Analysis of BRCA1 and BRCA2 genes mutations in breast cancer patients in an experiment

Full Text

Актуальность. Рак молочной железы (РМЖ) занимает лидирующее место в структуре злокачественных новообразований у женщин Российской Федерации в целом [1]. РМЖ — гетерогенное заболевание, в мире ежегодно регистрируют приблизительно 1 млн новых случаев заболевания [2]. РМЖ представляет с собой злокачественную опухоль железистой ткани молочной железы. Основными причинами развития заболевания считают нарушение генетического и гормонального контроля над ростом клеток в молочной железе, что ведёт к активной пролиферации и разрастанию ткани [3].

По статистике здравоохранения России, у женщин с диагнозом злокачественного новообразования, установленным впервые в жизни, всего зарегистрировано в 2017 г. — 335 275 случаев, в 2018 г. — 338 760 случаев [4]; на 100 тыс. человек в 2017 г. — 425,7, в 2018 г. — 430,3 случая. Выявлено пациенток с диагнозом РМЖ, установленным впервые в жизни, в 2017 г. — 70,6 тыс., в 2018 г. — 70,7 тыс. человек [5]. В 2019 г. все эти показатели увеличились на 1,5%. Возможно, это обусловлено экологическими и экономическими причинами, старением населения и более эффективными методами ранней диагностики.

Проблема онкологических заболеваний стала мировой, и в последние годы большое внимание уделяют диагностике РМЖ с целью выявления генетических маркёров-модификаторов риска развития РМЖ у носителей мутации BRCA1 и BRCA2.

На сегодняшний день клонирован и картирован ряд генов, вовлечённых в канцерогенез при РМЖ, выполняющих функцию генов-супрессоров [6]. В настоящее время известно более 12 тыс. вариаций, и около 5 тыс. из них считают мутациями, ассоциированными с развитием РМЖ. Однако именно для генов BRCA1 и BRCA2 рассчитывают общую пенетрантность для всех мутаций, которые нарушают их функции, и риск развития заболевания может существовать в течение жизни.

Исследование для выявления мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 помогает определить предрасположенность к наследственным формам РМЖ [7]. Патогенетический механизм развития заболевания опосредован нарушением в данных генах репарации дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) различной степени пенетрантности. Большинство клинических случаев наследственного РМЖ ассоциировано с мутациями именно в этих генах, которые обеспечивают также защиту организма от трансформированных клеток, провоцирующих появление опухолевых новообразований [8]. В неповреждённом состоянии оба гена (BRCA1 и BRCA2) являются классическими опухолевыми супрессорами, и кодируемые ими белки играют ведущую роль в репарации разрывов двухцепочечных ДНК путём гомологичной рекомбинации [9]. Потеря функциональной активности вследствие врождённых или приобретённых мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 приводит к нарушению регуляции клеточного цикла, процессов дифференцировки и апоптоза, а также к нарастанию хромосомной нестабильности, приводящей к повышению риска развития РМЖ, рака предстательной железы, эндометрия, яичников, меланомы, а также рака грудных желёз у мужчин [10, 11].

Цель. Оценка наличия мутаций на основании анализа распространённости полиморфизмов в генах ВRCA1 и ВRCA2 у пациенток с РМЖ.

Материал и методы исследования. В исследовании использовали венозную кровь 137 больных РМЖ в возрасте от 25 до 80 лет, поступивших на лечение в Республиканский клинический онкологический диспансер г. Уфы с января по декабрь 2017 г., а также 105 здоровых доноров.

После ретракции сгустка пробы центрифугировали при 3000 об./мин течение 10 мин, затем сыворотку отбирали в микрокюветы и использовали для исследования. У всех обследуемых кровь была получена с их информационного согласия. Исследования были одобрены этическим комитетом Республиканского клинического онкологического диспансера Министерства Здравоохранения Республики Башкортостан.

Молекулярно-генетический анализ (целевые фрагменты геномной ДНК) проводили методом аллель-специфической полимеразной цепной реакции в реальном времени. Для изучения спектра мутаций и поиска значимости маркёров генетического анализа были выбраны четыре мутации гена ВRCA1 и одна мутация гена ВRCA2. В качестве материала для анализа использовали ДНК, выделенную из цельной крови, забор которой осуществляли в специальные вакуумные пробирки Green Vac-Tube (Корея) с антикоагулянтом ЭДТА-К2 объёмом 5 мл. Исследование проводили с использованием наборов реагентов для выявления мутации в генах ВRСА 1 и ВRCA2 методом полимеразной цепной реакции (БиоЛинк, Россия) на анализаторе Rotor-Gene Q (Qiagen GmbH, Германия).

Результаты. Для исследований выбраны мутации 185delAG, 4153delA, 5382insC и T300G в гене BRCA1, а также мутации 6174delT в гене BRCA2, часто встречающиеся в России.

В гене BRCA1, локализованном на хромосоме 17q21.31, исследовали четыре мутации [11]:
– 185delAG, происходящая за счёт отсутствия двух нуклеотидов аденозинмонофосфата (АМФ) и гуанозинмонофосфата в позиции 185 последовательности ДНК гена;
– 4153delA, происходящая за счёт потери АМФ в позиции 4153 последовательности ДНК гена;
– 5382insC, происходящая за счёт инсерции цитидинмонофосфата в позиции 5382 последовательности ДНК;
– мутация T300G — за счёт замены тимина на гуанин в позиции 300 последовательности гена, в результате которой в белке BRCA1 аминокислота цистеин меняется на глицин, что приводит к нарушению функций белка [12].

В гене BRCA2, локализованном на хромосоме 13q13.1, исследовали мутацию 6174delT, происходящую за счёт делеции тимидинмонофосфата в позиции 6174 [12].

Определяемые мутации в генах BRCA1 и BRCA2, ассоциированных с РМЖ, представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Исследуемые мутации в генах BRCA1 и BRCA2

Наименование исследования	Мутация	Генотип
BRCA1 (ген, ассоциированный с раком молочной железы 1)	185delAG	Ins/Ins
	4153delA	Ins/Ins
	5382insC	Del/Del
	T300G	T/T
BRCA2 (ген, ассоциированный с раком молочной железы 2)	6174delT	Ins/Ins

 

Частота и спектр выявленных мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 у больных РМЖ в сравнении со здоровыми донорами представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Частота мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 в эксперименте

Ген	Мутация	Здоровые доноры (n=115)	Пациенты с раком молочной железы (n=137)
BRCA1	185delAG	Не обнаружена	Не обнаружена
	4153delA	Не обнаружена	Обнаружена у 1 (0,73%) больной
	5382insC	Не обнаружена	Обнаружена у 18 (13,14%) больных
	T300G	Не обнаружена	Обнаружена у 1 (0,73%) больной
BRCA2	6174delT	Не обнаружена	Не обнаружена

 

Суммарная частота мутаций в генах BRCA1 и ВRCA2 составила 14,59% общего числа обследованных больных. Наиболее часто встречающаяся мутация — 5382insC в гене BRCA1, её частота составила 13,13% общего числа обследованных больных и 90% общего числа положительных результатов. Частота мутаций 4153delA и T300G составила по 0,73% общего числа обследованных больных (рис. 1).

 

Рис. 1. Распределение мутаций в генах BRCA1 и BRCA2

 

Из рис. 1 видно, что большинство мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 у больных РМЖ, ­находящихся на лечении в Республиканском клиническом онкологическом диспансере Министерства здравоохранения Республики Башкортостан, приходится в гене BRCA1 на экзон 20 — 5382insC.

Обсуждение. Белковый продукт гена BRCA1 ингибирует транскрипцию гена рецептора эстрогенов, сдерживая избыточную пролиферацию клеток молочной железы. Первое место по мутации в генах приходится на ген BRCA1 (экзон 20 — 5382insC), где мутация гена заключается в добавлении одного нуклеотида — цитозина в позиции 5382 последовательности ДНК гена. На втором месте стоит мутация в гене BRCA1 (экзон 11P — 4153delA), которая заключается в утрате одного нуклеотида — аденина в позиции 4153 последовательности ДНК, а также 300 Т >G (экзон 3 — Cys61Gly), где мутация заключается в замене тимина на гуанин в позиции 300 последовательности. В гене BRCA1 (экзон 2 — 185delAG) мутация, заключающаяся в отсутствии двух нуклеотидов (аденина и гуанина) в позиции 185 последовательности ДНК, у пациенток с РМЖ не обнаружена.

Мутация в гене BRCA2 (6174delT) заключается в потере одного нуклеотида — тимина в позиции 6174 последовательности ДНК, которая участвует в репарации ДНК, регуляции клеточного цикла и поддержании генетической стабильности. У пациенток с РМЖ, поступивших на лечение в Республиканский клинический онкологический диспансер г. Уфы, эта мутация не обнаружена. Однако проблема остаётся не до конца изученной и представляет большой интерес для проведения исследования с точки зрения генетики.

Выводы

1. В исследовании образцы ДНК 137 пациенток с диагнозом «рак молочной железы» были тестированы на наличие 5 мутаций в генах BRCA1 и BRCA2. Из общего числа больных 20 человек оказались носителями мутации.

2. Суммарная частота мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 у больных раком молочной железы, имеющих указания на наследственный характер заболевания, составляет 14,59% общего числа обследованных больных с диагнозом «рак молочной железы». Доля наиболее часто встречающейся мутации 5382insC в гене BRCA1 составила 13,13%. Частота мутаций 4153delA и T300G в гене BRCA1 составила по 0,73% общего числа обследованных больных.

3. По данным исследований мутации BRCA2-6174delT и BRCA1-185delAG, ни одна из 137 пациенток с раком молочной железы не была её носителем.

4. Локусы мутаций, обнаруженные у больных раком молочной железы, свидетельствуют о целесообразности включения анализа на наличие мутаций 5382insC, 4153delA и T300G в гене BRCA1 в скрининговые программы по определению риска рака молочной железы и в дальнейшем могут способствовать целенаправленному поиску этих мутаций у родственников.

 

Участие авторов. Л.М.С. и Л.М.Х. проводили исследования; Э.Н.К. отвечала за сбор и анализ результатов; Ш.Н.Г. — руководитель работы.

Источник финансирования. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта по представленной статье.

About the authors

L M Saрtarova

Bashkir State Medical University

Author for correspondence.
Email: SaptarovaLiliana@yandex.ru
SPIN-code: 2316-4075
Russian Federation, Ufa, Russia

E N Cogina

Bashkir State Medical University

Email: SaptarovaLiliana@yandex.ru
SPIN-code: 2437-2131
Russian Federation, Ufa, Russia

L M Khasanshina

Republican Clinical Dispensary of Oncology

Email: SaptarovaLiliana@yandex.ru
Russian Federation, Ufa, Russia

Sh N Galimov

Bashkir State Medical University

Email: SaptarovaLiliana@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5871-5151
SPIN-code: 6096-1910
Scopus Author ID: 6602936166
ResearcherId: B-9455-2017
Russian Federation, Ufa, Russia

References

Supplementary files