При проведении корреляционного анализа была выявлена взаимосвязь между р53 и PDGF ВВ (r=–0,724, р=0,002), а также между PDGF ВВ и Всl2 (r=0,672, р=0,003) в образцах с рестенозом зоны вмешательства (рис. 1, 2). В контрольных образцах была обнаружена прямая взаимосвязь между PDGF BB и Вах (r=0,754, р=0,031).

 

Рис. 1. Обратная корреляционная взаимосвязь между показателями белка р53 и тромбоцитарным фактором роста ВВ (PDGF BB) у пациентов с рестенозом зоны реконструкции

 

Рис. 2. Прямая корреляционная взаимосвязь между тромбоцитарным фактором роста ВВ (PDGF BB) и белком Bсl2 у пациентов с рестенозом зоны реконструкции

 

Обсуждение. Результаты проведённого исследования показали, что в нормальной артериальной стенке существует баланс между апоптозом клеток и их пролиферацией. Корреляционная взаимосвязь между PDGF ВВ и проапоптотическим белком Вах доказывает, что эти два процесса взаимосвязаны и уравновешивают друг друга. В норме в ответ на гибель клеток в сосудистой стенке происходит компенсаторное замещение за счёт увеличения пролиферации и миграции соседних клеток на фоне роста новых под действием митогенных сигналов, вырабатываемых апоптотическими клетками [12].

Совсем иную картину мы получили в образцах с рестенозом зоны вмешательства.

Повышенный уровень PDGF ВВ свидетельствует о высокой пролиферативной активности клеток в области рестеноза. Пролиферация клеток, образование и ремоделирование внеклеточного матрикса — общеизвестные механизмы образования рестенотических повреждений.

В свою очередь белок р53 в низких количествах не смог вызвать активацию апоптоза через белок Вах, а даже наоборот, за счёт его контроля в регуляции клеточного цикла способствовал пролиферации клеток, усиливая митогенный эффект PDGF ВВ, что подтверждено проведённым корреляционным анализом. Остановка клеточного цикла, регуляция системы апоптоза, подавление пролиферации и миграции клеток — основные точки приложения действия белка р53, что было доказано в различных работах. Так, увеличенная экспрессия гена белка р53 приводит к уменьшению утолщения интимы на ≈80% в послеоперационном ­периоде [13].

Это обусловлено тем, что повышенное количество белка р53 ведёт к уменьшению включения тимидина в пролиферирующие ГМК, стимулированного PDGF BB. После этого в данных клетках быстрее заканчивается фаза смены фенотипа на синтетический, следовательно, они меньше пролиферируют и мигрируют в формирующуюся НИ.

S.J. George продемонстрировал на животных, что сверхэкспрессия p53 способствует активации апоптоза при ингибировании миграции ГМК, что приводит к уменьшению толщины НИ после аутовенозного шунтирования [14]. G. Bauriedel и соавт. показали с помощью TUNEL-метода, что область рестеноза содержит меньшее количество апоптотических клеток, чем атеросклеротическая бляшка [15]. Любопытное исследование провёл S. Scott, применяя брахитерапию для лечения рестеноза, что приводило к активации р53 и индукции апоптоза в рестенотических ГМК. Данные клетки оказались более чувствительны к апоптозу вызванному p53, чем неповреждённые клетки сосудистой стенки [16].

Интересен тот факт, что в данных образцах мы обнаружили статистически значимое повышение количества антиапоптотического белка Всl2. В ранее проведённых исследованиях было отмечено, что клетки в зоне гиперплазии НИ менее чувствительны к апоптозу, чем клетки медии. Однако механизм данного процесса был до конца не определён [17].

Мы можем предположить, что именно повышенный уровень белка Вcl2 защищает пролиферирующие клетки НИ от гибели, увеличивая период их жизни (прямая корреляционная взаимосвязь между Вcl2 и PDGF BB). С одной стороны, такое повышение количества белка Вcl2 может быть обусловлено сменой фенотипа ГМК от сократительного к синтетическому после операционной травмы. С другой стороны, белок р53 осуществляет своё действие — запуск апоптоза через семейство белков Всl2 (увеличивая соотношение Вах/Всl2) и пониженный его уровень могли способствовать повышению количества Всl2.

В образцах с рестенозом количество Вах было повышено, но статистически незначимо, поэтому он не смог уравновесить такой усиленный пролиферативный ответ, что возможно, повлияло на развитие данного осложнения.

К ограничениям нашего исследования можно отнести то обстоятельство, что пока были определены только основные маркёры митохондриального пути апоптоза (белки Всl2 и Вах). На наш взгляд, также необходимо изучить состояние рецепторного пути апоптоза — систему «рецептор Fas — лиганд Fas» и её соотношение с маркёрами Всl2, Вах, р53 и PDGF ВВ. Дальнейший поиск показателей, ведущих к развитию рестеноза зоны реконструкции, позволит найти новые стратегии в предотвращении данного осложнения.

Выводы

1. Сниженная активность апоптоза, выражающаяся в низких значениях белка р53 (0,07 ед./мг) на фоне повышенного соотношения Всl2/Вах (0,28), ведёт к усилению пролиферативного ответа клеток сосудистой стенки в зоне рестеноза артериальной реконструкции.
2. При проведении корреляционного анализа выявлена взаимосвязь между р53 и тромбоцитарным фактором роста ВВ (r=–0,724, р=0,002), тромбоцитарным фактором роста ВВ и Всl2 (r=0,672, р=0,003) в образцах с рестенозом зоны вмешательства.

 

Участие авторов. Р.Е.К. и И.А.С. — концепция и дизайн исследования; Э.А.К. и А.В.Щ. — анализ полученных данных, хирургическое лечение, написание текста, список литературы; А.А.Г. — хирургическое лечение; О.В.П. — анализ полученных данных.
Источник финансирования. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликтов интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

Об авторах

Роман Евгеньевич Калинин

Рязанский государственный медицинский университет

Email: klimentowa.emma@yandex.ru
Россия, г. Рязань, Россия

Игорь Александрович Сучков

Рязанский государственный медицинский университет

Email: klimentowa.emma@yandex.ru
Россия, г. Рязань, Россия

Эмма Анатольевна Климентова

Областная клиническая больница

Автор, ответственный за переписку.
Email: klimentowa.emma@yandex.ru
Россия, г. Рязань, Россия

Алексей Владимирович Щулькин

Рязанский государственный медицинский университет

Email: klimentowa.emma@yandex.ru
Россия, г. Рязань, Россия

Александр Андреевич Герасимов

Областная клиническая больница

Email: klimentowa.emma@yandex.ru
Россия, г. Рязань, Россия

Владислав Олегович Поваров

Рязанский государственный медицинский университет

Email: klimentowa.emma@yandex.ru
Россия, г. Рязань, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы