To the method of growing anaerobic cultures

Abstract

The method of growing anaerobes has not yet been sufficiently developed. A number of empirical methods have been proposed that give excellent results when growing one or another pathogen; but the use of these methods is often difficult, due to their complexity, and in addition, the factors contributing to growth, when applying a particular method, are not sufficiently understood.

Full Text

Методика выращивания анаэробов еще недостаточно разработана. Предложен ряд эмпирических способов, дающих отличный результат при выращивании того или иного возбудителя; но пользование этими способами часто затруднительно, ввиду их сложности, а кроме того факторы, способствующие росту, при применении той или иной методики, недостаточно выяснены.

Присутствие кислорода в средах является гибельным для анаэробной культуры. Это было доказано еще Пастером в его опытах с v. Butyrique — пропускание воздуха через культуру в течение часа убивало ее. Худяков показал, что разные анаэробы отличаются своей чувствительностью к кислороду. Масляно-кислые бактерии растут при 5—10 мм. давления кислорода, b. tetani 10 — 20 мм. b. chauveoi 40 мм. b. Welchii 200 мм. атмосферного давления и т. д. Присутствие кислорода влияет на окислительно-восстановительный потенциал питательной среды, роль которого, как важного фактора для роста анаэробов, установлена в последнее время. Кислород, являясь сильным окислителем, влияет на редуцирующую способность питательной среды, изменяя ее в сторону снижения. Mc. Leod и Gordonn считают, что токсичным для анаэробов является не кислород, а образующаяся в его присутствии перекись водорода Н₂О₂.

Анаэробы, лишенные каталазы, погибают под действием образующейся перекиси водорода. Эта теория, не получившая общего признания, давая объяснение токсичности кислорода для анаэробов (как источника появления Н₂О₂), ясно показывает необходимость удаления кислорода из сред для роста анаэробов, что лежит в основе методики выращивания анаэробов.

Со времени Тароцци (1905 г.) ряд авторов предлагал способы выращивания анаэробов в жидких средах, ничем не огражденных от атмосферного кислорода, основанные на поглощении кислорода в самой среде или основанные на принципе разрушения образующейся Н₂О₂. Но вопрос о способах выращивания анаэробов связан не только с наличием кислорода в среде — здесь играют роль и другие факторы.

Установлено, что для роста анаэробов нужно сочетание следующих условий: 1) наличие в среде достаточного количества питательных веществ, необходимых для развития бактериальной клетки, 2) удаление кислорода, присутствие которого гибельно отражается на анаэробах (для различных анаэробов чувствительность к кислороду колеблется), 3) в последнее время установлено важное значение окислительно - восстановительного потенциала среды.

Нашей задачей было выяснить, в какой степени применяемые для выращивания анаэробов методы влияют на содержание кислорода в средах и отсюда—на рост микробов. Несомненно, что различные методы создания анаэробиоза отражаются и на других вышеупомянутых факторах, но, чтобы подойти к разрешению всей проблемы анаэробиоза в целом, следует изучить влияние каждого фактора раздельно, и в частности, как меняется при различных методах выращивания такой важный фактор, как присутствие свободного кислорода.

Для определения свободного кислорода в среде мы пользовались способом Хлопина-Винклера ¹).

Среда бралась в объеме 10 куб. см., поэтому естественно, что точность результатов по сравнению с обычными исследованиями кислорода по Винклеру, где жидкость берется в объеме 150—300 куб. см., ниже. Кроме того, способ Винклера предназначен для определения кислорода в питьевых водах, а не в питательных средах, что также необходимо иметь ввиду при оценке результатов. Тем не менее, на сравнительной оценке полученных данных это не сильно отразилось, и установленные закономерности восстанавливающей способности питательной среды надо считать правильными.

Каждое исследование производилось в трех пробирках, результаты исследования, как правило, незначительно колебались в пределах 10—20%. Среднее из трех данных бралось в качестве итога опыта.

Таким образом были проведены следующие способы создания анаэробиоза: выяснялось влияние различных адсорбентов, влияние заливки различными маслами и, наконец, влияние некоторых восстановителей на содержание кислорода в среде.

При испытании адсорбентов, пробирки с 10 куб. см. физиологического раствора и помещенными туда кусочками адсорбентов прогревались в водяной бане при 100° 15 минут, заливались слоем вазелинового масла высотой в 2 куб. см. и выдерживались в термостате 24—48—72 часа; по истечении каждого срока устанавливалось наличие кислорода по методу Винклера.

Эти опыты показали, что из примененных адсорбентов лучшими являются печень и древесный уголь в порошке. Большая часть адсорбентов, при длительном выдерживании пробирок в термостате, связывает свободный кислород и таким образом уменьшает содержание его в среде.

Подобным же образом определялось влияние на содержание кислорода заливки различными маслами, с той лишь разницей, что в пробирки с физ. раствором не добавлялись адсорбенты.

Есть основание думать, что эти „хранители“ анаэробиоза не только механически задерживают проникновение кислорода в среду, но и поглощают его, окисляясь соприкасающимся с ними воздухом. Эта способность окисления, как известно, наиболее резко выражена у льняного масла, следствием чего является €го преимущество перед другими маслами, в особенности минеральными.

По сравнению с другими маслами растительного и животного происхождения льняное масло значительно богаче содержанием жирных кислот, высокой степени непредельности, в особенности линоленовой, и поэтому оно характеризуется и наиболее высоким иодным числом (192). Отсюда у льняного масла способность поглощать кислород в присутствии воздуха выражена чрезвычайно резко.

Обычно применяемое в анаэробной практике вазелиновое масло предохраняет среду от доступа кислорода значительно хуже, чем вазелин. Повидимому, проникновение в среду свободного кислорода совершается здесь значительно легче. Эти данные подтверждают исследования Runeber’a и Hаll относительно непригодности минеральных масел, в качестве „хранителей“ анаэробиоза.

Обыкновенно с проверкой упомянутых способов создания анаэробиоза было испытано влияние на содержание кислорода в физрастворе и бульона восстановителя — гидросульфита натрия и фильтрата b. mesentericus, которому также некоторые авторы приписывают восстанавливающие свойства.

С этой целью к 10 куб. см. физ. раствора и такому же количеству бульона прибавлялась 1 капля гидросульфита различной концентрации, пробирки заливались вазелином и помещались в термостат на 24—48—72 часа, после чего вышеупомянутой методикой определялось содержание кислорода.

Таблица 3 показывает, что крепкий раствор гидросульфита натрия, добавленный к питательной среде в минимальном количестве, является отличным восстановителем, освобождая питательную среду полностью от присутствия кислорода.

Наличие же кислорода в бульоне при добавлении 1°/о гидросульфита показывает, что одной капли такого раствора недостаточно для удаления кислорода, находящегося в питат. среде в связанном состоянии; для его удаления требуется большее количество восстановителя.

Аналогичный опыт был поставлен и с фильтратом b. mesentericus, с той лишь разницей, что к физ. раствору и бульону были добавлены несколько большие количества, а именно 0,25—0,5—1,0 кб. см.

Восстанавливающая способность фильтрата b. mesentericus слаба, в смеси с бульоном она дает лучший эффект, чем с физ. раствором. Для освобождения питательной среды от кислорода, а следовательно для создания лучших условий анаэробиоза, необходимо добавление больших количеств фильтрата. Это в свою очередь может оказаться тормозом в развитии анаэробной культуры, несмотря на отсутствие в питат. среде кислорода ввиду того, что фильтрат содержит в себе продукты обмена, могущие гибельно влиять на размножение бактериальной клетки. В этом мы и убедились при дальнейших опытах, которые были направлены к выяснении роли адсорбирующих веществ и способов заливки в процессе выращивания анаэробной культуры.

Для проверки данных, полученных по способу Винклера, мы посеяли культуры облигатных анаэробов b. tetani и b. botulinus в одинаковое по объему количество обычного сл. щел. бульона с добавлением к нему восстановителей и различных адсорбирующих веществ, преграждая доступ кислороду растительными и минеральными маслами. В качестве контроля одну пробирку оставляли незалитой.

Посевы в пробирках с гидросульфитом натрия и фильтратом b. mesentericus заливались только вазелином.

Выводы. 1) В присутствии одной капли 10% гидросульфита натрия получается хороший рост анаэробов даже без преграждения доступа кислорода.

2) Льняное масло является лучшим „хранителем“ анаэробиоза.

¹) Xлопин. Методы санитарных исследований.