Prognostic significance of immunohistochemical expression profiles of some antigens in cervical cancer

Full Text

Рак шейки матки (РШМ) занимает одно из ведущих мест в структуре заболеваемости женского населения злокачественными опухолями гениталий [3]. Несмотря на достигнутые успехи в диагностике и лечении рака данной локализации, отмечают рост заболеваемости и увеличение агрессивности болезни [1]. В настоящее время большое внимание уделяют изучению влияния уровня экспрессии в опухоли ряда антигенов (Ki-67, p53, циклина E, p150, металлопротеиназы и других факторов пролиферативной активности, апоптоза, ангиогенеза и т.д.) на показатели эффективности лечения РШМ [2]. Один из наиболее изученных показателей агрессивности опухолевого роста - клеточная пролиферация, которая может быть оценена с помощью митотического индекса и уровня экспрессии Ki-67. Последний представляет собой ядерный антиген, экспрессируемый во всех фазах клеточного цикла, кроме G0 и ранних стадий фазы G1. Пролиферативный индекс при различных локализациях опухоли служит независимым прогностическим показателем возникновения рецидива, общей и безрецидивной выживаемости, а также предсказательным фактором для определения чувствительности к химио- и лучевой терапии. Наличие функциональных и структурных нарушений регуляторов клеточного цикла (циклинов и циклин-зависимых киназ) было установлено в клетках разного рода злокачественных новообразований. Отмечен более высокий уровень экспрессии гена циклина В1 в клетках инвазивного РШМ, чем в клетках нормальной ткани (p=0,019). Не выявлено значительных различий в уровне экспрессии циклина D1 [11]. По данным отдельных исследований было установлено, что сверхэкспрессия циклина D1 вне зависимости от стадии РШМ и его гистологического варианта является независимым неблагоприятным прогностическим фактором [6]. Однако относительно РШМ значимость оценки иммуногистохимических маркёров остаётся малоизученной, единого мнения о прогностической роли экспрессии Ki-67, Her2/neu, Bcl-2, p53 и её сочетания с другими клинико-морфологическими особенностями опухоли не получено [7, 8, 10]. Цель настоящего исследования - изучить прогностическую значимость профиля экспрессии ряда антигенов у пациенток, страдающих РШМ. Изучены данные первичной медицинской документации (истории болезни и амбулаторные карты) с привлечением информации Белорусского канцер-регистра о 100 женщинах, получивших специальное лечение в Республиканском научно-практическом центре онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н. Александрова и Гродненской областной клинической больнице. Проведено гистологическое исследование и изучение экспрессии иммуногистохимических маркёров Ki-67, Her2/neu, Bcl-2 и р53 в ткани опухоли. Из общего числа пациенток 39 имели РШМ I стадии, 31 - II стадии, 26 - III стадии, 4 - IV стадии. В возрастную группу первого периода зрелости вошли 15 человек, второго периода зрелости - 69, в группу пожилых - 16 женщин (табл. 1). По данным гистологического исследования 94 пациентки имели плоскоклеточную форму рака, 6 - аденогенную. Проведена иммуногистохимическая оценка экспрессии тканевых антигенов р-53, Ki-67, Bcl-2 с коммерческими моноклональными антителами фирмы «DakoCytomation» (Дания) [5]. Перед проведением иммуногистохимического исследования была отработана методика окрашивания с подбором оптимального разведения первичных антител, времени экспозиции, демаскировочного буфера [5]. Из архивных парафиновых блоков изготавливали серийные срезы толщиной 5 мкм, которые затем помещали на предметные стекла «SuperFrost» («Menzel-Glaser», Германия) и высушивали в течение суток при комнатной температуре. Перед окрашиванием срезы в вертикальном положении помещали в термостат на 60 мин при температуре 60 °С. После этого проводили депарафинирование в ортоксилоле (в батарее из двух ёмкостей, по 10 мин в каждой), регидратацию в этиловом спирте нисходящей концентрации (в батарее из трёх ёмкостей, по 3 мин в каждой) и промывание в дистиллированной воде. Предметные стекла со срезами переносили в соответствующий подогретый демаскировочный буфер («Target Retrieval Solution») и помещали в водяную баню при температуре 98 °С на 20-40 мин. После охлаждения до комнатной температуры препараты промывали 2-3 раза в буферном растворе [водородный показатель (рН) = 7,4]. Для блокирования эндогенной пероксидазы срезы обрабатывали 3% раствором водорода пероксида (перекиси водорода) в течение 15 мин. Общая характеристика использованных антител приведена в табл. 2. Для блокирования неспецифического связывания антител и устранения фона препараты обрабатывали готовым к применению «Protein Bloсk» (Х0909, «DakoCytomation») в течение 10 мин. Инкубацию с первичными моноклональными антителами в нужных разведениях осуществляли в течение 60-120 мин при комнатной температуре. В качестве системы визуализации использовали комплекс вторичных антител «EnVision» (К4001 или К4003) фирмы «Dako» (экспозиция 30 мин). Непосредственно перед применением готовили рабочий раствор хромогена (диаминобензидина) из расчёта 1 капля диаминобензидина на 1 мл азидного буфера (экспозиция 5-10 мин, специфический продукт реакции окрашивался в коричневый цвет разной степени интенсивности). Затем срезы промывали дистиллированной водой, докрашивали гематоксилином Майера по общепринятой методике и заключали в полистирол. После получения цифрового изображения проводили оценку экспрессии изучаемых маркёров согласно разработанным алгоритмам [10]. Статистический анализ данных выполняли с использованием программы «R-system V. 2.8.0» (GPL, лицензия). Для выполнения различных статистических тестов, моделирования, отображения полученной информации использовали дополнительные модули. Для оценки влияния потенциальных факторов риска на время до выявления прогрессирования заболевания использовали регрессионный и стратифицированный регрессионный анализ пропорциональных рисков Кокса [9]. Одновременные события учитывали согласно Брэслоу. Оценку значимости влияния фактора риска на общую наблюдаемую выживаемость (ОНВ) выполняли с помощью статистического анализа Уалда. Значимость модели определялась методом максимального правдоподобия. При осуществлении многофакторного анализа использовали сведения о медиане времени жизни у 1100 женщин с диагнозом РШМ I-IV стадий, которые получили лечение в Беларуси с 1991 по 2005 гг. и были представлены в предыдущей нашей публикации [4]. В результате проведённых исследований установлено, что уровень экспрессии антигена пролиферативной активности опухоли Ki-67 варьировал от 0 до 98%, мутантного протеина p-53 - от 0 до 100%, проапоптотического антигена Bcl-2 - от 0 до 80%, онкопротеина HER2/neu - score от 0 до 3 (+). Распределение пациенток по уровню экспрессии Ki-67, Bcl-2, p53 и HER2/neu с учётом степени распространения РШМ проиллюстрировано на рис. 1. Низкий уровень экспрессии Ki-67 выявлен у 44 (44%), промежуточный - у 19 (19%), высокий у - 37 (37%) пациенток. При этом низкий уровень пролиферативной активности опухоли Ki-67 диагностирован у 2 женщин с РШМ I стадии, у 10 - во II стадии, у 8 - в III стадии. Умеренный уровень отмечен в 19 наблюдениях при I стадии, в 5 - при II стадии, в 8 - при III стадии. Высокая экспрессия антигена выявлена у 8 пациенток при РШМ I стадии, у 16 - при II стадии, у 10 - при III стадии (р <0,05). Среднее значение уровня Ki-67 при I стадии заболевания составило 23,03±0,52%, при II - 52,94±34,5%, при III - 44,81±34,17% (р <0,05). Отмечена статистическая значимость различий между показателем среднего значения экспрессии Ki-67 у пациенток с I и II, I и III стадиями заболевания (р <0,05), а также отсутствие значимых различий между показателем среднего значения маркёра при II и III стадиях болезни (р >0,05). Низкий уровень экспрессии мутантного белка p53 диагностирован у 44 (55%), умеренный - у 16 (16%), высокий - у 29 (29%) женщин. Низкая экспрессия р53 отмечена у 34 пациенток с РШМ I стадии, у 14 - при II стадии, у 7 - при III стадии. Высокий уровень мутантного белка р53 обнаружен соответственно у 1, 10 и 16 пациенток (р <0,05). Среднее значение уровня p53 при I стадии заболевания составило 6,03±13,42%, при II - 36,58±34,53%, при III - 53,08±32,21% (р <0,05). Выявлены статистическая значимость различий между средним показателем экспрессии p53 у женщин с I и II, I и III стадиями заболевания (р <0,05) и отсутствие значимых различий между средним уровнем маркёра при II и III стадиях рака (р >0,05). Оценка экспрессии антиапоптотического антигена Bcl-2 показала, что низкий уровень экспрессии выявлен у 92 (92%), умеренный - у 6 (6 %), высокий - у 2 (2%) человек. Низкий уровень онкопротеина Bcl-2 диагностирован у 39 пациенток, страдающих РШМ I стадии, у 27 - при II стадии, у 22 - при III стадии. Умеренный и высокий уровень экспрессии тканевого антигена обнаружен у пациенток со II (3 и 1 случай) и III стадией заболевания (3 и 1 случай) соответственно (р <0,05). Среднее значение уровня антигена Bcl-2 при I стадии заболевания составило 0,72±0,91%, при II - 6,81±16,38%, при III - 10,54±15,65% (р <0,05). Выявлена статистическая значимость различий между показателями среднего значения экспрессии Bcl-2 при РШМ I и II, I и III стадий заболевания (р <0,05), а также отсутствие значимых различий между показателем среднего значения опухолевого маркёра при II и III стадиях РШМ (р >0,05). Экспрессия онкопротеина HER2/neu не обнаружена у 56 (56%) человек. Низкая экспрессия антигена (score 1 «+») установлена у 21 (21%), умеренная (score «2+») - у 16 (16%), гиперэкспрессия (score «3+») - у 7 (7%) пациенток. Низкий уровень экспрессии опухолевого антигена HER2/neu score «+» обнаружен у 5 женщин при РШМ I стадии, у 9 - при II стадии, у 7 - при III стадии, score «2+» - у 10, 2 и 4 человек, score «3+» - в 4, 1 и 1 наблюдениях соответственно (р >0,05). 5-летняя ОНВ пациенток с РШМ I стадии в исследуемой группе составила 94,9% [95% доверительный интервал (ДИ)=88,2-100)], при II - 62,8% [95% ДИ=46,8-84,3], при III - 32,1% [95% ДИ=15,4-67,2] (p <0,0005). У женщин с диагнозом РШМ I и II стадии медиана времени жизни не была достигнута, а при III стадии заболевания она составила 31 мес [95% ДИ=13-НД1], при IV - 9,5 мес [95% ДИ=5-НД] (p <0,0005). В целом по группе медиана времени жизни пациенток не была достигнута. В табл. 3 представлены результаты многофакторного анализа прогностической роли экспрессии изученных онкогенов без учёта влияния распространённости опухолевого процесса на ОНВ. Наиболее значимой оказалась пролиферативная активность по метке Ki-67, поскольку при увеличении этого показателя на 1 единицу ОНВ снижалась в 0,9884 раза, pУалда=0,088. Табл. 4 содержит коэффициенты, полученные в результате многофакторного анализа влияния изучаемых онкогенов на ОНВ с учётом степени распространения опухолевого процесса. Далее путём подстановки значений коэффициентов был высчитан риск прогрессирования РШМ для каждой из пациенток, которым было выполнено иммуногистохимическое исследование (100 пациенток). На основании ранее полученных данных о медиане времени жизни у 1100 пациенток, страдавших РШМ I-IV стадий, они были разделены на группы с различным прогнозом. Значение коэффициента риска прогрессирования при РШМ I стадии варьировало от 0,06 до 1,169 (среднее значение 0,369). В случае смерти он варьировал от 0,387 до 0,831 и в среднем соответствовал 0,645. Из 39 пациенток, имеющих РШМ I стадии, умерли 3 (7,69%), медиана времени жизни у них оказалась равной 10, 26 и 72 мес. Значение коэффициента вероятности прогрессирования при II стадии заболевания составило 1,596-4,084 (среднее значение 3,307). В случае смерти этот показатель варьировал от 2,946 до 3,878 (среднее значение 3,237). Из 31 пациентки с РШМ II стадии умерли 10 (32,26%), причём у 9 из них медиана времени жизни оказалась ниже 87 мес (показатель колебался от 6 до 32 мес). Значение коэффициента риска прогрессирования заболевания при III стадии составило 2,427-4,7 (среднее значение 3,814). В случае смерти этот показатель варьировал от 2,538 до 4,392 (среднее значение 3,690). Из 26 пациенток, страдавших РШМ III стадии, умерли 13 (50%). У 8 умерших медиана времени жизни оказалась ниже 18 мес (показатель колебался от 4 до 13 мес). На основании вышеизложенного определён риск прогрессирования РШМ с учётом названных факторов: HR=(X+0,012×Ki67+0,001×p53 - 0,020×Bcl2+0,207×Y), где Х=0 при стадии I; Х=2,691 при стадии II; Х=3,338 при стадии III; Y=1 при наличии экспрессии HER2/neu, равной «+++»; Y=0 при отсутствии экспрессии HER2/neu. При значении прогностического коэффициента ≤0,645 при РШМ I стадии, ≤3,237 при II стадии и ≤3,690 при III стадии пациентку относят к группе с благоприятным прогнозом РШМ, а при его значении >0,645 при РШМ I стадии, >3,237 при II стадии и >3,690 при III стадии пациентку относят к группе с неблагоприятным прогнозом (p <0,0001). Выявлены статистически значимые различия между показателями среднего значения экспрессии ядерного антигена Ki-67 у пациенток с I и II, I и III стадиями заболевания (р <0,05), а также отсутствие значимых различий между показателями среднего значения маркёра при II и III стадиях болезни (при I стадии - 23,03±0,52%, при II - 52,94±34,5%, при III - 44,81±34,17%). Отмечен рост экспрессии p53 с увеличением распространённости опухолевого процесса (среднее значение уровня p53 при I стадии заболевания составляет 6,03±13,42%, при II - 36,58±34,53%, при III - 53,08±32,21%, р <0,05). Установлена статистическая значимость (р <0,05) различий между средним показателем экспрессии Bcl-2 при РШМ I и II, I и III стадий (при I - 0,72±0,91%, при II - 6,81±16,38%, при III - 10,54±15,65%), а также отсутствие значимых различий между средним уровнем маркёра в случае II и III стадий РШМ (р >0,05). Уровень экспрессии онкопротеина HER2/neu в опухолевой ткани не коррелировал со степенью распространения опухолевого процесса у пациенток, страдающих РШМ. Для расчёта риска прогрессирования РШМ с учётом распространённости опухолевого процесса и уровня экспрессии Ki-67, HER2/neu, Bcl-2 и p53 разработана прогностическая модель (p <0,0001): HR=(X+0,012×Ki67+0,001×p53 - 0,020×Bcl2+0,207×Y) При значении коэффициента риска прогрессирования РШМ >0,645 при I стадии, >3,237 - при II, >3,690 - при III стадии пациенток следует отнести к группе с неблагоприятным прогнозом, когда необходимо проведение адъювантного лучевого и/или лекарственного воздействия, а также увеличение суммарных очаговых доз в случае проведения сочетанной лучевой терапии. ВЫВОД Экспрессия маркёров Ki-67, р53, Bcl-2 в совокупности со степенью распространения опухоли служит прогностическим критерием при раке шейки матки. Таблица 1 Распределение пациенток с учётом возраста и распространённости рака шейки матки Возрастная группа Распространённость опухолевого процесса (стадия) I II III IV n % n % n % n % Первый период зрелости 1 2,6 6 19,4 7 26,9 1 25 Второй период зрелости 28 71,8 22 71 17 65,4 2 50 Пожилые 10 25,6 3 9,6 2 7,7 1 25 Всего 39 100 31 100 26 100 4 100 Таблица 2 Характеристика использованных антител Антитела* Клон, источник Время инкубации с первичными антителами, мин Демаскировочный буфер, рН Ki-67 Ki-s5 60 9 bсl-2 124 60 9 p53 Мышиные DO-7 60 6 Her2/neu Кроличьи А0485 5 9 Примечание: *первичные антитела, готовые к применению. Рис. 1. Распределение пациенток по выраженности экспрессии Ki-67, Bcl-2, p53 и HER2/neu в опухолевой ткани. missing image file missing image file 1НД - данные не получены. Таблица 3 Результаты регрессионного анализа пропорциональных рисков Кокса у пациенток с экспрессией Ki-67, p53, Bcl-2, Her2/neu Параметр Вычисленные значения Коэффициент Относительный риск 95% ДИ pУалда Ki67 0,9884 1,01 0,975-1,022 0,0888 p53 0,9967 1,003 0,989-1,018 0,6466 Bcl-2 1,0185 0,99 0,947-1,018 0,321 Her2/neu 0,778 1,29 0,810-2,041 0,2871 Таблица 4 Результаты регрессионного анализа пропорциональных рисков Кокса у пациенток с исследованной экспрессией Ki-67, p53, Bcl-2, Her2/neu с учётом распространённости рака шейки матки Параметр Вычисленные значения Коэффициент для формулы Коэффициент Относительный риск 95% ДИ pУалда II стадия 2,679701 0,06856 14,6 3,0477-69,757 0,0008 III стадия 3,255491 0,038 25,9 5,2424-128,279 <0,0005 Ki67 -0,011261 0,9888 1,01 0,9756-1,002 0,0999 p53 0,002478 0,9975 1,003 0,9886-1,017 0,7276 Bcl-2 -0,017271 1,0174 0,98 0,9480-1,019 0,3491 Her2/neu 0,266996 0,7657 1,31 0,8249-2,068 0,2547

About the authors

I A Kosenko

Republican Scientific and Practical Centre of Oncology and Medical Radiology named after Alexandrov, Republic of Belarus

Email: Ikosenko@tut.by

T M Litvinova

Belorussian State Medical University, Minsk, Republic of Belarus

R M Smolyakova

Republican Scientific and Practical Centre of Oncology and Medical Radiology named after Alexandrov, Republic of Belarus

A P Vasilevskiy

Republican Scientific and Practical Centre of Oncology and Medical Radiology named after Alexandrov, Republic of Belarus

N N Pischik

Grodno Regional Hospital, Republic of Belarus

References

Supplementary files