Анализ мутации в генах BRCA1 и RCA2 у пациенток с раком молочной железы в эксперименте

Полный текст

Актуальность. Рак молочной железы (РМЖ) занимает лидирующее место в структуре злокачественных новообразований у женщин Российской Федерации в целом [1]. РМЖ — гетерогенное заболевание, в мире ежегодно регистрируют приблизительно 1 млн новых случаев заболевания [2]. РМЖ представляет с собой злокачественную опухоль железистой ткани молочной железы. Основными причинами развития заболевания считают нарушение генетического и гормонального контроля над ростом клеток в молочной железе, что ведёт к активной пролиферации и разрастанию ткани [3].

По статистике здравоохранения России, у женщин с диагнозом злокачественного новообразования, установленным впервые в жизни, всего зарегистрировано в 2017 г. — 335 275 случаев, в 2018 г. — 338 760 случаев [4]; на 100 тыс. человек в 2017 г. — 425,7, в 2018 г. — 430,3 случая. Выявлено пациенток с диагнозом РМЖ, установленным впервые в жизни, в 2017 г. — 70,6 тыс., в 2018 г. — 70,7 тыс. человек [5]. В 2019 г. все эти показатели увеличились на 1,5%. Возможно, это обусловлено экологическими и экономическими причинами, старением населения и более эффективными методами ранней диагностики.

Проблема онкологических заболеваний стала мировой, и в последние годы большое внимание уделяют диагностике РМЖ с целью выявления генетических маркёров-модификаторов риска развития РМЖ у носителей мутации BRCA1 и BRCA2.

На сегодняшний день клонирован и картирован ряд генов, вовлечённых в канцерогенез при РМЖ, выполняющих функцию генов-супрессоров [6]. В настоящее время известно более 12 тыс. вариаций, и около 5 тыс. из них считают мутациями, ассоциированными с развитием РМЖ. Однако именно для генов BRCA1 и BRCA2 рассчитывают общую пенетрантность для всех мутаций, которые нарушают их функции, и риск развития заболевания может существовать в течение жизни.

Исследование для выявления мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 помогает определить предрасположенность к наследственным формам РМЖ [7]. Патогенетический механизм развития заболевания опосредован нарушением в данных генах репарации дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) различной степени пенетрантности. Большинство клинических случаев наследственного РМЖ ассоциировано с мутациями именно в этих генах, которые обеспечивают также защиту организма от трансформированных клеток, провоцирующих появление опухолевых новообразований [8]. В неповреждённом состоянии оба гена (BRCA1 и BRCA2) являются классическими опухолевыми супрессорами, и кодируемые ими белки играют ведущую роль в репарации разрывов двухцепочечных ДНК путём гомологичной рекомбинации [9]. Потеря функциональной активности вследствие врождённых или приобретённых мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 приводит к нарушению регуляции клеточного цикла, процессов дифференцировки и апоптоза, а также к нарастанию хромосомной нестабильности, приводящей к повышению риска развития РМЖ, рака предстательной железы, эндометрия, яичников, меланомы, а также рака грудных желёз у мужчин [10, 11].

Цель. Оценка наличия мутаций на основании анализа распространённости полиморфизмов в генах ВRCA1 и ВRCA2 у пациенток с РМЖ.

Материал и методы исследования. В исследовании использовали венозную кровь 137 больных РМЖ в возрасте от 25 до 80 лет, поступивших на лечение в Республиканский клинический онкологический диспансер г. Уфы с января по декабрь 2017 г., а также 105 здоровых доноров.

После ретракции сгустка пробы центрифугировали при 3000 об./мин течение 10 мин, затем сыворотку отбирали в микрокюветы и использовали для исследования. У всех обследуемых кровь была получена с их информационного согласия. Исследования были одобрены этическим комитетом Республиканского клинического онкологического диспансера Министерства Здравоохранения Республики Башкортостан.

Молекулярно-генетический анализ (целевые фрагменты геномной ДНК) проводили методом аллель-специфической полимеразной цепной реакции в реальном времени. Для изучения спектра мутаций и поиска значимости маркёров генетического анализа были выбраны четыре мутации гена ВRCA1 и одна мутация гена ВRCA2. В качестве материала для анализа использовали ДНК, выделенную из цельной крови, забор которой осуществляли в специальные вакуумные пробирки Green Vac-Tube (Корея) с антикоагулянтом ЭДТА-К2 объёмом 5 мл. Исследование проводили с использованием наборов реагентов для выявления мутации в генах ВRСА 1 и ВRCA2 методом полимеразной цепной реакции (БиоЛинк, Россия) на анализаторе Rotor-Gene Q (Qiagen GmbH, Германия).

Результаты. Для исследований выбраны мутации 185delAG, 4153delA, 5382insC и T300G в гене BRCA1, а также мутации 6174delT в гене BRCA2, часто встречающиеся в России.

В гене BRCA1, локализованном на хромосоме 17q21.31, исследовали четыре мутации [11]:
– 185delAG, происходящая за счёт отсутствия двух нуклеотидов аденозинмонофосфата (АМФ) и гуанозинмонофосфата в позиции 185 последовательности ДНК гена;
– 4153delA, происходящая за счёт потери АМФ в позиции 4153 последовательности ДНК гена;
– 5382insC, происходящая за счёт инсерции цитидинмонофосфата в позиции 5382 последовательности ДНК;
– мутация T300G — за счёт замены тимина на гуанин в позиции 300 последовательности гена, в результате которой в белке BRCA1 аминокислота цистеин меняется на глицин, что приводит к нарушению функций белка [12].

В гене BRCA2, локализованном на хромосоме 13q13.1, исследовали мутацию 6174delT, происходящую за счёт делеции тимидинмонофосфата в позиции 6174 [12].

Определяемые мутации в генах BRCA1 и BRCA2, ассоциированных с РМЖ, представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Исследуемые мутации в генах BRCA1 и BRCA2

Наименование исследования	Мутация	Генотип
BRCA1 (ген, ассоциированный с раком молочной железы 1)	185delAG	Ins/Ins
	4153delA	Ins/Ins
	5382insC	Del/Del
	T300G	T/T
BRCA2 (ген, ассоциированный с раком молочной железы 2)	6174delT	Ins/Ins

 

Частота и спектр выявленных мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 у больных РМЖ в сравнении со здоровыми донорами представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Частота мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 в эксперименте

Ген	Мутация	Здоровые доноры (n=115)	Пациенты с раком молочной железы (n=137)
BRCA1	185delAG	Не обнаружена	Не обнаружена
	4153delA	Не обнаружена	Обнаружена у 1 (0,73%) больной
	5382insC	Не обнаружена	Обнаружена у 18 (13,14%) больных
	T300G	Не обнаружена	Обнаружена у 1 (0,73%) больной
BRCA2	6174delT	Не обнаружена	Не обнаружена

 

Суммарная частота мутаций в генах BRCA1 и ВRCA2 составила 14,59% общего числа обследованных больных. Наиболее часто встречающаяся мутация — 5382insC в гене BRCA1, её частота составила 13,13% общего числа обследованных больных и 90% общего числа положительных результатов. Частота мутаций 4153delA и T300G составила по 0,73% общего числа обследованных больных (рис. 1).

 

Рис. 1. Распределение мутаций в генах BRCA1 и BRCA2

 

Из рис. 1 видно, что большинство мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 у больных РМЖ, ­находящихся на лечении в Республиканском клиническом онкологическом диспансере Министерства здравоохранения Республики Башкортостан, приходится в гене BRCA1 на экзон 20 — 5382insC.

Обсуждение. Белковый продукт гена BRCA1 ингибирует транскрипцию гена рецептора эстрогенов, сдерживая избыточную пролиферацию клеток молочной железы. Первое место по мутации в генах приходится на ген BRCA1 (экзон 20 — 5382insC), где мутация гена заключается в добавлении одного нуклеотида — цитозина в позиции 5382 последовательности ДНК гена. На втором месте стоит мутация в гене BRCA1 (экзон 11P — 4153delA), которая заключается в утрате одного нуклеотида — аденина в позиции 4153 последовательности ДНК, а также 300 Т >G (экзон 3 — Cys61Gly), где мутация заключается в замене тимина на гуанин в позиции 300 последовательности. В гене BRCA1 (экзон 2 — 185delAG) мутация, заключающаяся в отсутствии двух нуклеотидов (аденина и гуанина) в позиции 185 последовательности ДНК, у пациенток с РМЖ не обнаружена.

Мутация в гене BRCA2 (6174delT) заключается в потере одного нуклеотида — тимина в позиции 6174 последовательности ДНК, которая участвует в репарации ДНК, регуляции клеточного цикла и поддержании генетической стабильности. У пациенток с РМЖ, поступивших на лечение в Республиканский клинический онкологический диспансер г. Уфы, эта мутация не обнаружена. Однако проблема остаётся не до конца изученной и представляет большой интерес для проведения исследования с точки зрения генетики.

Выводы

1. В исследовании образцы ДНК 137 пациенток с диагнозом «рак молочной железы» были тестированы на наличие 5 мутаций в генах BRCA1 и BRCA2. Из общего числа больных 20 человек оказались носителями мутации.

2. Суммарная частота мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 у больных раком молочной железы, имеющих указания на наследственный характер заболевания, составляет 14,59% общего числа обследованных больных с диагнозом «рак молочной железы». Доля наиболее часто встречающейся мутации 5382insC в гене BRCA1 составила 13,13%. Частота мутаций 4153delA и T300G в гене BRCA1 составила по 0,73% общего числа обследованных больных.

3. По данным исследований мутации BRCA2-6174delT и BRCA1-185delAG, ни одна из 137 пациенток с раком молочной железы не была её носителем.

4. Локусы мутаций, обнаруженные у больных раком молочной железы, свидетельствуют о целесообразности включения анализа на наличие мутаций 5382insC, 4153delA и T300G в гене BRCA1 в скрининговые программы по определению риска рака молочной железы и в дальнейшем могут способствовать целенаправленному поиску этих мутаций у родственников.

 

Участие авторов. Л.М.С. и Л.М.Х. проводили исследования; Э.Н.К. отвечала за сбор и анализ результатов; Ш.Н.Г. — руководитель работы.

Источник финансирования. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта по представленной статье.

Об авторах

Лилияна Минкаировна Саптарова

Башкирский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: SaptarovaLiliana@yandex.ru
SPIN-код: 2316-4075
Россия, г. Уфа, Россия

Эльвира Наилевна Когина

Башкирский государственный медицинский университет

Email: SaptarovaLiliana@yandex.ru
SPIN-код: 2437-2131
Россия, г. Уфа, Россия

Ленара Мухтаровна Хасаншина

Республиканский клинический онкологический диспансер

Email: SaptarovaLiliana@yandex.ru
Россия, г. Уфа, Россия

Шамиль Нариманович Галимов

Башкирский государственный медицинский университет

Email: SaptarovaLiliana@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5871-5151
SPIN-код: 6096-1910
Scopus Author ID: 6602936166
ResearcherId: B-9455-2017
Россия, г. Уфа, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы