Моделирование окислительного стресса в лимфоцитах крови in vitro для изучения апоптоза опухолевых клеток линии Jurkat

Полный текст

Оксидативный стресс - составная часть [8]. Присущая опухолевой трансформации патогенеза многих заболеваний, таких как дизрегуляция летальной программы клеток ишемическое и реперфузионное повреждение обусловлена изменением соотношения про-и тканей, воспалительные процессы, сосудистые антиапоптогенных белков, возникающим в нарушения, атеросклероз, нейродегенератив результате последовательной активации реные и онкологические заболевания, а также докс-зависимых элементов сигнальной транс процессов адаптации и старения [4]. Активдукции различными факторами как внутри-, ные формы кислорода (АФК) участвуют в так и внеклеточного происхождения, привопрямом повреждении дезоксирибонуклеино дящими к изменению окислительно-восставой кислоты (ДНК), могут нарушать процес новительного баланса клетки и адекватного сы апоптоза, редокс-баланс, регуляцию путей функционирования различных систем [9].передачи клеточных сигналов и др. [15]. Несмотря на многочисленные исследования На сегодняшний день онкологические за в области идентификации молекулярных ми болевания занимают второе место по смерт шеней для регулирования процесса гибели ности после сердечно-сосудистых заболеваний клеток при опухолевом росте [6, 7, 11-13], на данный момент вопрос остаётся открытым. Адрес для переписки: olnosareva@yandex.ru Значительную долю в этой области занима ют исследования, направленные на изучение активации апоптоза опухолевых клеток. Для объяснения молекулярных механизмов реализации и регуляции апоптоза опухолевых клеток необходимо учитывать изменение в системе глутатиона. Восстановленный глутатион не только способен снижать деструктивное и цитотоксическое действие АФК при опухолевой трансформации, но и участвовать в передаче внутриклеточных сигналов, редокс-регуляции транскрипционных факторов, экспрессии генов и активности процессов, приводящих к апоптозу [5, 9]. Для исследования участия окислительного стресса при различных патологических процессах применяют методы моделирования данного состояния как in vitro, так и in vivo [2]. Одним из способов индукции апоптоза служит воздействие водорода пероксида на изучаемые клетки [1]. Отсутствие данных литературы об особенностях реагирования системы глутатиона в лимфоцитах крови в зависимости от концентрации водорода пероксида in vitro, разнообразие способов индикации фенотипических проявлений апоптоза и некроза в исследованиях различных авторов определили цель исследования - экспериментальный подбор оптимальной концентрации Н2О2, способной эффективно индуцировать развитие окислительного стресса и запуск программированной гибели максимального количества лимфоцитов крови, но не их элиминацию по пути некроза. В качестве объекта исследования была использована опухолевая клеточная линии Jurkat (Т-лимфобластный лейкоз человека), полученная из Российской коллекции клеточных культур института цитологии Российской академии наук ( Санкт-Петербург), а также лимфоциты, выделенные из крови здоровых доноров (15 мужчин и 18 женщин) в возрасте от 18 до 25 лет. Культивирование опухолевых клеток линии Jurkat проводили суспензионным методом в полной питательной среде, содержащей 90% RPMI-1640 («Вектор-Бест», Россия), 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Invitrogen», США), инактивированной при 56 °С в течение 30 мин, 0,3 мг/мл L-глутамина («Вектор-Бест», Россия) и 100 мкг/мл гентамицина («INS», США) при температуре 37 ºСи в 5% атмосфере СО2. Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста и пересаживали через 3 сут. Первоначально из венозной крови выделяли мононуклеарные клетки путём центрифугирования на градиенте «Ficoll-Paque» («Pharmаcia», Швеция, ρ=1,077 г/ см3) [10], далее на градиенте «Перколла» («Sigma», США, ρ=1,130 г/см3) выделяли лимфоциты [14]. Затем полученные клетки культивировали с Н2О2 при 37 °С и 5% СО2 в течение 1 ч в полной питательной среде RPMI-1640. Добавление Н2О2 в конечных концентрациях 0,3; 0,5; 1,0 и 2,0 мМ инициировало окислительный стресс. Для подтверждения объекта исследования (Т-лимфоциты крови) использовали типирование изучаемых клеток по CD5 при помощи метода проточной цитофлуориметрии и с использованием анти-CD5, меченых флюоресцеином изотиоцианатом (FITC) («BD Pharmingen™», США). Для изотипического контроля применяли подкласс иммуноглобулинов IgG1-FITC («BD Pharmingen™», США). Для сравнительной оценки степени окислительного стресса между опухолевыми клетками и лимфоцитами крови исследовали уровень АФК и отношение восстановленного глутатиона к окисленному. Уровень восстановленного и окисленного глутатиона определяли методом, предложенным M.E. Anderson (1985) в модификации Kojima S. и соавт. (2004). Определение концентрации внутриклеточных АФК проводили с помощью дихлорфлюоресцеина диацетата методом проточной цитофлуориметрии. В основе метода лежит способность дихлорфлюоресцеина диацетата (изначально не флюоресцирующего) пассивно проникать внутрь клетки и под действием эстераз переходить в полярное соединение, не способное диффундировать обратно из клетки, которое после реакции с Н2О2 превращается во флюоресцирующий метаболит. Определение количества аннексин-и пропидия йодид-положительных клеток проводили методом проточной цитофлуориметрии с использованием FITC-меченого аннексина V и пропидия йодида («Beckman Coulter», Франция). Метод основан на способности аннексина V специфически связываться с фосфатидилсерином, экспрессированным на внешней стороне цитоплазматической мембраны, что указывает на возможность вступления клетки в апоптоз или воспринимается как сигнал к фагоцитозу. Молекулы же пропидия йодида (Pi) способны проникать в повреждённые клетки и интеркалировать с дефрагментированной ДНК при некрозе клетки. Статистическую обработку полученных результатов проводили при помощи программы Statistica 6.0. Проверку нормальности распределения количественных показателей осуществляли с использованием критерия Шапиро- Уилка. Достоверность различий оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Статистически значимыми считали различия при р <0,05. Далеко не для всех типов клеток подобраны оптимальные условия воссоздания окислительного стресса, в современной литературе отсутствуют данные об изменении метаболизма лимфоцитов крови под воздействием различных концентраций Н2О2 in vitro. Оптимальным индикатором степени формирования окисли © 47. «Казанский мед. ж.», №5. Рис. 3. Конечная концентрация водорода перокисида 2 мМ; FITC - флюоресцеин изотиоцианат; АРС - аллофикоцианин; А - канал на проточном цитофлуориметре; Q1 - аннексин V-FITC-; пропидия иодид+; Q2 - аннексин V-FITC+; пропидия иодид+; Q3 - аннексин V-FITC-; пропидия иодид-; Q4 - аннексин V-FITC+; пропидия иодид-. Рис. 5. Конечная концентрация водорода перокисида 0,5 мМ; FITC - флюоресцеин изотиоцианат; АРС - аллофикоцианин; А - канал на проточном цитофлуориметре; Q1 - аннексин V-FITC-; пропидия иодид+; Q2 - аннексин V-FITC+; пропидия иодид+; Q3 - аннексин V-FITC-; пропидия иодид-; Q4 - аннексин V-FITC+; пропидия иодид-. способствующего вступлению в апоптоз максимального количества клеток, оптимальна концентрация 0,5 мМ, поскольку при этом не активируются процессы некротической гибели и создаются условия, позволяющие с наибольшей вероятностью воспроизвести внутриклеточный уровень активных форм кислорода, характерный для опухолевых клеток. Рис. 4. Конечная концентрация водорода перокисида 0,3 мМ; FITC - флюоресцеин изотиоцианат; АРС - аллофикоцианин; А - канал на проточном цитофлуориметре; Q1 - аннексин V-FITC-; пропидия иодид+; Q2 - аннексин V-FITC+; пропидия иодид+; Q3 - аннексин V-FITC-; пропидия иодид-; Q4 - аннексин V-FITC+; пропидия иодид-. Рис. 6. Конечная концентрация опухолевых клеток линии Jurkat; FITC - флюоресцеин изотиоцианат; АРС - аллофикоцианин; А - канал на проточном цитофлуориметре; Q1 - аннексин V-FITC-; пропидия иодид+; Q2 - аннексин V-FITC+; пропидия иодид+; Q3 - аннексин V-FITC-; пропидия иодид-; Q4 - аннексин V-FITC+; пропидия иодид-. Данное исследование выполнено при финансовой поддержке Минобрнауки РФ в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 гг.» а также в рамках гранта Президента РФ для государственной поддержки ведущих научных школ

Об авторах

Наталья Владимировна Рязанцева

Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

Елена Алексеевна Степовая

Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

Елена Валерьевна Коновалова

Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

Ольга Леонидовна Носарева

Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

Email: olnosareva@yandex.ru

Анастасия Ивановна Наумова

Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

Дмитрий Сергеевич Орлов

Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

Оксана Николаевна Веснина

Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

Вячеслав Викторович Новицкий

Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

Список литературы

Дополнительные файлы