Analysis of BRCA1 and BRCA2 genes mutations in breast cancer patients in an experiment

Cover Page

Abstract


Aim. To assess the presence of mutations based on the analysis of the prevalence of polymorphisms in the BRCA1 and BRCA2 genes in patients admitted to the Republican clinical Oncology dispensary of the Ministry of Health of the Republic of Bashkortostan with breast cancer.

Methods. 137 patients with breast cancer aged 25 to 80 years underwent molecular genetic testing to detect BRCA1 and BRCA2 mutations by using allele-specific real-time polymerase chain reaction. Venous blood from 105 healthy donors was used as a control group.

Results. The study of genetic modifiers of cancer risk for BRCA1 and BRCA2 mutation carriers revealed mutations in the genes BRCA1 185delAG, 4153delA, 5382insC, T300G and BRCA2-6174 del T, which help identify genetic susceptibility to breast cancer (NSCLC). The most common form of genetic variation in patients with breast cancer was 5382insC mutation in BRCA1 gene, which was 14.59% of the total number of examined patients and 90% of the total number of positive results. BRCA1 and BRCA2 genes mutations lead to producing truncated protein, which cannot properly perform its functions and ensure DNA cell stability.

Conclusion. Considering high breast cancer risk in BRCA1 and BRCA2 genes mutations carriers, our results show the advisability of including screening for 5382insC, 4153delA and T300G mutations in the BRCA1 gene to the screening programs for determining the risk of breast cancer.


Full Text

Актуальность. Рак молочной железы (РМЖ) занимает лидирующее место в структуре злокачественных новообразований у женщин Российской Федерации в целом [1]. РМЖ — гетерогенное заболевание, в мире ежегодно регистрируют приблизительно 1 млн новых случаев заболевания [2]. РМЖ представляет с собой злокачественную опухоль железистой ткани молочной железы. Основными причинами развития заболевания считают нарушение генетического и гормонального контроля над ростом клеток в молочной железе, что ведёт к активной пролиферации и разрастанию ткани [3].

По статистике здравоохранения России, у женщин с диагнозом злокачественного новообразования, установленным впервые в жизни, всего зарегистрировано в 2017 г. — 335 275 случаев, в 2018 г. — 338 760 случаев [4]; на 100 тыс. человек в 2017 г. — 425,7, в 2018 г. — 430,3 случая. Выявлено пациенток с диагнозом РМЖ, установленным впервые в жизни, в 2017 г. — 70,6 тыс., в 2018 г. — 70,7 тыс. человек [5]. В 2019 г. все эти показатели увеличились на 1,5%. Возможно, это обусловлено экологическими и экономическими причинами, старением населения и более эффективными методами ранней диагностики.

Проблема онкологических заболеваний стала мировой, и в последние годы большое внимание уделяют диагностике РМЖ с целью выявления генетических маркёров-модификаторов риска развития РМЖ у носителей мутации BRCA1 и BRCA2.

На сегодняшний день клонирован и картирован ряд генов, вовлечённых в канцерогенез при РМЖ, выполняющих функцию генов-супрессоров [6]. В настоящее время известно более 12 тыс. вариаций, и около 5 тыс. из них считают мутациями, ассоциированными с развитием РМЖ. Однако именно для генов BRCA1 и BRCA2 рассчитывают общую пенетрантность для всех мутаций, которые нарушают их функции, и риск развития заболевания может существовать в течение жизни.

Исследование для выявления мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 помогает определить предрасположенность к наследственным формам РМЖ [7]. Патогенетический механизм развития заболевания опосредован нарушением в данных генах репарации дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) различной степени пенетрантности. Большинство клинических случаев наследственного РМЖ ассоциировано с мутациями именно в этих генах, которые обеспечивают также защиту организма от трансформированных клеток, провоцирующих появление опухолевых новообразований [8]. В неповреждённом состоянии оба гена (BRCA1 и BRCA2) являются классическими опухолевыми супрессорами, и кодируемые ими белки играют ведущую роль в репарации разрывов двухцепочечных ДНК путём гомологичной рекомбинации [9]. Потеря функциональной активности вследствие врождённых или приобретённых мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 приводит к нарушению регуляции клеточного цикла, процессов дифференцировки и апоптоза, а также к нарастанию хромосомной нестабильности, приводящей к повышению риска развития РМЖ, рака предстательной железы, эндометрия, яичников, меланомы, а также рака грудных желёз у мужчин [10, 11].

Цель. Оценка наличия мутаций на основании анализа распространённости полиморфизмов в генах ВRCA1 и ВRCA2 у пациенток с РМЖ.

Материал и методы исследования. В исследовании использовали венозную кровь 137 больных РМЖ в возрасте от 25 до 80 лет, поступивших на лечение в Республиканский клинический онкологический диспансер г. Уфы с января по декабрь 2017 г., а также 105 здоровых доноров.

После ретракции сгустка пробы центрифугировали при 3000 об./мин течение 10 мин, затем сыворотку отбирали в микрокюветы и использовали для исследования. У всех обследуемых кровь была получена с их информационного согласия. Исследования были одобрены этическим комитетом Республиканского клинического онкологического диспансера Министерства Здравоохранения Республики Башкортостан.

Молекулярно-генетический анализ (целевые фрагменты геномной ДНК) проводили методом аллель-специфической полимеразной цепной реакции в реальном времени. Для изучения спектра мутаций и поиска значимости маркёров генетического анализа были выбраны четыре мутации гена ВRCA1 и одна мутация гена ВRCA2. В качестве материала для анализа использовали ДНК, выделенную из цельной крови, забор которой осуществляли в специальные вакуумные пробирки Green Vac-Tube (Корея) с антикоагулянтом ЭДТА-К2 объёмом 5 мл. Исследование проводили с использованием наборов реагентов для выявления мутации в генах ВRСА 1 и ВRCA2 методом полимеразной цепной реакции (БиоЛинк, Россия) на анализаторе Rotor-Gene Q (Qiagen GmbH, Германия).

Результаты. Для исследований выбраны мутации 185delAG, 4153delA, 5382insC и T300G в гене BRCA1, а также мутации 6174delT в гене BRCA2, часто встречающиеся в России.

В гене BRCA1, локализованном на хромосоме 17q21.31, исследовали четыре мутации [11]:
– 185delAG, происходящая за счёт отсутствия двух нуклеотидов аденозинмонофосфата (АМФ) и гуанозинмонофосфата в позиции 185 последовательности ДНК гена;
– 4153delA, происходящая за счёт потери АМФ в позиции 4153 последовательности ДНК гена;
– 5382insC, происходящая за счёт инсерции цитидинмонофосфата в позиции 5382 последовательности ДНК;
– мутация T300G — за счёт замены тимина на гуанин в позиции 300 последовательности гена, в результате которой в белке BRCA1 аминокислота цистеин меняется на глицин, что приводит к нарушению функций белка [12].

В гене BRCA2, локализованном на хромосоме 13q13.1, исследовали мутацию 6174delT, происходящую за счёт делеции тимидинмонофосфата в позиции 6174 [12].

Определяемые мутации в генах BRCA1 и BRCA2, ассоциированных с РМЖ, представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Исследуемые мутации в генах BRCA1 и BRCA2

Наименование исследования

Мутация

Генотип

BRCA1 (ген, ассоциированный с раком молочной железы 1)

185delAG

Ins/Ins

4153delA

Ins/Ins

5382insC

Del/Del

T300G

T/T

BRCA2 (ген, ассоциированный с раком молочной железы 2)

6174delT

Ins/Ins

 

Частота и спектр выявленных мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 у больных РМЖ в сравнении со здоровыми донорами представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Частота мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 в эксперименте

Ген

Мутация

Здоровые доноры (n=115)

Пациенты с раком молочной железы (n=137)

BRCA1

185delAG

Не обнаружена

Не обнаружена

4153delA

Не обнаружена

Обнаружена у 1 (0,73%) больной

5382insC

Не обнаружена

Обнаружена у 18 (13,14%) больных

T300G

Не обнаружена

Обнаружена у 1 (0,73%) больной

BRCA2

6174delT

Не обнаружена

Не обнаружена

 

Суммарная частота мутаций в генах BRCA1 и ВRCA2 составила 14,59% общего числа обследованных больных. Наиболее часто встречающаяся мутация — 5382insC в гене BRCA1, её частота составила 13,13% общего числа обследованных больных и 90% общего числа положительных результатов. Частота мутаций 4153delA и T300G составила по 0,73% общего числа обследованных больных (рис. 1).

 

Рис. 1. Распределение мутаций в генах BRCA1 и BRCA2

 

Из рис. 1 видно, что большинство мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 у больных РМЖ, ­находящихся на лечении в Республиканском клиническом онкологическом диспансере Министерства здравоохранения Республики Башкортостан, приходится в гене BRCA1 на экзон 20 — 5382insC.

Обсуждение. Белковый продукт гена BRCA1 ингибирует транскрипцию гена рецептора эстрогенов, сдерживая избыточную пролиферацию клеток молочной железы. Первое место по мутации в генах приходится на ген BRCA1 (экзон 20 — 5382insC), где мутация гена заключается в добавлении одного нуклеотида — цитозина в позиции 5382 последовательности ДНК гена. На втором месте стоит мутация в гене BRCA1 (экзон 11P — 4153delA), которая заключается в утрате одного нуклеотида — аденина в позиции 4153 последовательности ДНК, а также 300 Т >G (экзон 3 — Cys61Gly), где мутация заключается в замене тимина на гуанин в позиции 300 последовательности. В гене BRCA1 (экзон 2 — 185delAG) мутация, заключающаяся в отсутствии двух нуклеотидов (аденина и гуанина) в позиции 185 последовательности ДНК, у пациенток с РМЖ не обнаружена.

Мутация в гене BRCA2 (6174delT) заключается в потере одного нуклеотида — тимина в позиции 6174 последовательности ДНК, которая участвует в репарации ДНК, регуляции клеточного цикла и поддержании генетической стабильности. У пациенток с РМЖ, поступивших на лечение в Республиканский клинический онкологический диспансер г. Уфы, эта мутация не обнаружена. Однако проблема остаётся не до конца изученной и представляет большой интерес для проведения исследования с точки зрения генетики.

Выводы

1. В исследовании образцы ДНК 137 пациенток с диагнозом «рак молочной железы» были тестированы на наличие 5 мутаций в генах BRCA1 и BRCA2. Из общего числа больных 20 человек оказались носителями мутации.

2. Суммарная частота мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 у больных раком молочной железы, имеющих указания на наследственный характер заболевания, составляет 14,59% общего числа обследованных больных с диагнозом «рак молочной железы». Доля наиболее часто встречающейся мутации 5382insC в гене BRCA1 составила 13,13%. Частота мутаций 4153delA и T300G в гене BRCA1 составила по 0,73% общего числа обследованных больных.

3. По данным исследований мутации BRCA2-6174delT и BRCA1-185delAG, ни одна из 137 пациенток с раком молочной железы не была её носителем.

4. Локусы мутаций, обнаруженные у больных раком молочной железы, свидетельствуют о целесообразности включения анализа на наличие мутаций 5382insC, 4153delA и T300G в гене BRCA1 в скрининговые программы по определению риска рака молочной железы и в дальнейшем могут способствовать целенаправленному поиску этих мутаций у родственников.

 

Участие авторов. Л.М.С. и Л.М.Х. проводили исследования; Э.Н.К. отвечала за сбор и анализ результатов; Ш.Н.Г. — руководитель работы.

Источник финансирования. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта по представленной статье.

About the authors

L M Saрtarova

Bashkir State Medical University

Author for correspondence.
Email: SaptarovaLiliana@yandex.ru
SPIN-code: 2316-4075

Russian Federation, Ufa, Russia

E N Cogina

Bashkir State Medical University

Email: SaptarovaLiliana@yandex.ru
SPIN-code: 2437-2131

Russian Federation, Ufa, Russia

L M Khasanshina

Republican Clinical Dispensary of Oncology

Email: SaptarovaLiliana@yandex.ru

Russian Federation, Ufa, Russia

Sh N Galimov

Bashkir State Medical University

Email: SaptarovaLiliana@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5871-5151
SPIN-code: 6096-1910
Scopus Author ID: 6602936166
ResearcherId: B-9455-2017

Russian Federation, Ufa, Russia

References

  1. Ahmad A. Pathways to breast cancer recurrence. ISRN Oncol. 2013; 2013: 1–16. DOI: 10.4236/ jct.2017.83025 847.
  2. Vodolazhskiy D.I., Kutilin D.S., Mogushkova K.A., Kit O.I. Transcriptional profile of cancer-testicular antigens in patients with breast cancer. Medical Immunology (Russia). 2018; 20 (3): 383–390. (In Russ.) doi: 10.15789/­1563-0625-2018-3-383-390.
  3. Lazerov A.F., Zadontseva N.S., Gofman A.A. Hereditary breast cancer. Rossiyskiy onkologicheskiy zhurnal. 2014; 19 (2): 40–46. (In Russ.)
  4. Zlokachestvennye novoobrazovaniya v Rossii v 2017 godu (zabolevaemost' i smertnost'). (Malignant neoplasms in Russia in 2017 (morbidity and mortality).) Ed. by Kaprin A.D., Starinsky V.V., Petrova G.V. М.: Moscow Federal state budgetary institution “NMIC of radiology”. 2018; 10–25. (In Russ.)
  5. Healthcare in Russia 2019. Statistical Digest. Ed. by The Russian Federal State Statistics Service (Rosstat). Moscow. 2019; 170. http://gks.ru/folder/210/document/13218 (access date: 18.02.2020). (In Russ.)
  6. Gulyan I.S., Chernysheva N.Y., Stenkova A.M et al. Breast cancer: risk-­associated mutations of the BRCA1 gene for screening primorye residents. Tikhookeanskiy meditsinskiy zhurnal. 2018; (1): 44–47. (In Russ.) doi: 10.17238/PmJ1609-1175.2018.1.44-47.
  7. Boichuk S.V., Ramazanov B.R. DNA repair system defects — role in oncogenesis and cancer therapy. Kazan medical journal. 2014; 95 (3): 307–314. (In Russ.) doi: 10.17816/KMJ1503.
  8. Imyanitov E.N. The biology of tumor growth. Prakticheskaya onkologiya. 2017; 18 (4): 307–315. (In Russ.) doi: 10.31917/1804307.
  9. Imyanitov E.N. Biology of breast cancer. Prakticheskaya onkologiya. 2017; 18 (3): 221–231. (In Russ.) doi: 10.31917/1803221.
  10. Timerbulatov V.M., Egorova N.N. Itogi deyatel'nosti Otdeleniya medi­tsinskikh nauk AN RB za 2014 god. (Results of the Department of medical Sciences of the Academy of Sciences of Republic of Bashkortostan for 2014.) Ufa: Academy of ­Sciences of Republic of Bashkortostan, Gilem. 2015; 4–30. (In Russ.)
  11. Kechin A.A., Boyarskikh U.A., Ermolenko N.A. et al. Method for determining nucleotide sequences of exons of the BRCA1 and BRCA2 genes. Patent for invention №2612894. Issued at 13.03.2017. (In Russ.)
  12. BRCA oncogenetics. Instructions for use. DNA-technology. 2017; 2–11. http://dna-technology.ru/files/images/broshura/BRCA.pdf (access date: 18.02.2020). (In Russ.)

Supplementary files

Supplementary Files Action
1.
Рис. 1. Распределение мутаций в генах BRCA1 и BRCA2

View (12KB) Indexing metadata

Statistics

Views

Abstract - 35

PDF (Russian) - 13

Cited-By


PlumX


© 2020 Saрtarova L.M., Cogina E.N., Khasanshina L.M., Galimov S.N.

Creative Commons License

This work is licensed
under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.





This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies