Mitochondrial oxidation in the internal organs of rats with cranial injury and diabetes mellitus

Full Text

Энергетический обмен, согласно современ-Цель исследования - изучение взаимосвяным представлениям, является совокупностью зи между интенсивностью реакций липопереакций окисления, протекающих во всех роксидации, окислительной модификации живых клетках. Его основная функция - обе-белков и состоянием энергетических процесспечение организма энергией в доступной для сов в митохондриях сердца и лёгких животиспользования форме (аденозинтрифосфат - ных с ЧМТ, СД и сочетанием этих видов паАТФ). Известно, что основной причиной, ве-тологии. дущей к наиболее выраженным нарушениям Эксперименты проводили на 100 белых процессов энергообеспечения, бывает гипок-нелинейных крысах-самцах с массой тела 180- сия, представляющая собой несоответствие 220 г, поделённых на следующие эксперименэнергопотребности клетки энергопродукции тальные группы: первая (n=10) - интактные в системе митохондриального окислительного животные (контроль), вторая (n=40) - крысы, фосфорилирования [7, 11] и являющаяся од-которым моделировали ЧМТ, третья (n=10) - ним из основных факторов патогенеза острого крысы с экспериментальным СД, четвёртая периода черепно-мозговой травмы (ЧМТ) [4, (n=40) - животные, которым моделировали 5]. При гипоксии снижается поступление кис-ЧМТ на фоне СД. Внутри второй и четвёртой лорода в клетку и митохондрии, развивается групп были выделены подгруппы по 10 животнарушение митохондриального окисления, ных, которых выводили из эксперимента через что приводит к разобщению сопряжённого с 3 и 24 ч, 5 и 14 сут [5]. Животных содержали ним фосфорилирования и вызывает прогрес-в стандартных условиях вивария в соответсирующий дефицит АТФ [7, 10]. Вместе с тем ствии с санитарно-гигиеническими нормами недостаток кислорода стимулирует свободно-и требованиями надлежащей лабораторной радикальное окисление белков и липидов, а практики [15]. Все этапы экспериментов выактивация свободнорадикальных процессов, полнены, согласно международным требоваповреждая мембраны митохондрий и лизо-ниям о гуманном обращении с животными сом, усугубляет энергодефицит, что в итоге в соответствии с Европейской конвенцией по может вызвать необратимые повреждения и защите позвоночных животных, которых исгибель клеток органов и систем. пользуют в экспериментальных и других на Нарушение процессов перекисного окис-учных целях (Страсбург, 1986). ления происходит при развитии патологи-Экспериментальный СД моделировали ческих состояний в организме и становится однократным введением раствора стрептозоодним из факторов, определяющих развитие тоцина («Sigma», США) в брюшную полость в сахарного диабета (СД) [6]. дозе 60 мг/кг [13]. Стрептозотоцин растворяли непосредственно перед введением в цитратном буфере. Животных брали в эксперимент с уровнем глюкозы более 14 ммоль/л. Закрытую ЧМТ моделировали с помощью разработанной нами методики [14] на 30-е сутки после введения стрептозотоцина. Животных выводили из эксперимента в условиях наркоза (тиопентал натрия, 40 мг/кг) путём тотального кровопускания из сердца. Состояние энергообеспечения в сердце и лёгких оценивали по активности маркёрных ферментов митохондрий - сукцинатдегидрогеназы [9], цитохромоксидазы [8] и протонной АТФазы [3]. Митохондрии сердца и лёгких выделяли методом дифференциального центрифугирования 10% гомогената, приготовленного в среде из 250 мМ сахарозы, 10 мМ трис-НСl буфера и 10 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (рН=7,4) [12]. Митохондриальную фракцию получали, центрифугируя безъядерный супернатант в течение 10 мин при 6500 g. Полученный осадок митохондрий ресуспендировали в изотоническом растворе. В гомогенате ткани сердца и лёгких также определяли показатели содержания адениловых нуклеотидов - АТФ, аденозиндифосфата (АДФ) и аденозинмонофосфата (АМФ) - с помощью стандартных тестов фирмы «Boehringer Mannheim» (Германия). Интенсивность свободнорадикального окисления белков в сердце и лёгких оценивали по содержанию альдегидо-и кетонопроизводных нейтрального (ОМБ370) и основного (ОМБ430) характера по методу А.И. Арчакова и И.М. Михосоева [2]. Интенсивность перекисного окисления липидов оценивали по содержанию в сердце и лёгких продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [1]. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты исследования активности сукцинатдегидрогеназы, цитохромоксидазы и протонной АТФазы - ферментов, являющихся катализаторами цикла трикарбоновых кислот, - представлены в табл. 1. Полученные данные указывают на снижение активности сукцинатдегидрогеназы в сердце на 27,0, 31,2, 22,8 и 17,2% соответственно через 3 и 24 ч, 5 и 14 сут после ЧМТ. В лёгких активность дан Таблица 1 Активность сукцинатдегидрогеназы, цитохромоксидазы и протонной АТФазы в сердце и лёгких животных с черепно-мозговой травмой, сахарным диабетом и их сочетанием (M±m, n=10) Показатель Контроль СД Группа Время после травмы 3 ч 24 ч 5 сут 14 сут СЕРДЦЕ СДГ, нМ сукцината /1 мг белка в минуту 11,35± 0,96 8,52± 0,67* ЧМТ 8,27± 0,67* 7,81± 0,56* 8,76± 0,75* 9,40± 0,78* ЧМТ+СД 6,18± 0,52^# 4,46± 0,39^# 5,70± 0,48^# 6,75± 0,50^# ЦО, нМ диметил-пфенилендиамина/ 1 мг белка в минуту 9,92± 0,83 7,56± 0,70* ЧМТ 7,58± 0,67* 7,05± 0,53* 7,67± 0,60* 9,04± 0,28 ЧМТ+СД 5,42± 0,41^# 4,86± 0,47^# 5,19± 0,39^# 5,80± 0,45^# АТФаза, мкМ Р /1 мг белка в минуту 0,35± 0,03 0,49± 0,05* ЧМТ 0,48± 0,05* 0,56± 0,06* 0,46± 0,04* 0,39± 0,03 ЧМТ+СД 0,73± 0,08^# 0,88± 0,09^# 0,81± 0,07^# 0,66± 0,05^# ЛЁГКИЕ СДГ, нМ сукцината 1 мг белка в минуту 6,80± 0,41 5,44± 0,45* ЧМТ 5,14± 0,36* 4,98± 0,43* 5,73± 0,30* 6,11± 0,49 ЧМТ+СД 4,21± 0,30^# 3,02± 0,27^# 3,58± 0,29^# 4,16± 0,41^# ЦО, нМ диметил-пфенилендиамина / 1 мг белка в минуту 6,37± 0,51 4,78± 0,47* ЧМТ 4,92± 0,43* 4,61± 0,39* 5,06± 0,30* 6,22± 0,60 ЧМТ+СД 3,55± 0,32^# 3,16± 0,29^# 3,38± 0,27^# 3,77± 0,31# АТФаза, мкМ Р 0,12± 0,15± ЧМТ 0,16± 0,01* 0,18± 0,02* 0,15± 0,02 0,13± 0,01 1 мг белка в минуту 0,01 0,01* ЧМТ+СД 0,21± 0,02^# 0,26± 0,03^# 0,23± 0,02^# 0,19± 0,02# Примечание: статистическая значимость изменений (p <0,05-0,001) относительно показателей у животных: *контрольной группы; #с черепно-мозговой травмой (ЧМТ); ^с сахарным диабетом (СД); СДГ - сукцинатдегидрогеназа; ЦО - цитохромоксидаза. Рис. 1. Динамика содержания аденозинтрифосфата в сердце и лёгких животных с черепно-мозговой травмой (ЧМТ), сахарным диабетом (СД) и их сочетанием; статистическая значимость изменений (p <0,05-0,001) относительно показателей у животных: *контрольной группы; #с черепно-мозговой травмой; ^с сахарным диабетом. Рис. 2. Динамика содержания аденозиндифосфата в сердце и лёгких животных с черепно-мозговой травмой (ЧМТ), сахарным диабетом (СД) и их сочетанием; статистическая значимость изменений (p <0,05-0,001) относительно показателей у животных: *контрольной группы; #с черепно-мозговой травмой; ^с сахарным диабетом. ного фермента снижалась только в первые три срока исследования (на 24,4, 26,8 и 15,7%) и приближалась к уровню контроля через 14 дней после травмы. У травмированных животных активность цитохромоксидазы снижалась и в сердце, и в лёгких, достигая наименьших значений на 1-е сутки эксперимента - на 29 и 27,6% соответственно по сравнению с контролем. Активность протонной АТФазы у крыс после ЧМТ достоверно возрастала в сердце на 37, 60 и 31,4% через 3, 24 ч и 5 сут после травмы, а в лёгких - только в два первых срока исследования (на 33,3 и 50%). При изучении содержания адениловых нуклеотидов установлено, что у животных после травмы содержание АТФ (рис. 1) снижалось достоверно в ранние сроки эксперимента (на 21,3 и 37,5% в сердце и на 20,2 и 31,2% в лёгких через 3 и 24 ч после травмы). Содержание АДФ у крыс с ЧМТ было увеличено в сердце на 30,5, 40 и 25,3% в первые три срока наблюдения, а в лёгких - только через 3 и 24 ч после травмы (на 25 и 37,5%) (рис. 2). Концентрация АМФ (рис. 3) была максимальной через 24 ч после ЧМТ (на 43% в сердце и на 38% в лёгких). При оценке интенсивности окислительной модификации белков у крыс с ЧМТ было установлено, что в сердце концентрация производных нейтрального характера превышала результаты контроля на 70,2, 89,5 и 79%, в лёгких - на 57, 68,6 и 53% через 3, 24 ч и 5 сут после травмы (рис. 4). Показатели ОМБ430 превышали соответствующие показатели у интактных животных на 74,4, 97,7 и 83,7% в сердце и на 61, 86 и 72,2 % в лёгких. Исследование состояния перекисного окисления липидов в указанных органах (рис. 5) показало, что содержание ТБК-активных продуктов в ткани сердца после травмы превышало контрольные показатели на 53,2, 75 и 64,4% через 3, 24 ч и 5 сут эксперимента соответственно. В эти же сроки исследования повышался уровень ТБК-активных продуктов и в лёгких (на 36,4, 48,7 и 44,6%). Нами изучено влияние введения стрептозотоцина на ферменты, которые прини ворачивалась и в лёгких. Отмечено снижение активности цитохромоксидазы у крыс с травмой и СД относительно травмированных животных без СД (на 25,8, 31, 32,3 и 35,8% в сердце и на 27,8, 31,5, 33,2 и 39,4% в лёгких через 3 и 24 ч, 5 и 14 сут после травмы). Моделирование ЧМТ на фоне СД сопровождалось повышением активности протонной АТФазы по сравнению с аналогичным показателем у травмированных нормогликемических животных на 52, 57, 76 и 69,2% в сердце и на 31,3, 44,4, 53,3 и 46,2% в лёгких в исследуемые периоды. Угнетение функциональных возможностей митохондрий у животных четвёртой экспериментальной группы проявлялось достоверными изменениями содержания адениловых нуклеотидов (см. рис. 1-3). Концентрация АТФ в сердце по сравнению с животными без СД упала на 33, 34, 38,4 и 40,3% через 3, 24 ч, 5 и 14 сут после ЧМТ, в лёгких соответственно на 22,8, 27, 32 и 40,6%. Уровень АДФ и АМФ в сердце и лёгких крыс с комбинацией патологий увеличивался достоверно во все сроки исследования по сравнению с аналогичными показателями у животных второй группы. Моделирование ЧМТ на фоне СД характеризовалось большей интенсивностью свободнорадикальных процессов (см. рис. 4 и 5). Содержание ОМБ370 в сердце животных четвёртой группы возросло на 100, 106,5, 122,5 и 186,2%, а ОМБ430 - на 125,3, 134, 157 и 244% по сравнению с животными второй группы в соответствии со сроками исследования. В лёгких крыс с сочетанной патологией интенсивность процессов окислительной модификации белков также была достоверно выше по сравнению с таковой у крыс с изолированной ЧМТ во все сроки эксперимента. Уровень ТБК-активных продуктов в сердце животных с ЧМТ и СД был увеличен по сравнению с аналогичным показателем травмированных крыс без соматической патологии на 206, 212,7, 229,4 и 319%, а в лёгких - на 68,4, 100, 107,6 и 138% через 3 и 24 ч, 5 и 14 сут посттравматического периода соответственно. Таким образом, ЧМТ, СД и их сочетание сопровождаются активацией процессов липидной пероксидации и пероксидного окисления белков в сердце и лёгких, изменениями активности ферментов дыхательной цепи и расстройствами синтеза макроэргов. Под влиянием травмы и СД происходит угнетение скорости окисления сукцината в дыхательной цепи вследствие нарушения функционирования сукцинатдегидрогеназы, а установленное нами снижение активности цитохромоксидазы оказывает отрицательное влияние на электронный транспорт в терминальной области дыхательной цепи. Зафиксированное нами значительное повышение активности Н+-АТФазы в митохондриях сердца и лёгких поражённых крыс, очевидно, является следствием уменьшения активности дегидрирования субстратов, снижения скорости транспорта электронов между отдельными дыхательными переносчиками, что приводит к нарушению генерации трансмембранного потенциала ионов водорода. Снижение мембранного потенциала на внутренней мембране митохондрий также может быть обусловлено активацией оксидативных процессов в клетках сердца и лёгких под влиянием травмы в сочетании с гипергликемией, что приводит к повреждению фосфолипидной матрицы и снижению гидрофобности липидной фазы [11]. Проведённые нами исследования показали, что в сердце и лёгких животных с ЧМТ, СД и, особенно, с ЧМТ на фоне СД на первый план выступает достоверное снижение тканевых резервов АТФ при повышении уровня АДФ и АМФ. Очевидно, что вследствие усиленного распада АТФ в АТФазной реакции происходит частичное повышение пула АДФ и АМФ в исследуемых органах. Исходя из вышеизложенного, следует отметить, что моделирование ЧМТ на фоне СД снижает мощность системы окислительного фосфорилирования митохондрий клеток сердца и лёгких, что недостаточно для компенсации затраты АТФ в работе АТФ-потребляющих систем. Известно, что активация реакций липопероксидации под влиянием ЧМТ приводит к образованию детергентных лизоформ фосфолипидов в микроокружении, локализованных во внутренней мембране митохондрий ферментных комплексов, обусловливает потерю последними их каталитической функции. С другой стороны, дефицит инсулина наряду с активацией переокисления белков и липидов вызывает также торможение процессов синтеза фосфолипидов, что ведёт к изменению жёсткости мембран митохондрий и набуханию последних. Набухание митохондрий связано с модификацией фосфолипидного состава мембран и в конечном итоге приводит к нарушению основной функции органелл - синтеза АТФ. В свете этого установленная нами активация процессов перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков в условиях ЧМТ и СД может быть фактором, способствующим угнетению окислительного фосфорилирования и уменьшению количества АТФ в исследуемых органах. ВЫВОДЫ 1. В сердце и лёгких экспериментальных животных с черепно-мозговой травмой происходят существенные нарушения функционирования ферментов цепи тканевого дыхания и, как следствие, снижение концентрации аденозинтрифосфата. Степень нарушения митохондриального окисления и процессов синтеза аденозинтрифосфата коррелирует с интенсивностью оксидативного стресса в органах. 2. При черепно-мозговой травме на фоне сопутствующего сахарного диабета показатели интенсивности пероксидного окисления липидов и белков, энергообеспечивающего окисления в митохондриях и содержания макроэргов достоверно ухудшаются по сравнению с таковыми у нормогликемических травмированных животных.

About the authors

V M Meretskyy

Ternopil State Medical University, Ternopil, Ukraine

Email: v27m@ukr.net

References

Supplementary files