Oxidative stress modeling in the blood lymphocytes in vitro to examine the Jurkat line tumor cells apoptosis

Cover Page


Cite item

Full Text

Abstract

Aim. To experimentally select the optimum concentration of hydrogen peroxide capable of efficiently induce oxidative stress and launch the programmed death of the maximum number of lymphocytes, but not induce the necrosis. Methods. Jurkat tumor cell line (human T-lymphoblastic leukemia) lymphocytes isolated from the blood of healthy donors (15 males, 18 females) aged 18 to 25 years were the objects of the study. To confirm the object of study, blood cells typing for CD5 using flow cytometry was performed. To model the oxidative stress in vitro, blood lymphocytes were incubated in the presence of hydrogen peroxide at a final concentration of 0.3, 0.5, 1.0 and 2.0 mM. Reduced and oxidized glutathione levels estimation, the ratio between the fractions, and the level of reactive oxygen forms in lymphocytes for a relative assessment of the oxidative stress degree in cancer cells, were used. Results. An optimal final concentration of hydrogen peroxide - 0.5 mM - was established, causing an increase of active oxygen forms concentration in cells, comparable to levels in tumor cells, the formation of a maximum number of annexin positive cells and minimum number propidium-positive cells and the comparable ratio of the reduced and oxidized glutatione levels. Conclusion. The optimum concentration of hydrogen peroxide (0.5 mM) was selected for the oxidative stress formation in the peripheral blood lymphocytes to study the apoptosis dysregulation in oxidative stress in Jurkat line tumor cells (human T-lymphoblastic leukemia).

Full Text

Оксидативный стресс - составная часть [8]. Присущая опухолевой трансформации патогенеза многих заболеваний, таких как дизрегуляция летальной программы клеток ишемическое и реперфузионное повреждение обусловлена изменением соотношения про-и тканей, воспалительные процессы, сосудистые антиапоптогенных белков, возникающим в нарушения, атеросклероз, нейродегенератив результате последовательной активации реные и онкологические заболевания, а также докс-зависимых элементов сигнальной транс процессов адаптации и старения [4]. Активдукции различными факторами как внутри-, ные формы кислорода (АФК) участвуют в так и внеклеточного происхождения, привопрямом повреждении дезоксирибонуклеино дящими к изменению окислительно-восставой кислоты (ДНК), могут нарушать процес новительного баланса клетки и адекватного сы апоптоза, редокс-баланс, регуляцию путей функционирования различных систем [9].передачи клеточных сигналов и др. [15]. Несмотря на многочисленные исследования На сегодняшний день онкологические за в области идентификации молекулярных ми болевания занимают второе место по смерт шеней для регулирования процесса гибели ности после сердечно-сосудистых заболеваний клеток при опухолевом росте [6, 7, 11-13], на данный момент вопрос остаётся открытым. Адрес для переписки: olnosareva@yandex.ru Значительную долю в этой области занима ют исследования, направленные на изучение активации апоптоза опухолевых клеток. Для объяснения молекулярных механизмов реализации и регуляции апоптоза опухолевых клеток необходимо учитывать изменение в системе глутатиона. Восстановленный глутатион не только способен снижать деструктивное и цитотоксическое действие АФК при опухолевой трансформации, но и участвовать в передаче внутриклеточных сигналов, редокс-регуляции транскрипционных факторов, экспрессии генов и активности процессов, приводящих к апоптозу [5, 9]. Для исследования участия окислительного стресса при различных патологических процессах применяют методы моделирования данного состояния как in vitro, так и in vivo [2]. Одним из способов индукции апоптоза служит воздействие водорода пероксида на изучаемые клетки [1]. Отсутствие данных литературы об особенностях реагирования системы глутатиона в лимфоцитах крови в зависимости от концентрации водорода пероксида in vitro, разнообразие способов индикации фенотипических проявлений апоптоза и некроза в исследованиях различных авторов определили цель исследования - экспериментальный подбор оптимальной концентрации Н2О2, способной эффективно индуцировать развитие окислительного стресса и запуск программированной гибели максимального количества лимфоцитов крови, но не их элиминацию по пути некроза. В качестве объекта исследования была использована опухолевая клеточная линии Jurkat (Т-лимфобластный лейкоз человека), полученная из Российской коллекции клеточных культур института цитологии Российской академии наук ( Санкт-Петербург), а также лимфоциты, выделенные из крови здоровых доноров (15 мужчин и 18 женщин) в возрасте от 18 до 25 лет. Культивирование опухолевых клеток линии Jurkat проводили суспензионным методом в полной питательной среде, содержащей 90% RPMI-1640 («Вектор-Бест», Россия), 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Invitrogen», США), инактивированной при 56 °С в течение 30 мин, 0,3 мг/мл L-глутамина («Вектор-Бест», Россия) и 100 мкг/мл гентамицина («INS», США) при температуре 37 ºСи в 5% атмосфере СО2. Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста и пересаживали через 3 сут. Первоначально из венозной крови выделяли мононуклеарные клетки путём центрифугирования на градиенте «Ficoll-Paque» («Pharmаcia», Швеция, ρ=1,077 г/ см3) [10], далее на градиенте «Перколла» («Sigma», США, ρ=1,130 г/см3) выделяли лимфоциты [14]. Затем полученные клетки культивировали с Н2О2 при 37 °С и 5% СО2 в течение 1 ч в полной питательной среде RPMI-1640. Добавление Н2О2 в конечных концентрациях 0,3; 0,5; 1,0 и 2,0 мМ инициировало окислительный стресс. Для подтверждения объекта исследования (Т-лимфоциты крови) использовали типирование изучаемых клеток по CD5 при помощи метода проточной цитофлуориметрии и с использованием анти-CD5, меченых флюоресцеином изотиоцианатом (FITC) («BD Pharmingen™», США). Для изотипического контроля применяли подкласс иммуноглобулинов IgG1-FITC («BD Pharmingen™», США). Для сравнительной оценки степени окислительного стресса между опухолевыми клетками и лимфоцитами крови исследовали уровень АФК и отношение восстановленного глутатиона к окисленному. Уровень восстановленного и окисленного глутатиона определяли методом, предложенным M.E. Anderson (1985) в модификации Kojima S. и соавт. (2004). Определение концентрации внутриклеточных АФК проводили с помощью дихлорфлюоресцеина диацетата методом проточной цитофлуориметрии. В основе метода лежит способность дихлорфлюоресцеина диацетата (изначально не флюоресцирующего) пассивно проникать внутрь клетки и под действием эстераз переходить в полярное соединение, не способное диффундировать обратно из клетки, которое после реакции с Н2О2 превращается во флюоресцирующий метаболит. Определение количества аннексин-и пропидия йодид-положительных клеток проводили методом проточной цитофлуориметрии с использованием FITC-меченого аннексина V и пропидия йодида («Beckman Coulter», Франция). Метод основан на способности аннексина V специфически связываться с фосфатидилсерином, экспрессированным на внешней стороне цитоплазматической мембраны, что указывает на возможность вступления клетки в апоптоз или воспринимается как сигнал к фагоцитозу. Молекулы же пропидия йодида (Pi) способны проникать в повреждённые клетки и интеркалировать с дефрагментированной ДНК при некрозе клетки. Статистическую обработку полученных результатов проводили при помощи программы Statistica 6.0. Проверку нормальности распределения количественных показателей осуществляли с использованием критерия Шапиро- Уилка. Достоверность различий оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Статистически значимыми считали различия при р <0,05. Далеко не для всех типов клеток подобраны оптимальные условия воссоздания окислительного стресса, в современной литературе отсутствуют данные об изменении метаболизма лимфоцитов крови под воздействием различных концентраций Н2О2 in vitro. Оптимальным индикатором степени формирования окисли © 47. «Казанский мед. ж.», №5. Рис. 3. Конечная концентрация водорода перокисида 2 мМ; FITC - флюоресцеин изотиоцианат; АРС - аллофикоцианин; А - канал на проточном цитофлуориметре; Q1 - аннексин V-FITC-; пропидия иодид+; Q2 - аннексин V-FITC+; пропидия иодид+; Q3 - аннексин V-FITC-; пропидия иодид-; Q4 - аннексин V-FITC+; пропидия иодид-. Рис. 5. Конечная концентрация водорода перокисида 0,5 мМ; FITC - флюоресцеин изотиоцианат; АРС - аллофикоцианин; А - канал на проточном цитофлуориметре; Q1 - аннексин V-FITC-; пропидия иодид+; Q2 - аннексин V-FITC+; пропидия иодид+; Q3 - аннексин V-FITC-; пропидия иодид-; Q4 - аннексин V-FITC+; пропидия иодид-. способствующего вступлению в апоптоз максимального количества клеток, оптимальна концентрация 0,5 мМ, поскольку при этом не активируются процессы некротической гибели и создаются условия, позволяющие с наибольшей вероятностью воспроизвести внутриклеточный уровень активных форм кислорода, характерный для опухолевых клеток. Рис. 4. Конечная концентрация водорода перокисида 0,3 мМ; FITC - флюоресцеин изотиоцианат; АРС - аллофикоцианин; А - канал на проточном цитофлуориметре; Q1 - аннексин V-FITC-; пропидия иодид+; Q2 - аннексин V-FITC+; пропидия иодид+; Q3 - аннексин V-FITC-; пропидия иодид-; Q4 - аннексин V-FITC+; пропидия иодид-. Рис. 6. Конечная концентрация опухолевых клеток линии Jurkat; FITC - флюоресцеин изотиоцианат; АРС - аллофикоцианин; А - канал на проточном цитофлуориметре; Q1 - аннексин V-FITC-; пропидия иодид+; Q2 - аннексин V-FITC+; пропидия иодид+; Q3 - аннексин V-FITC-; пропидия иодид-; Q4 - аннексин V-FITC+; пропидия иодид-. Данное исследование выполнено при финансовой поддержке Минобрнауки РФ в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 гг.» а также в рамках гранта Президента РФ для государственной поддержки ведущих научных школ
×

About the authors

N V Ryazantseva

Siberian State Medical University, Tomsk, Russia

E A Stepovaya

Siberian State Medical University, Tomsk, Russia

E V Konovalova

Siberian State Medical University, Tomsk, Russia

O L Nosareva

Siberian State Medical University, Tomsk, Russia

Email: olnosareva@yandex.ru

A I Naumova

Siberian State Medical University, Tomsk, Russia

D S Orlov

Siberian State Medical University, Tomsk, Russia

O N Vesnina

Siberian State Medical University, Tomsk, Russia

V V Novitsky

Siberian State Medical University, Tomsk, Russia

References

  1. Архипов С.А., Шкурупий В.А., Зайковская М.В. и др. Разноправленные эффекты Н2О2 на макрофаги и фибробласты в условиях моделирования окислительного стресса // Современ. наукоёмк. технол. - 2010. - №8. - С. 76-77.
  2. Дубинина Е.Е., Пустыгина А.В. Окислительная модификация протеинов, её роль при патологических состояниях // Украин. биохим. ж. - 2008. - Т. 80, №6. - С. 5-18.
  3. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Глутатион ядра клетки и его функции // Вопр. биол., мед. и фармацевт. хим. - 2010. - №5. - С. 3-5.
  4. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Ланкин В.З. и др. Окислительный стресс: патологические состояния и заболевания. - Новосибирск: АРТА, 2008. - 284 с.
  5. Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В. Редокс-регуляция клеточных функций // Биохимия. - 2007. - Т. 72, вып. 2. - С. 158-174.
  6. Рязанцева Н.В., Жаворонок Т.В., Степовая Е.А. и др. Окислительный стресс в модуляции апоптоза нейтрофилов в патогенезе острых воспалительных заболеваний // Бюлл. СО РАМН. - 2010. - Т. 30, №5. - С. 58-63.
  7. Рязанцева Н.В., Новицкий В.В., Кайгородова Е.В. и др. Митоген-активированные протеинкиназы JNK и р38 являются редокс-зависимыми молекулярными мишенями нарушения апоптоза при окислительном стрессе // Успехи физиол. наук. - 2009. - Т. 40, №2. - С. 3-11.
  8. Чиссова В.И., Старинский В.В., Петрова Г.В. Злокачественные новообразования в России в 2011 г. (заболеваемость и смертность). - Москва: МНИОИ им. П.А. Герцена, 2013. - 289 с.
  9. Aslan M., Canatan D. Modulation of redox pathways in neutrophils from sickle cell disease patients // Exp. Hematol. - 2008. - Vol. 36,N 11. - Р. 1535-1544.
  10. Bignold L.P., Ferrante A. Mechanism of separation of polymorphonuclear leukocytes from whole blood by the one-step Hypaque-Ficoll method // J. Immunol. Methods. - 1987. - Vol. 96,N 1. - P. 29-33.
  11. Cui J., Wang Q., Wang J. et al. Basal c-Jun NH2-terminal protein kinase activity is essential for survival and proliferation of T-cell acute lymphoblastic leukemia cells // Mol. Cancer Ther. - 2009. - Vol. 8, N 12. - Р. 3214-3222.
  12. Gibot L., Follet J., Metges J.P. et al. Human caspase 7 is positively controlled by SREBP-1 and SREBP-2 // Biochem. J. - 2009. - Vol. 27,N 3. - P. 473-483.
  13. Negroni L., Samson M., Guigonis J.M. et al. Treatment of colon cancer cells using the cytosine deaminase/5-fluorocytosine suicide system induces apoptosis, modulation of the proteome, and Hsp90beta phosphorylation // Mol. Cancer Ther. - 2007. - Vol. 10. - P. 2747-2756.
  14. Ulmer A.J., Flad H.D. Discontinuous density gradient separation of human mononuclear leukocytes using Percoll as gradient medium // J. Immunol. Methods. - 1979. - Vol. 30,N 1. - P. 1-10.
  15. Valko M., Rhodes C.J., Moncol J. et al. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stressinduced cancer // Chem. Biol. Interact. - 2006. - Vol. 160. - P. 1-40.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

© 2013 Ryazantseva N.V., Stepovaya E.A., Konovalova E.V., Nosareva O.L., Naumova A.I., Orlov D.S., Vesnina O.N., Novitsky V.V.

Creative Commons License

This work is licensed
under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.