Mitochondrial oxidation in the internal organs of rats with cranial injury and diabetes mellitus

Cover Page

Abstract

Aim. To study the relation between the processes of mitochondrial oxidation and the intensity of lipid peroxidation, pulmonary and cardiac proteins oxidative modification at cranial injury, diabetes mellitus and at both. Methods. Experiments were carried out on 100 male white rats distributed to the following groups: the first group (n=10) - control group consisted of 10 intact animals, the second group (n=40) - rats with simulated cranial injury, the third group (n=10) - rats with experimental diabetes mellitus, the fourth group (n=40) - rats with simulated cranial injury and experimental diabetes mellitus. Experimental diabetes was induced by a single intraperitoneal injection of streptozotocin solution. Animals were withdrawn from the experiment at 3, 24 hours, 5 and 14 days after the cranial injury. Cardiac and pulmonary energy supply was estimated by the activity of succinate dehydrogenase, cytochrome oxidase and hydrogen potassium ATPase, as well as by the level of adenine nucleotides. Intensity of free-radical protein and lipid peroxidation was assessed by measuring the levels of neutral and base aldehyde and ketone derivatives and active products reacting with thiobarbituric acid. Results. Decrease of succinate dehydrogenase, cytochrome oxidase activity, a significant increase of hydrogen potassium ATPase activity in heart and lungs mitochondria was observed in rats with cranial injury, diabetes mellitus and especially with both conditions. Adenosine triphosphate tissue reserves have significantly decreased, while adenosine diphosphate and monophosphate levels increased, lipid peroxidation and protein oxidation processes activated. Conclusion. In rats with cranial injury associated with diabetes mellitus, lipid and protein peroxidation intensity parameters, the intensity of oxidative stress and the levels of macroergic substanses were significantly worse compared to the same parameters in the injured animals with normal blood glucose level.

Full Text

Энергетический обмен, согласно современ-Цель исследования - изучение взаимосвяным представлениям, является совокупностью зи между интенсивностью реакций липопереакций окисления, протекающих во всех роксидации, окислительной модификации живых клетках. Его основная функция - обе-белков и состоянием энергетических процесспечение организма энергией в доступной для сов в митохондриях сердца и лёгких животиспользования форме (аденозинтрифосфат - ных с ЧМТ, СД и сочетанием этих видов паАТФ). Известно, что основной причиной, ве-тологии. дущей к наиболее выраженным нарушениям Эксперименты проводили на 100 белых процессов энергообеспечения, бывает гипок-нелинейных крысах-самцах с массой тела 180- сия, представляющая собой несоответствие 220 г, поделённых на следующие эксперименэнергопотребности клетки энергопродукции тальные группы: первая (n=10) - интактные в системе митохондриального окислительного животные (контроль), вторая (n=40) - крысы, фосфорилирования [7, 11] и являющаяся од-которым моделировали ЧМТ, третья (n=10) - ним из основных факторов патогенеза острого крысы с экспериментальным СД, четвёртая периода черепно-мозговой травмы (ЧМТ) [4, (n=40) - животные, которым моделировали 5]. При гипоксии снижается поступление кис-ЧМТ на фоне СД. Внутри второй и четвёртой лорода в клетку и митохондрии, развивается групп были выделены подгруппы по 10 животнарушение митохондриального окисления, ных, которых выводили из эксперимента через что приводит к разобщению сопряжённого с 3 и 24 ч, 5 и 14 сут [5]. Животных содержали ним фосфорилирования и вызывает прогрес-в стандартных условиях вивария в соответсирующий дефицит АТФ [7, 10]. Вместе с тем ствии с санитарно-гигиеническими нормами недостаток кислорода стимулирует свободно-и требованиями надлежащей лабораторной радикальное окисление белков и липидов, а практики [15]. Все этапы экспериментов выактивация свободнорадикальных процессов, полнены, согласно международным требоваповреждая мембраны митохондрий и лизо-ниям о гуманном обращении с животными сом, усугубляет энергодефицит, что в итоге в соответствии с Европейской конвенцией по может вызвать необратимые повреждения и защите позвоночных животных, которых исгибель клеток органов и систем. пользуют в экспериментальных и других на Нарушение процессов перекисного окис-учных целях (Страсбург, 1986). ления происходит при развитии патологи-Экспериментальный СД моделировали ческих состояний в организме и становится однократным введением раствора стрептозоодним из факторов, определяющих развитие тоцина («Sigma», США) в брюшную полость в сахарного диабета (СД) [6]. дозе 60 мг/кг [13]. Стрептозотоцин растворяли непосредственно перед введением в цитратном буфере. Животных брали в эксперимент с уровнем глюкозы более 14 ммоль/л. Закрытую ЧМТ моделировали с помощью разработанной нами методики [14] на 30-е сутки после введения стрептозотоцина. Животных выводили из эксперимента в условиях наркоза (тиопентал натрия, 40 мг/кг) путём тотального кровопускания из сердца. Состояние энергообеспечения в сердце и лёгких оценивали по активности маркёрных ферментов митохондрий - сукцинатдегидрогеназы [9], цитохромоксидазы [8] и протонной АТФазы [3]. Митохондрии сердца и лёгких выделяли методом дифференциального центрифугирования 10% гомогената, приготовленного в среде из 250 мМ сахарозы, 10 мМ трис-НСl буфера и 10 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (рН=7,4) [12]. Митохондриальную фракцию получали, центрифугируя безъядерный супернатант в течение 10 мин при 6500 g. Полученный осадок митохондрий ресуспендировали в изотоническом растворе. В гомогенате ткани сердца и лёгких также определяли показатели содержания адениловых нуклеотидов - АТФ, аденозиндифосфата (АДФ) и аденозинмонофосфата (АМФ) - с помощью стандартных тестов фирмы «Boehringer Mannheim» (Германия). Интенсивность свободнорадикального окисления белков в сердце и лёгких оценивали по содержанию альдегидо-и кетонопроизводных нейтрального (ОМБ370) и основного (ОМБ430) характера по методу А.И. Арчакова и И.М. Михосоева [2]. Интенсивность перекисного окисления липидов оценивали по содержанию в сердце и лёгких продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [1]. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты исследования активности сукцинатдегидрогеназы, цитохромоксидазы и протонной АТФазы - ферментов, являющихся катализаторами цикла трикарбоновых кислот, - представлены в табл. 1. Полученные данные указывают на снижение активности сукцинатдегидрогеназы в сердце на 27,0, 31,2, 22,8 и 17,2% соответственно через 3 и 24 ч, 5 и 14 сут после ЧМТ. В лёгких активность дан Таблица 1 Активность сукцинатдегидрогеназы, цитохромоксидазы и протонной АТФазы в сердце и лёгких животных с черепно-мозговой травмой, сахарным диабетом и их сочетанием (M±m, n=10) Показатель Контроль СД Группа Время после травмы 3 ч 24 ч 5 сут 14 сут СЕРДЦЕ СДГ, нМ сукцината /1 мг белка в минуту 11,35± 0,96 8,52± 0,67* ЧМТ 8,27± 0,67* 7,81± 0,56* 8,76± 0,75* 9,40± 0,78* ЧМТ+СД 6,18± 0,52^# 4,46± 0,39^# 5,70± 0,48^# 6,75± 0,50^# ЦО, нМ диметил-пфенилендиамина/ 1 мг белка в минуту 9,92± 0,83 7,56± 0,70* ЧМТ 7,58± 0,67* 7,05± 0,53* 7,67± 0,60* 9,04± 0,28 ЧМТ+СД 5,42± 0,41^# 4,86± 0,47^# 5,19± 0,39^# 5,80± 0,45^# АТФаза, мкМ Р /1 мг белка в минуту 0,35± 0,03 0,49± 0,05* ЧМТ 0,48± 0,05* 0,56± 0,06* 0,46± 0,04* 0,39± 0,03 ЧМТ+СД 0,73± 0,08^# 0,88± 0,09^# 0,81± 0,07^# 0,66± 0,05^# ЛЁГКИЕ СДГ, нМ сукцината 1 мг белка в минуту 6,80± 0,41 5,44± 0,45* ЧМТ 5,14± 0,36* 4,98± 0,43* 5,73± 0,30* 6,11± 0,49 ЧМТ+СД 4,21± 0,30^# 3,02± 0,27^# 3,58± 0,29^# 4,16± 0,41^# ЦО, нМ диметил-пфенилендиамина / 1 мг белка в минуту 6,37± 0,51 4,78± 0,47* ЧМТ 4,92± 0,43* 4,61± 0,39* 5,06± 0,30* 6,22± 0,60 ЧМТ+СД 3,55± 0,32^# 3,16± 0,29^# 3,38± 0,27^# 3,77± 0,31# АТФаза, мкМ Р 0,12± 0,15± ЧМТ 0,16± 0,01* 0,18± 0,02* 0,15± 0,02 0,13± 0,01 1 мг белка в минуту 0,01 0,01* ЧМТ+СД 0,21± 0,02^# 0,26± 0,03^# 0,23± 0,02^# 0,19± 0,02# Примечание: статистическая значимость изменений (p <0,05-0,001) относительно показателей у животных: *контрольной группы; #с черепно-мозговой травмой (ЧМТ); ^с сахарным диабетом (СД); СДГ - сукцинатдегидрогеназа; ЦО - цитохромоксидаза. Рис. 1. Динамика содержания аденозинтрифосфата в сердце и лёгких животных с черепно-мозговой травмой (ЧМТ), сахарным диабетом (СД) и их сочетанием; статистическая значимость изменений (p <0,05-0,001) относительно показателей у животных: *контрольной группы; #с черепно-мозговой травмой; ^с сахарным диабетом. Рис. 2. Динамика содержания аденозиндифосфата в сердце и лёгких животных с черепно-мозговой травмой (ЧМТ), сахарным диабетом (СД) и их сочетанием; статистическая значимость изменений (p <0,05-0,001) относительно показателей у животных: *контрольной группы; #с черепно-мозговой травмой; ^с сахарным диабетом. ного фермента снижалась только в первые три срока исследования (на 24,4, 26,8 и 15,7%) и приближалась к уровню контроля через 14 дней после травмы. У травмированных животных активность цитохромоксидазы снижалась и в сердце, и в лёгких, достигая наименьших значений на 1-е сутки эксперимента - на 29 и 27,6% соответственно по сравнению с контролем. Активность протонной АТФазы у крыс после ЧМТ достоверно возрастала в сердце на 37, 60 и 31,4% через 3, 24 ч и 5 сут после травмы, а в лёгких - только в два первых срока исследования (на 33,3 и 50%). При изучении содержания адениловых нуклеотидов установлено, что у животных после травмы содержание АТФ (рис. 1) снижалось достоверно в ранние сроки эксперимента (на 21,3 и 37,5% в сердце и на 20,2 и 31,2% в лёгких через 3 и 24 ч после травмы). Содержание АДФ у крыс с ЧМТ было увеличено в сердце на 30,5, 40 и 25,3% в первые три срока наблюдения, а в лёгких - только через 3 и 24 ч после травмы (на 25 и 37,5%) (рис. 2). Концентрация АМФ (рис. 3) была максимальной через 24 ч после ЧМТ (на 43% в сердце и на 38% в лёгких). При оценке интенсивности окислительной модификации белков у крыс с ЧМТ было установлено, что в сердце концентрация производных нейтрального характера превышала результаты контроля на 70,2, 89,5 и 79%, в лёгких - на 57, 68,6 и 53% через 3, 24 ч и 5 сут после травмы (рис. 4). Показатели ОМБ430 превышали соответствующие показатели у интактных животных на 74,4, 97,7 и 83,7% в сердце и на 61, 86 и 72,2 % в лёгких. Исследование состояния перекисного окисления липидов в указанных органах (рис. 5) показало, что содержание ТБК-активных продуктов в ткани сердца после травмы превышало контрольные показатели на 53,2, 75 и 64,4% через 3, 24 ч и 5 сут эксперимента соответственно. В эти же сроки исследования повышался уровень ТБК-активных продуктов и в лёгких (на 36,4, 48,7 и 44,6%). Нами изучено влияние введения стрептозотоцина на ферменты, которые прини ворачивалась и в лёгких. Отмечено снижение активности цитохромоксидазы у крыс с травмой и СД относительно травмированных животных без СД (на 25,8, 31, 32,3 и 35,8% в сердце и на 27,8, 31,5, 33,2 и 39,4% в лёгких через 3 и 24 ч, 5 и 14 сут после травмы). Моделирование ЧМТ на фоне СД сопровождалось повышением активности протонной АТФазы по сравнению с аналогичным показателем у травмированных нормогликемических животных на 52, 57, 76 и 69,2% в сердце и на 31,3, 44,4, 53,3 и 46,2% в лёгких в исследуемые периоды. Угнетение функциональных возможностей митохондрий у животных четвёртой экспериментальной группы проявлялось достоверными изменениями содержания адениловых нуклеотидов (см. рис. 1-3). Концентрация АТФ в сердце по сравнению с животными без СД упала на 33, 34, 38,4 и 40,3% через 3, 24 ч, 5 и 14 сут после ЧМТ, в лёгких соответственно на 22,8, 27, 32 и 40,6%. Уровень АДФ и АМФ в сердце и лёгких крыс с комбинацией патологий увеличивался достоверно во все сроки исследования по сравнению с аналогичными показателями у животных второй группы. Моделирование ЧМТ на фоне СД характеризовалось большей интенсивностью свободнорадикальных процессов (см. рис. 4 и 5). Содержание ОМБ370 в сердце животных четвёртой группы возросло на 100, 106,5, 122,5 и 186,2%, а ОМБ430 - на 125,3, 134, 157 и 244% по сравнению с животными второй группы в соответствии со сроками исследования. В лёгких крыс с сочетанной патологией интенсивность процессов окислительной модификации белков также была достоверно выше по сравнению с таковой у крыс с изолированной ЧМТ во все сроки эксперимента. Уровень ТБК-активных продуктов в сердце животных с ЧМТ и СД был увеличен по сравнению с аналогичным показателем травмированных крыс без соматической патологии на 206, 212,7, 229,4 и 319%, а в лёгких - на 68,4, 100, 107,6 и 138% через 3 и 24 ч, 5 и 14 сут посттравматического периода соответственно. Таким образом, ЧМТ, СД и их сочетание сопровождаются активацией процессов липидной пероксидации и пероксидного окисления белков в сердце и лёгких, изменениями активности ферментов дыхательной цепи и расстройствами синтеза макроэргов. Под влиянием травмы и СД происходит угнетение скорости окисления сукцината в дыхательной цепи вследствие нарушения функционирования сукцинатдегидрогеназы, а установленное нами снижение активности цитохромоксидазы оказывает отрицательное влияние на электронный транспорт в терминальной области дыхательной цепи. Зафиксированное нами значительное повышение активности Н+-АТФазы в митохондриях сердца и лёгких поражённых крыс, очевидно, является следствием уменьшения активности дегидрирования субстратов, снижения скорости транспорта электронов между отдельными дыхательными переносчиками, что приводит к нарушению генерации трансмембранного потенциала ионов водорода. Снижение мембранного потенциала на внутренней мембране митохондрий также может быть обусловлено активацией оксидативных процессов в клетках сердца и лёгких под влиянием травмы в сочетании с гипергликемией, что приводит к повреждению фосфолипидной матрицы и снижению гидрофобности липидной фазы [11]. Проведённые нами исследования показали, что в сердце и лёгких животных с ЧМТ, СД и, особенно, с ЧМТ на фоне СД на первый план выступает достоверное снижение тканевых резервов АТФ при повышении уровня АДФ и АМФ. Очевидно, что вследствие усиленного распада АТФ в АТФазной реакции происходит частичное повышение пула АДФ и АМФ в исследуемых органах. Исходя из вышеизложенного, следует отметить, что моделирование ЧМТ на фоне СД снижает мощность системы окислительного фосфорилирования митохондрий клеток сердца и лёгких, что недостаточно для компенсации затраты АТФ в работе АТФ-потребляющих систем. Известно, что активация реакций липопероксидации под влиянием ЧМТ приводит к образованию детергентных лизоформ фосфолипидов в микроокружении, локализованных во внутренней мембране митохондрий ферментных комплексов, обусловливает потерю последними их каталитической функции. С другой стороны, дефицит инсулина наряду с активацией переокисления белков и липидов вызывает также торможение процессов синтеза фосфолипидов, что ведёт к изменению жёсткости мембран митохондрий и набуханию последних. Набухание митохондрий связано с модификацией фосфолипидного состава мембран и в конечном итоге приводит к нарушению основной функции органелл - синтеза АТФ. В свете этого установленная нами активация процессов перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков в условиях ЧМТ и СД может быть фактором, способствующим угнетению окислительного фосфорилирования и уменьшению количества АТФ в исследуемых органах. ВЫВОДЫ 1. В сердце и лёгких экспериментальных животных с черепно-мозговой травмой происходят существенные нарушения функционирования ферментов цепи тканевого дыхания и, как следствие, снижение концентрации аденозинтрифосфата. Степень нарушения митохондриального окисления и процессов синтеза аденозинтрифосфата коррелирует с интенсивностью оксидативного стресса в органах. 2. При черепно-мозговой травме на фоне сопутствующего сахарного диабета показатели интенсивности пероксидного окисления липидов и белков, энергообеспечивающего окисления в митохондриях и содержания макроэргов достоверно ухудшаются по сравнению с таковыми у нормогликемических травмированных животных.
×

About the authors

V M Meretskyy

Ternopil State Medical University, Ternopil, Ukraine

Email: v27m@ukr.net

References

  1. Андреева Л.И., Кожемякин Л.А., Кишкун А.А. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой // Лаб. дело. - 1988. - №11. - С. 41-46.
  2. Арчаков А.И., Михосоев И.М. Модификация белков активным кислородом и их распад // Биохимия. - 1998. - Т. 54, №3. - С. 179-186.
  3. Габибов М.М. Влияние гипербарической оксигенации на активность протонной АТФазы митохондрий различных тканей крыс // Укр. биохим. ж. - 1986. - Т. 58, №5. - С. 68-71.
  4. Гуманенко Е.К., Немченко Н.С., Гончаров А.В., Пашковський Э.В. Патогенетические особенности острого периода травматической болезни. Травматический шок - частное проявление острого периода // Вестн. хир. - 2004. - Т. 163, №1. - С. 52-56.
  5. Ельский В.Н., Зяблицев С.В. Моделирование черепно-мозговой травмы. - Донецк: Новый мир, 2008. - 140 с.
  6. Занозина О.В., Боровков Н.Н., Щербатюк Т.Г. Свободнорадикальное окисление при сахарном диабете 2-го типа: источники образования, составляющие, патогенетические механизмы токсичности // Соврем. технол. в мед. - 2010. - №3. - С. 104-112.
  7. Иллариошкин С.Н. Нарушения клеточной энергетики при заболеваниях нервной системы // Нервн. болезни. - 2012. - №1. - С. 34-38.
  8. Кривченкова Р.С. Определение активности цитохромоксидазы в суспензии митохондрий / Современные методы в биохимии. - М.: Медицина, 1977. - С. 47-49.
  9. Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен) / Под ред. М.И. Прохоровой. - Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1982. - 272 с.
  10. Овсепян Л.М., Казарян Г.С., Захарян Г.В. Роль активных форм кислорода в митохондриях // Мед. наука Армении НАН РА. - 2009. - №2. - С. 3-10.
  11. Оковитый С.В., Суханов Д.С., Заплутанов В.А. Антигипоксанты в современной клинической практике // Клин. мед. - 2012. - №9. - С. 63-68.
  12. Франк Г.М., Кондрашева Е.И., Мохова Е.И. Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом. - М.: Наука, 1973. - 221 с.
  13. Доклінічні дослідження лікарських засобів: методичні рекомендації / За редакцією: член-кор. АМН України О.В. Стефанова. - К.: Авіцена, 2001. - 528 с.
  14. Патент 74935 Україна, МПК G 09 В 23/28 (2006.01). Спосіб моделювання черепно-мозкової травми / Мерецький В.М.; заявник і патентовласник Тернопільський державний медичний університет імені І.Я. Горбачевського. - №u2012 06594; заявл. 30.05.2012; опубл. 12.11.2012, бюлл. №21.
  15. Рєзников О.Г. Загальні етичні принципи експериментів на тваринах // Ендокринологія. - 2003. - Т. 8, №1. - С. 142-145.

Statistics

Views

Abstract: 322

PDF (Russian): 189

Dimensions

Article Metrics

Metrics Loading ...

PlumX


© 2013 Meretskyy V.M.

Creative Commons License

This work is licensed
under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.





This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies