Активность ферментов, разрушающих внеклеточные нуклеотиды, в тканях крыс с вальпроатной моделью аутизма

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Эктонуклеотидазы — группа ферментов, которые расположены на поверхности клеток и гидролизуют внеклеточные нуклеотиды до нуклеозидов. Это важный механизм регулирования концентрации этих нуклеотидов, которые могут оказывать разнообразное биологическое воздействие, в частности существенно изменять влияние эндогенных лигандов на пуринергические P2-рецепторы и аденозиновые рецепторы [1].

Существует несколько типов эктонуклеотидаз: экто-нуклеозид-5′-трифосфат-дифосфогидролазы (NTPDазы, также известные, как CD39-семейство экто-апираз); экто-нуклеотид-пирофосфатазы/фосфодиэстеразы (NPP); гликозилфосфатидилинозитол (GPI)-связанная экто-5′-нуклеотидаза (экто-5′-НТ, также известная как CD73); GPI-связанные щелочные фосфатазы (AP). Эти ферменты играют важную роль в регулировании экстрацеллюлярных нуклеотидов и P2-рецепторной сигнализации [2].

CD39 и CD73 — это две связанные между собой эктонуклеотидазы, которые играют важную роль в регуляции иммунной системы и метаболизме нуклеотидов. CD39 [также известный, как экто-нуклеозид-5′-трифосфат-дифосфогидролаза-1 (NTPDаза-1)] служит мембранным гликопротеином, который преобразует аденозинтрифосфат (АТФ) и другие нуклеотиды в аденозиндифосфат (АДФ) и аденозинмонофосфат (АМФ), а затем в соответствующие нуклеозиды.

Подвергая гидролизу АТФ и другие нуклеотиды внеклеточного пространства до АДФ и АМФ, CD39 приводит к снижению уровня АТФ, который является мощным стимулятором тромбообразования и воспаления. CD73 (­также известный как экто-5'-нуклеотидаза) служит аналогично мембранным гликопротеином, который преобразует АМФ в аденозин [2]. CD73 экспрессируется во многих тканях и плотно распределён в мембранах клеток глио­бластомы [3].

CD39 и CD73 участвуют в контроле высвобождения аденозина — мощного иммуномодулятора. CD39 и CD73 работают вместе, чтобы контролировать уровень аденозина в тканях и органах: CD39 гидролизует АТФ и АДФ до АМФ, а затем CD73 преобразует АМФ в аденозин [2, 4]. Кроме того, эктонуклеотидаза является важным антигеном иммунокомпетентных клеток (CD73-рецептором), регулирующим созревание и активность Т- и В-лимфоцитов, а также их адгезию к эндотелию. В случае гидролиза фосфатидилинозитоловой связи экто-5'-нуклеотидаза отделяется от клетки. При этом в лимфоцитах нарушаются биосинтез предшественников нуклеиновых кислот и процессы созревания [5].

По результатам исследования на мышах с изменённым геном CD73 сделано предположение, что CD73 играет роль в регуляции процессов обучения, формирования памяти и контроля психомоторной координации [6]. Кроме того, есть данные, указывающие на возможность использования активности ферментов CD39 и CD73 в качестве потенциальных маркёров для диагностики шизофрении [7].

Таким образом, регуляция уровня внеклеточных нуклеотидов с использованием эктонуклеотидаз играет важную роль в понимании того, как работает пуринергическая трансмиссия в тканях, а также её возможных целей при нарушениях развития, таких как аутизм [8].

Для исследования аутизма используют модели на животных, среди которых вальпроатная модель аутизма (ВМА) наиболее распространена [9].

ЦЕЛЬ

Целью настоящей работы была оценка активности фермента эктонуклеотидазы в гладкомышечных тканях у 9-месячных крыс с валь-проатной моделью аутизма методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В эксперименте использованы крысы аутбредной линии Wistar в возрасте 9 мес, которые находились в помещении для экспериментальных животных (температура 22–24 °C, относительная влажность воздуха 40–50%) с естественным световым режимом на полнорационной сбалансированной диете (согласно ГОСТ 33215-2014) при соблюдении правил лабораторной практики проведения доклинических исследований в РФ (ГОСТ 3 51000.3-96 и 1000.4-96), а также правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите ­позвоночных ­животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1986).

На проведение экспериментов было получено разрешение локального этического комитета Казанского ГМУ (протокол №2 от 15 февраля 2022).

Для моделирования аутизма самкам крыс на 12–13-й день беременности однократно подкожно в область холки вводили натриевую соль вальпроевой кислоты в дозе 500 мг/кг. Рождённых от таких крыс самцов и самок в возрасте 9 мес использовали для экспериментов. В качестве контроля выступали крысы аналогичных возраста и пола, рождённые от интактных крыс, то есть не подвергавшихся никакому лекарственному воздействию. Вальпроатная модель аутизма была валидирована в лаборатории Казанского ГМУ [10].

Исследование начинали по достижении крысами 270±8 дней. Крыс контрольной (N=8) и опытной (N=10) групп гильотинировали под лёгким эфирным наркозом, выделяли мочевой пузырь, матку, семявыносящие протоки, двенадцатиперстную кишку и готовили образцы ткани (2–4 мг). Из одной ткани каждого животного (N) получали до 4 гладкомышечных образцов (n).

Общую эктонуклеотидазную активность определяли путём инкубирования образцов гладкомышечных тканей крысы с АТФ (субстрат реакции) в течение 10 мин с дальнейшей оценкой содержания субстрата и продуктов реакции (АДФ, АМФ) в инкубате методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Эксперименты проводили при 37±0,5 °С в буфере следующего состава (в мМ): HEPES 10, NaCl 135, KCl 5, CaCl₂ 2, MgCl₂ 2, глюкоза 10 [водородный показатель (рН) 7,4]. В серии контрольных экспериментов использовали буфер с АТФ (300 мкМ) без добавления ткани. Реакцию останавливали добавлением 300 мкл 3% хлорной кислоты.

Инкубационную жидкость центрифугировали, центрифугат замораживали для последующего хроматографического анализа. Анализ выполняли на хроматографе производства Shimadzu (Япония) с использованием силикагелевых колонок Supelco с внутренним диаметром 4,6 мм и длиной 150 мм, а также программы LC Solution. Мобильная фаза состояла из KH₂PO₄ 0,2 М и метанола 3% (рН=6,0), скорость потока 1,5 мл/мин, длина волны 260 нм, объём образца 20 мкл. Полное разделение проходило в течение 5,5 мин.

Определение концентрации АТФ проводили путём сравнения площади под кривой с соответствующей площадью у контрольного ­образца.Активность эктонуклеотидаз выражали количеством АТФ (пмоль), разрушенного в 1 мг ткани за 1 мин.

Математическую и статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программного обеспечения Microsoft Excel и IBM SPSS Statistics 26.0. Сравнение групп осуществляли с использованием непараметрического U-критерия Манна–Уитни. Данные представлены в виде среднего значения ± ошибка среднего (M±m), n — количество использованных мышечных препаратов. Достоверными считали различия при p <0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Активность эктонуклеотидазы в образцах двенадцатиперстной кишки крыс с ВМА 9 мес достоверно не отличались от контроля (p=0,712) (рис. 1).

 

Рис. 1. Активность эктонуклеотидазы двенадцатиперстной кишки крыс с вальпроатной моделью аутизма в возрасте 9 мес. Данные представлены в виде M±m. Контроль (n=12); опыт (n=11); p=0,712

 

В наших предыдущих исследованиях была проведена оценка механической активности кишечника крыс с ВМА 9 мес [11]. Так, карбахолин вызывал сокращения двенадцатиперстной и подвздошной кишки крыс с ВМА 9 мес, при этом не было достоверных различий между контрольной и опытной группами в образцах обеих гладкомышечных тканей. АТФ не оказывал значимого влияния на расслабление двенадцатиперстной и подвздошной кишки 9-месячных крыс с ВМА, так же как и агонист P2Y-рецепторов 2-метилтио-АТФ. Исходя из полученных данных, можно предположить, что у 9-месячных крыс с ВМА пуринергическая трансмиссия в двенадцатиперстной кишке не имеет существенных различий с таковой у контрольных животных.

У крыс с ВМА 9 мес активность эктонуклеотидазы в образцах семявыносящего протока в 3,5 раза ниже, чем в контроле (p=0,040) (рис. 2, А). Ранее мы показали, что у 9-месячных крыс с ВМА сократительная активность семявыносящего протока в ответ на энзиматически стойкий агонист Р2-рецепторов α,β-­метилен-АТФ не отличалась от контроля [11]. Полученные здесь результаты свидетельствуют о неоднозначном влиянии пуринергической системы на сокращение семявыносящего протока крыс с ВМА 9 мес.

 

Рис. 2. Активность эктонуклеотидазы в мочеполовой системе крыс с вальпроатной моделью аутизма в возрасте 9 мес. Данные представлены в виде M±m. А. Семявыносящий проток. Контроль (n=15); опыт (n=10); *p=0,040. Б. Мочевой пузырь. Контроль (n=19); опыт (n=12); p=0,274. В. Матка. Контроль (n=6); опыт (n=19); *p=0,010 по сравнению с контрольной группой

 

У 9-месячных крыс с ВМА в образцах мочевого пузыря активность эктонуклеотидазы, хотя и в среднем ниже, но статистически не отличается от значений активности фермента в образцах ткани контрольных животных (p=0,274) (рис. 2, Б.). В ходе оценки сократительной активности изолированного мочевого пузыря крыс с ВМА 9 мес карбахолин вызывал более значимые, чем в контроле, сокращения мочевого пузыря. Было установлено отсутствие значимых различий в действии α,β-метилен-АТФ на сокращение гладкомышечной ткани крыс опытной и контрольной групп [11]. Мы предполагаем, что пуринергическая передача в тканях мочевого пузыря 9-месячных крыс имеет такое же значение, как и у контрольных животных.

Активность эктонуклеотидазы в образцах матки крыс с ВМА 9 мес достоверно ниже контрольных значений (p=0,010) (рис. 2, В). В ходе фармакологического исследования изолированных гладкомышечных образцов матки крыс с ВМА 9 мес обнаружено, что сокращения, вызванные агонистами Р2-рецепторов α,β-метилен-АТФ и β,γ-метилен-АТФ, были достоверно ниже контрольных значений. Стимуляция электрическим полем вызывала сокращения изолированных образцов матки крыс с ВМА 9 мес, которые статистически не отличались от контроля [12]. Полученные в ходе хроматографического анализа данные дополняют предположение о том, что изменения сократительной активности матки крыс с ВМА 9 мес связаны с нарушениями, которые происходят на постсинаптической мембране.

В проведённых ранее нами исследованиях было показано, что при моделировании аутизма введением вальпроевой кислоты беременным самкам у потомства крыс 3 мес [13] и 9 мес [11, 12] различается механическая активность двенадцатиперстной, подвздошной кишки, мочевого пузыря, семявыносящего протока и матки по сравнению с контрольными животными.

В качестве модели аутизма была выбрана вальпроатная модель, так как она служит наиболее распространённым вариантом моделирования аутизма [14–17]. Вальпроевая кислота в высоких дозах блокирует гистондеацетилазы — ферменты, которые участвуют в деацетилировании гистоновых белков, что влияет на экспрессию генов. В результате (при введении вальпроевой кислоты беременным самкам) у потомства лабораторных животных развивается фетальный вальпроатный синдром, рассматриваемый в качестве модели аутизма [18].

Наше исследование показывает, что у 9-месячных крыс с ВМА разная активность эктонуклеотидазы в гладкомышечных тканях мочеполовой системы и желудочно-кишечного тракта. Мы установили, что у крыс с ВМА активность эктонуклеотидаз достоверно ниже контрольных значений в гладкомышечных тканях семявыносящего протока и матки. В двенадцатиперстной кишке и мочевом пузыре нет достоверной разницы в сравнении с контрольными значениями.

Доказано, что снижение активности эктонуклеотидаз приводит к уменьшению метаболизма АТФ, что, в свою очередь, приводит к увеличению силы и продолжительности действия агониста на рецептор. Увеличение активности фермента снижает влияние АТФ на рецептор [3].

Ранее нами было показано, что агонисты P2-рецепторов не оказывают значимого влияния на механическую активность кишечника, семявыносящего протока и мочевого пузыря крыс с ВМА 9 мес [11], при этом сокращения изолированной матки значительно ниже контрольных значений [12].

Таким образом, исследование активности эктонуклеотидазы подтверждает, что пуринергическая сигнальная система вносит определённый вклад в механическую активность кишечника, мочевого пузыря и семявыносящего протока крыс с вальпроатной моделью аутизма 9 мес. Кроме того, результаты доказывают наше раннее предположение о том, что изменения сократимости матки опосредованы нарушениями на постсинаптическом уровне.

ВЫВОД

У крыс 9 мес с вальпроатной моделью аутизма активность эктонуклеотидаз в гладкомышечных тканях семявыносящего протока и матки достоверно ниже контрольных значений, а в тканях двенадцатиперстной кишки и мочевого пузыря отсутствует достоверная разница в сравнении с контролем.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Участие авторов. Д.В.И. — проведение биохимического исследования, написание статьи; Р.А.Х. — проведение биохимического исследования, подготовка обзора литературы; А.У.З. — редактирование текста, окончательное утверждение статьи.
Источник финансирования. Работа выполнена при поддержке РНФ (проект №22-25-00030).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.
Благодарность. Авторы выражают благодарность Д.О. Никитину и А.В. Никитиной за помощь в моделировании аутизма.

Об авторах

Дарья Викторовна Иванова

Казанский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: ivanovadv96@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0002-0158-5971

асс., каф. фармакологии

Россия, г. Казань, Россия

Ринат Альбертович Хабиров

Казанский (Приволжский) федеральный университет

Email: rinat.habirov.99@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0008-9564-8171

ординатор, каф. внутренних болезней

Россия, г. Казань, Россия

Айрат Усманович Зиганшин

Казанский государственный медицинский университет

Email: ayrat.ziganshin@kazangmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-9087-7927

докт. мед. наук, проф., зав. каф., каф. фармакологии

Россия, г. Казань, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы