To the method of growing anaerobic cultures

Cover Page


Cite item

Abstract

The method of growing anaerobes has not yet been sufficiently developed. A number of empirical methods have been proposed that give excellent results when growing one or another pathogen; but the use of these methods is often difficult, due to their complexity, and in addition, the factors contributing to growth, when applying a particular method, are not sufficiently understood.

Full Text

Методика выращивания анаэробов еще недостаточно разработана. Предложен ряд эмпирических способов, дающих отличный результат при выращивании того или иного возбудителя; но пользование этими способами часто затруднительно, ввиду их сложности, а кроме того факторы, способствующие росту, при применении той или иной методики, недостаточно выяснены.

Присутствие кислорода в средах является гибельным для анаэробной культуры. Это было доказано еще Пастером в его опытах с v. Butyrique — пропускание воздуха через культуру в течение часа убивало ее. Худяков показал, что разные анаэробы отличаются своей чувствительностью к кислороду. Масляно-кислые бактерии растут при 5—10 мм. давления кислорода, b. tetani 10 — 20 мм. b. chauveoi 40 мм. b. Welchii 200 мм. атмосферного давления и т. д. Присутствие кислорода влияет на окислительно-восстановительный потенциал питательной среды, роль которого, как важного фактора для роста анаэробов, установлена в последнее время. Кислород, являясь сильным окислителем, влияет на редуцирующую способность питательной среды, изменяя ее в сторону снижения. Mc. Leod и Gordonn считают, что токсичным для анаэробов является не кислород, а образующаяся в его присутствии перекись водорода Н2О2.

Анаэробы, лишенные каталазы, погибают под действием образующейся перекиси водорода. Эта теория, не получившая общего признания, давая объяснение токсичности кислорода для анаэробов (как источника появления Н2О2), ясно показывает необходимость удаления кислорода из сред для роста анаэробов, что лежит в основе методики выращивания анаэробов.

Со времени Тароцци (1905 г.) ряд авторов предлагал способы выращивания анаэробов в жидких средах, ничем не огражденных от атмосферного кислорода, основанные на поглощении кислорода в самой среде или основанные на принципе разрушения образующейся Н2О2. Но вопрос о способах выращивания анаэробов связан не только с наличием кислорода в среде — здесь играют роль и другие факторы.

Установлено, что для роста анаэробов нужно сочетание следующих условий: 1) наличие в среде достаточного количества питательных веществ, необходимых для развития бактериальной клетки, 2) удаление кислорода, присутствие которого гибельно отражается на анаэробах (для различных анаэробов чувствительность к кислороду колеблется), 3) в последнее время установлено важное значение окислительно - восстановительного потенциала среды.

Нашей задачей было выяснить, в какой степени применяемые для выращивания анаэробов методы влияют на содержание кислорода в средах и отсюда—на рост микробов. Несомненно, что различные методы создания анаэробиоза отражаются и на других вышеупомянутых факторах, но, чтобы подойти к разрешению всей проблемы анаэробиоза в целом, следует изучить влияние каждого фактора раздельно, и в частности, как меняется при различных методах выращивания такой важный фактор, как присутствие свободного кислорода.

Для определения свободного кислорода в среде мы пользовались способом Хлопина-Винклера 1).

Среда бралась в объеме 10 куб. см., поэтому естественно, что точность результатов по сравнению с обычными исследованиями кислорода по Винклеру, где жидкость берется в объеме 150—300 куб. см., ниже. Кроме того, способ Винклера предназначен для определения кислорода в питьевых водах, а не в питательных средах, что также необходимо иметь ввиду при оценке результатов. Тем не менее, на сравнительной оценке полученных данных это не сильно отразилось, и установленные закономерности восстанавливающей способности питательной среды надо считать правильными.

Каждое исследование производилось в трех пробирках, результаты исследования, как правило, незначительно колебались в пределах 10—20%. Среднее из трех данных бралось в качестве итога опыта.

Таким образом были проведены следующие способы создания анаэробиоза: выяснялось влияние различных адсорбентов, влияние заливки различными маслами и, наконец, влияние некоторых восстановителей на содержание кислорода в среде.

При испытании адсорбентов, пробирки с 10 куб. см. физиологического раствора и помещенными туда кусочками адсорбентов прогревались в водяной бане при 100° 15 минут, заливались слоем вазелинового масла высотой в 2 куб. см. и выдерживались в термостате 24—48—72 часа; по истечении каждого срока устанавливалось наличие кислорода по методу Винклера.

Эти опыты показали, что из примененных адсорбентов лучшими являются печень и древесный уголь в порошке. Большая часть адсорбентов, при длительном выдерживании пробирок в термостате, связывает свободный кислород и таким образом уменьшает содержание его в среде.

Подобным же образом определялось влияние на содержание кислорода заливки различными маслами, с той лишь разницей, что в пробирки с физ. раствором не добавлялись адсорбенты.

Есть основание думать, что эти „хранители“ анаэробиоза не только механически задерживают проникновение кислорода в среду, но и поглощают его, окисляясь соприкасающимся с ними воздухом. Эта способность окисления, как известно, наиболее резко выражена у льняного масла, следствием чего является €го преимущество перед другими маслами, в особенности минеральными.

По сравнению с другими маслами растительного и животного происхождения льняное масло значительно богаче содержанием жирных кислот, высокой степени непредельности, в особенности линоленовой, и поэтому оно характеризуется и наиболее высоким иодным числом (192). Отсюда у льняного масла способность поглощать кислород в присутствии воздуха выражена чрезвычайно резко.

Обычно применяемое в анаэробной практике вазелиновое масло предохраняет среду от доступа кислорода значительно хуже, чем вазелин. Повидимому, проникновение в среду свободного кислорода совершается здесь значительно легче. Эти данные подтверждают исследования Runeber’a и Hаll относительно непригодности минеральных масел, в качестве „хранителей“ анаэробиоза.

Обыкновенно с проверкой упомянутых способов создания анаэробиоза было испытано влияние на содержание кислорода в физрастворе и бульона восстановителя — гидросульфита натрия и фильтрата b. mesentericus, которому также некоторые авторы приписывают восстанавливающие свойства.

С этой целью к 10 куб. см. физ. раствора и такому же количеству бульона прибавлялась 1 капля гидросульфита различной концентрации, пробирки заливались вазелином и помещались в термостат на 24—48—72 часа, после чего вышеупомянутой методикой определялось содержание кислорода.

Таблица 3 показывает, что крепкий раствор гидросульфита натрия, добавленный к питательной среде в минимальном количестве, является отличным восстановителем, освобождая питательную среду полностью от присутствия кислорода.

Наличие же кислорода в бульоне при добавлении 1°/о гидросульфита показывает, что одной капли такого раствора недостаточно для удаления кислорода, находящегося в питат. среде в связанном состоянии; для его удаления требуется большее количество восстановителя.

Аналогичный опыт был поставлен и с фильтратом b. mesentericus, с той лишь разницей, что к физ. раствору и бульону были добавлены несколько большие количества, а именно 0,25—0,5—1,0 кб. см.

Восстанавливающая способность фильтрата b. mesentericus слаба, в смеси с бульоном она дает лучший эффект, чем с физ. раствором. Для освобождения питательной среды от кислорода, а следовательно для создания лучших условий анаэробиоза, необходимо добавление больших количеств фильтрата. Это в свою очередь может оказаться тормозом в развитии анаэробной культуры, несмотря на отсутствие в питат. среде кислорода ввиду того, что фильтрат содержит в себе продукты обмена, могущие гибельно влиять на размножение бактериальной клетки. В этом мы и убедились при дальнейших опытах, которые были направлены к выяснении роли адсорбирующих веществ и способов заливки в процессе выращивания анаэробной культуры.

Для проверки данных, полученных по способу Винклера, мы посеяли культуры облигатных анаэробов b. tetani и b. botulinus в одинаковое по объему количество обычного сл. щел. бульона с добавлением к нему восстановителей и различных адсорбирующих веществ, преграждая доступ кислороду растительными и минеральными маслами. В качестве контроля одну пробирку оставляли незалитой.

Посевы в пробирках с гидросульфитом натрия и фильтратом b. mesentericus заливались только вазелином.

Выводы. 1) В присутствии одной капли 10% гидросульфита натрия получается хороший рост анаэробов даже без преграждения доступа кислорода.

2) Льняное масло является лучшим „хранителем“ анаэробиоза.

1) Xлопин. Методы санитарных исследований.

×

About the authors

A. I. Panina

Military Medical Academy

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

References


© 2020 Panina A.I.

Creative Commons License

This work is licensed
under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.





This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies